СТАБИЛИЗИРОВАННАЯ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ НА ОСНОВЕ РЕКОМБИНАНТНОГО НЕГЛИКОЗИЛИРОВАННОГО ИНТЕРЛЕЙКИНА ЧЕЛОВЕКА В ВОССТАНОВЛЕННОМ ВИДЕ IL-2 И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 1998 года по МПК A61K38/02 

Изобретение касается фармацевтической композиции на основе рекомбинантного, негликолизированного интерлейкина -2 (IL-2) человека в восстановленном виде, имеющей улучшенную стойкость, особенно в лиофилизованном, готовом для использования в качестве лекарственного средства, виде.

Натуральный IL-2 человека, являющийся лимфокином, способным стимулировать рост активированных T-клеток, имеет 3 цистеина, локализованных в положениях 48, 105 и 125 последовательного ряда 133-х белковых аминокислот. В натуральной молекуле цистеины 58 и 105 соединены дисульфидным мостиком, а цистеин 125 имеет свободную сульфгидрильную группу (Pobb, P,J. и др. Proc. Na tl. Acad. Scl. США (1984) 81 6486-6490).

Способы получения IL-2 человека, аллелей или производных путем технологии рекомбинантной ДНК также описаны, например, в европейском пат. N EP 091539.

Получение натурального или рекомбинантного IL-2 особой чистоты, необходимой для его использования в качестве лекарства, обычно приводит к нестабильности его биологической активности, особенно при длительном хранении в жидком виде, в замороженном состоянии или в лиофилизованном виде.

Известны и используются стабилизирующие биологическую активность IL-2 вещества, как, например, полиэтиленгликоли, восстанавливающие соединения, например, дитиотрейтол и меркаптоэтанол или сывороточный альбумин.

Так, например, в заявке на европейский пат. N EP 0251001 описывается состав из натурального, чистого IL-2 со стабилизованной биологической активностью при длительном хранении в растворе в замороженном состоянии или в лиофилизованном виде добавлением альбумина или глобулина, при надобности смешанных с другими агентами, такими как сахара-спирты моно- или полисахариды, такие как гидроксикрахмал или декстраны.

Кроме того, новый рекомбинантный, негликозилированный IL-2 человека в восстановленном виде, проявляющий биологическую активность, по крайней мере равную 0,5 • 10⁷ Ед/мг и использующие его фармацевтические композиции, описываются (под обозначением r-hIL2) в заявке на патент N EP 0353150.

Под восстановленной формой IL-2 понимают IL-2, у которого три цистеина в положениях 58, 105 и 125 содержат свободную сульфгидрильную группу и проявляют биологическую активность, сравнимую с активностью соответствующего окисленного IL-2, содержащего дисульфидный мостик в положении 58 - 105. В европейском пат. N 0353150 приводятся данные по содержанию сульфгидрильных групп, определяемому спектрофотометрией с дитиопиридином, и по биологической активности, определяемой по разрастанию линии муриновых клеток CTLL-2.

В патенте приводится пример вышеупомянутой лиофилизованной фармацевтической композиции на основе восстановленного r-hIL2, содержащей маннит и лимонную кислоту, пригодной для инъекции, а также пример жидкого препарата, особенно подходящего для непрерывного введения больному путем перфузии.

Обычно длительное хранение фармацевтических композиций, содержащих чистый белок в качестве действующей основы, и сохранение их активности - трудно совместимое требование. Такое хранение сопровождается деградацией, приводящей к утрате биологической активности протеина из-за ряда причин, например, физических изменений, таких, как образование димера или агломерата или, химических изменений, таких, как окисление или дезаминирование. Поэтому устойчивость композиции, содержащей терапевтический протеин, при хранении в течение относительно длительного периода, желательно в течение года и при надлежащей температуре, желательно близкой к +5^oC - обычно необходимое условие. Достижение такой устойчивости требует добавления стабилизирующих агентов, тип которых зависит от используемого протеина.

Требование улучшенной устойчивости фармацевтических композиций относится, в том числе, и к вышеуказанному рекомбинантному восстановленному IL-2, и, особенно, к композициям на их основе в жидком или лиофилизованно виде, предназначающимся для применения больным.

В противоположность известным композициям на основе или рекомбинантного IL-2, содержащего в положениях 58 - 105 дисульфидную связь и обычно обладающим недостаточной стабильностью биологической активности, жидкие или лиофилизованные композиции вышеуказанного восстановленного r-hIL-2, которые описываются в заявке на европейский пат. N EP 0353150, обладают при хранении хорошей стабильностью такой активности, в том числе, в отсутствии альбумина.

Однако образование димера, вышеупомянутого восстановленного r-hIL-2, наблюдается путем натрийдисульфатного электрофореза на полиакриламидном геле (НДС-ЭПАГ), в том числе, при хранении лиофилизованных соединений при различных температурах, притом без значительного проявления уменьшения биологической активности. С другой стороны, отсутствие альбумина в качестве стабилизирующего средства в композициях вышеупомянутого восстановленного r-hIL-2 дает возможность проследить за их устойчивостью при помощи спектрофотометрического анализа, например, на длине 280 нм, после образенно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ-ВЭЖХ), позволяющей выявить возможное образование примесей за счет IL-2, в зависимости от продолжительности хранения, не сопровождающееся, однако, уменьшением биологической активности.

Несмотря на то, что образование димера или примесей, обнаруженных путем ОФ-ВЭЖХ, в случае вышеупомянутого восстановленного r-hIL-2 не сопровождается уменьшением биологической активности, которая наблюдается в пробирке, данные образования могут привести к нежелательному развитию антигенных реакций у больного при длительном применении данного средства.

Целью изобретения является создание новой стабилизированной композиции рекомбинантного, негликозилированного IL-2 человека, в восстановленном виде, которая бы не содержала альбумина или любого другого поглощающего УФ вещества в интервале поглощения, а также практически не содержала бы димера IL-2 после длительного хранения, в лиофилизованном виде, пригодном для применения в качестве лекарственного средства. Под практическим отсутствием димера понимают, что его содержание при хранении составляет значение, равное или меньшее 2%.

Неожиданным образом оказалось, что при хранении композиции на основе восстановленного r-hIL2 улучшение стабильности и отсутствие вышеупомянутого димера IL-2 достигается добавлением Декстрана и однокальциевой динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (кальциевая ЭДТА) к раствору восстановленного r-hIL-2, содержащему лимонную кислоту и маннит.

Декстран - разветвленный полимер глюкозы, различные фракции которого определяют отдельные средние значения относительной молекулярной массы (отн. мол. м.) и в том числе используются в качестве заменителя кровяной плазмы в терапии человека. Кальциевая ЭДТА - хелатообразователь для фармацевтического применения.

Предметом заявки является, следовательно, фармацевтическая композиция рекомбинантного, негликозилированного IL-2 человека, в восстановленном виде, содержащая лимонную кислоту и маннит и отличающаяся тем, что она содержит Декстран и кальциевую ЭДТА.

Рекомбинантный, негликозилированный IL-2 человека в восстановленном виде согласно изобретению проявляет биологическую активность, равную как минимум 0,5 • 10⁷ ед./мг, желательно равную около 1 • 10⁷ ед./мг в соответствии с вышеуказанным количественным анализом. Улучшение устойчивости фармацевтических композиций, состоящих из вышеопределенного восстановленного IL-2, лимонной кислоты и маннита, и добавленного Декстрана и кальциевой ЭДТА наблюдается у лиофилизованных композиций, длительно хранящихся при различных температурах. Улучшение устойчивости относится к физической устойчивости и химической стойкости восстановленного r-hIL-2, которые можно проследить при помощи аналитических методов, например, путем НДС-ЭПАГ и ОФ-ВЭЖХ соответственно, условия выполнения которых приводятся ниже.

Согласно изобретению фармацевтическая композиция на основе рекомбинантного, негликозилированного IL-2 человека в восстановленном виде содержит Декстран со средней отн. мол. м. в пределах между приблизительно 40000 и 110000 и особенно Декстран со средней отн. мол. м., приблизительно равной 70000.

Используют Декстраны, находящиеся в продаже, например, Декстран 40, Декстран 70 или Декстран 110, соответствующие Фракциям Декстрана, у которых средняя отн. мол. м. - около 40000, 70000 и 110000 соответственно, а желательней Декстран 70, у которого среднее значение отн. мол. м. приближенно равно 70000.

Фармацевтическая композиция, согласно изобретению отличающаяся тем, что весовое отношение Декстран: IL-2 лежит в пределах между примерно 20 и примерно 80 и предпочтительно отношение Декстран: IL-2 приблизительно равно 40.

Массу восстановленного r-hIL2 выражают в мг протеина, измеренного обыкновенным методом ОФ-ВЭЖХ. Например, лиофилизованный препарат, содержащий 1 мг вышеуказанного восстановленного r-hIL2, стабилизируют добавлением около 20 ^oC 80 мг Декстрана а предпочтительно, около 40 мг.

Предпочтительно, фармацевтическая композиция содержит компоненты при следующем массовом отношении: IL-2: лимонная кислота : маннит : Декстран : кальциевая ЭДТА приблизительно равно 1 : 10 : 50 : 40 : 0,01. Например, лиофилизованный препарат, содержащий 1 мг вышеуказанного восстановленного - 1,2, 10 мг лимонной кислоты и 50 мг маннита. стабилизируют добавлением около 40 мг Декстрана и около 10 мкг кальциевой ЭДТА.

Предметом изобретения также является способ получения фармацевтических лиофилизованных, стабилизованных композиций на основе рекомбинантного, негликозилированного IL-2 человека в восстановленном виде, отличающийся тем, что к водному раствору IL-2, содержащего Декстран, кальциевую ЭДТА и маннит, добавляют водный раствор лимонной кислоты; полученный таким образом раствор лиофилизуют. Ниже приводится пример получения.

Пример 1. Фармацевтическая стабилизованная композиция восстановленного r-hIL2 для инъекций. К 1210 мл водного раствора, содержащего 2 мг/мл восстановленного r-hIL2 и 18,2 мг/мл лимонной кислоты, полученного, как описывается, например, в заявке на европейский пат. N EP 0353150, добавляют 990 мл водного раствора, содержащего 88 г Декстран - 70, 0,022 г кальциевого ЭДТА и 110 г маннита. Полученный раствор фильтруют через пористую мембрану с диаметром пор 0,22 мкм. После распределения в стерильных условиях 1 мг полученного таким образом гомогенного раствора во флакончики с последующей лиофилизацией флакончики-дозаторы закупоривают в азотной атмосфере, что дает возможность их хранения до использования, по крайней мере, год при температуре близкой к 4^oC. Вышеуказанные лиофилизованные препараты имеют следующий состав:
Восстановлен. IL-2 - около 1 мг
Лимонная к-та - 10 мг
Маннит - 50 мг
Декстран 70 - 40 мг
Кальц. ЭДТА - 0,01 мг
Такие препараты пригодны, например, для инъекции больному после разбавления содержимого впрыскиванием 1 мл стерильной дистиллированной воды, а также для непрерывной перфузии, например, после введения, полученного выше, раствора в перфузионный резервуар типа Виафдэкс (Viaflex) емкостью 500 мл 5%-ного глюкозного раствора для перфузии Травеноль (Travenol).

Пример 2. Стабилизация Декстраном и кальциевой ЭДТА восстановленного r-hIL2.

1. Аналитические методы.

а) Анализ путем ОФ-ВЭЖХ. Возможное образование примесей при хранении соединений восстановленного r-hIL2, также дозировка восстановленного IL-2, выражаемая в мг протеина, определяются аналитической ОФ-ВЭЖХ на колонке С4 ВИДАК (0,46 • 25 см) 300 Аб 5 мкм, пропускной способностью в 1 мл/мин, линейным градиентом ацетонитрила, изменяющемся от 0 до 30 % в течение 5 мин, затем от 30% до 73% в течение 20 мин, содержащей 0,1% трифторуксусной кислоты путем спектрофотометрического анализа на длине 180 или 220 нм.

б) НДС-ЭПАГ. Возможное образование димера IL-2 определяется путем электрофореза на 20%-ном акриламидном геле. Образец предварительно согревают при температуре 100^oC в течение 2 мин в денатурирующем буферном растворе, содержащем 3 % НДС и 5 % меркаптоэтанола. Миграцию проводят в буферном растворе, содержащем 0,55 % НДС, с последующим окрашиванием серебросодержащим красителем. Кажущаяся отн. мол. м. восстановленного r-hIL2 оказывается равной около 15,5 • 10⁴, а кажущаяся отн. мол. м. димера - около 31 • 10⁴.

в) Биологическая активность. Биологическую активность определяют путем измерения израстания поколений лекозных клеток мышей рода СТ-2 путем колориметрического анализа при помощи тетразолия (Mossmann T. и др., J. Jmmunol, Meth (1983) 6555-63).

2. Химическая стабилизация восстановленного Декстраном и кальциевой ЭДТА r-hIL2. Химическая стабилизация r-hIL2 различными Декстранами в смеси с кальциевой ЭДТА исследуется при температуре 37^oC, позволяющей ускорить возможные химические изменения протеина и провести такое исследование в относительно краткие сроки. Исследование проводят с исходным раствором восстановленного r-hJL2, содержащего лимонную кислоту, к которой добавляют в азотной атмосфере раствор, содержащий кальциевую ЭДТА, маннит и один из подлежащих исследованию Декстранов соответственно. Полученный раствор лиофилизуют после распределения по 1 мл во флаконы-дозаторы, которые затем выдерживают различное время в течение месяца при 37^oC. Контрольные флакончики, не содержащие ни Декстрана, ни кальциевой ЭДТА, одновременно выдерживают при 37^oC. Содержимое каждого флакончика извлекают 1 мл дистиллированной воды и анализуют путем ОФ-ВЭЖХ. Флакончики-дозаторы, испытанные на стабильность при 37^oC, имели следующий состав:
Восстановлен. IL-2 - 0,55 мг
Лимонная к-та - 5 мг
Маннит - 50 мг
Декстран - 40 мг
Кальц. ЭДТА - 0,01 мг
Были испытаны Декстраны Т 40, Т 70 и Т 110 соответственно, выпускаемые в продажу фирмой Фармасия (Франция). Были получены следующие результаты (см. табл. 1).

Для 40 мг дозы Декстрана, т.е. при массовом отношении IL-2 : Декстран, равном около 80, различные значения средней отн.мол. м. изучаемых Декстранов, имеют сходное значительное действие на химическую стойкость, восстановленного при 37^oC r-hIL2, в то время как в отсутствии Декстрана и кальциевой ЭДТА количество образующихся примесей делают невозможным расшифрование (н.р. ) результатов ОФ-ВЭЖХ даже при 8-и суточном периоде хранения. Влияние концентрации Декстрана 70 было проверено при 10 и 20 мг дозах соответственно, относительно к 40 мг дозе, как указывалось выше. Были получены следующие результаты (см. табл. 2).

Наблюдается заметное влияние Декстрана при самой небольшой дозе, соответствующей весовому отношению IL-2 : Декстран, равному около 1 : 20, на химическую стойкость восстановленного r-hIL2.

3. Физическая стабилизация восстановленного Декстраном и кальциевой ЭДТА r-hIL2. Физическая стабилизация восстановленого Декстраном, смешанным с кальциевой ЭДТА, r-hIL2 изучалась при длительном хранении продолжительностью от 1 мес до 1 года при различных температурах: -20^oC, +2/+8^oC, при комнатной температуре (около 20^o ± 5^oC) и 37^oC. Исследования проводились на описанной в примере 1 композиции. Контрольные флакончики без Декстрана и кальциевой ЭДТА одновременно помещают в одни и те же условия хранения. Содержимое каждого флакончика извлекают 1 мл денатурирующего, вышеупомянутого буферного раствора и анализируют путем НДС-ЭПАГ. Был определен процентный состав димера. Также определили биологическую активность во флакончиках, имеющих тот же состав Декстрана и кальциевой ЭДТА и хранящихся в тех же условиях температуры. Были получены следующие результаты (см. табл. 3).

Характерен тот факт, что Декстран/ЭДТА препятствует образованию димера при любых температурах исследования, в том числе, при комнатной температуре и при 37^oC, при которых контрольный состав без Декстрана и без ЭДТА показывает значительное образование димера.

Подтверждается тот факт, что физическая устойчивость, полученная при помощи Декстран/ЭДТА, позволяет также сохранить стабильной биологическую активность восстановленного IL-2 при любых температурах хранения.

Достигаемая по способу изобретения стабильность обеспечивает длительное хранение препаратов восстановленного r-hIL2, содержащего Декстран и кальциевую ЭДТА согласно требованиям его использования в качестве лекарственного средства.

Изобретение относится к медицине, а именно к химико-фармацевтической промышленности и касается стабилизированной фармацевтической композиции на основе рекомбинантного незликозилированного интерлейкина человека в восстановленном виде, JL-2, и способа его получения. Сущность изобретения заключается в смешивании водного раствора, содержащего JL -2 и лимонную кислоту, с водным раствором, содержащим декстран, кальциевую соль ЭДТА и маннит, и йиофилизации, взятых при определенных соотношениях. технический результат заключается в получении стабильной композиции. 2 с. и 3 з. п. ф-лы, 3 табл.

1. Стабилизированная фармацевтическая композиция на основе рекомбинантного незликозилированного интерлейкина человека в востановленном виде IL-2, содержащая лимонную кислоту и маннит, отличающаяся тем, что дополнительно содержит декстран со средней мол.м. 40000 - 110000 и кальцевую соль ЭДТА при соотношении IL-2, лимонной кислоты, маннита, декстрана и кальциевой соли ЭДТА соответственно 1 : 10 : 50 : 40 : 0,01. 2. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что декстран имеет среднюю относительную мол.м. около 70000. 3. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что массовое отношение декстран IL-2 лежит в пределах от 20 до 80. 4. Композиция по пп.1 - 3, отличающаяся тем, что в ней содержится димер IL-2 в количестве менее или равном 2%. 5. Способ получения стабилизированной фармацевтической композиции на основе рекомбинантного незликозилированного интерлейкина человека в восстановленном виде IL-2 путем смешивания IL-2 в водном растворе, содержащем лимонную кислоту, отличающийся тем, что перед лиофилизацией к водному раствору IL-2, содержащему лимонную кислоту, добавляют раствор, содержащий декстран, кальциевую соль ЭДТА и маннит, при массовом соотношении IL-2, лимонной кислоты, маннита, декстрана и кальциевой соли ЭДТА 1 : 10 : 50 : 40 : 0,01.