СПЕРМАГГЛЮТИНИРУЮЩЕЕ СРЕДСТВО РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ Российский патент 1995 года по МПК A61K35/78 

Описание патента на изобретение RU2029558C1

Изобретение относится к биологии и медицине, оно может быть использовано как для изучения агглютинирующих свойств лектинов, так и в медицинской практике при разработке новых контрацептивных средств. Предлагаемое изобретение касается тех лектинов, которые обладают спермагглютинирующим действием. Известны лектины с таким спектром действия из других растительных источников [1]. Лектины-спермагглютинины являются мощным потенциалом при создании новых противозачаточных средств наружного воздействия. В целом лектинам не присуща спермагглютинирующая активность, она отмечается у отдельных представителей этого класса белков.

Так, в работе [1] изучены лектины растений Индии, специфичных к сперматозоидам. Исследованы 114 видов растений, относящихся к 46 семействам, главным образом к семейству Fabaceаe. Большинство представленных источников относится к редко встречающимся растениям и не может быть промышленным источником лектинов.

Близким аналогом также может служить лектин из семян хлебного дерева (Artocarpus heterophуllus). Лектин обладает N-ацетилглюкозамин углеводной специфичностью и также агглютинирует сперматозоиды человека.

В данном случае из семян Datura innoхia выделен лектинный препарат, состоящий из двух лектинов с одинаковой углеводной специфичностью. Поскольку указанные семена не содержат других лектинов и оба лектина обладают аналогичным действием, предложен метод выделения суммы лектинов. Полученный препарат содержит два гомогенных лектина. При выделении лектинов из семян Datura innoхia были использованы классические методы выделения белков, применяемые в биохимии. Данные о том, что семена Datura innoхia содержат лектины гемагглютинины были известны ранее [2]. Однако свойство агглютинировать сперматозоиды человека для лектинов из семян Datura innoхia открыто впервые. Следует отметить, что семена Datura innoхia (семенные Solanaceaе) являются перспективным и доступным источником лектинов, поскольку это растение культивируется специально в Чимкентской области Казахстана для получения из семян лекарственных препаратов. Шрот семян после экстракции изопропиловым спиртом на производстве является также отличным источником лектинов.

Суммарный препарат лектинов из семян Datura innoхia содержит два лектина: с молекулярной массой (I) 130 кДа и (II) 260 кДа (I 70%, II 30%). Лектины отличаются по аминокислотному составу и изоэлектрической точке, имеют одинаковую углеводную специфичность. Содержание суммы лектинов составляет 0,5 вес. % семян. Оба вида лектинов обладают описанным свойством и могут быть использованы как отдельно, так и вместе.

Способ получения лектинов, является стандартным. Поскольку в описанном случае могут использоваться либо отдельно два гомогенных лектина, либо смесь двух гомогенных лектинов, способ получения не влияет на свойства получаемых веществ.

Так как способность лектинов из Datura innoхia взаимодействовать с рецепторами сперматозоидов открыта впервые, то это открывает перспективы широкого использования последних в биологии при изучении топографии и структуры рецепторов сперматозоидов человека и животных, а также при создании новых видов контрацептивных средств и при изучении механизма контрацепции на основе специфической агглютинации сперматозоидов.

Изучение спермагглютинирующей активностии.

1. Получение сперматозоидов.

Эякулят получали от здоровых доноров (N 10). Инкубировали 30 мин при комнатной температуре для разжижения, после чего исключали наличие антиспермальных антител, как описано ниже. Фракцию подвижных сперматозоидов получали методом "Svim up". Для этого на поверхности образца спермы (после разжижения) аккуратно наслаивали 8 мл среды М 199 и инкубировали при температуре 37oC в токе СО2 в течение 90 мин. При этом подвижные сперматозоиды переходят в верхний слой. После инкубации верхний слой аккуратно отбирали микропипеткой и использовали для дальнейших исследований.

2. МАР - тест (miхеd Agglutination Reaction).

МАР - тест использовали для определения антиспермальных антител в сперме донора. Для проведения МАР - теста смешивали на слайде 10 мкл спермы, 10 мкл латексных шариков, покрытых антигенами человека и 10 мкл анти-сыворотки кролика (Орто Диагностик, Бельгия). Результаты реакции исследовали с помощью фазово-контрастного микроскопа при увеличении 400, учитывали количество сцепленных с шариками подвижных сперматозоидов (МАР, %) по отношению к 100 подвижным сперматозоидам в пробе. Результаты регистрировали через 2-3 мин после приготовления пробы и повторно через 10 мин. Результат МАР-теста считаетcя положительным, если 10% или более подвижных сперматозоидов в пробе несут на себе шарики. Во всех дальнейших экспериментах использовали только МАР-негативные образцы.

3. Определение жизнеспособности сперматозоидов.

При определении жизнеспособности клеток использовали окрашивание клеток ИП, проникающее и накапливающееся в мертвых клетках. К суспензии клеток добавляли ИП (конечная концентрация 20 мкг/мкл) и инкубировали 10 мин при комнатной температуре. Поскольку интенсивность флуоресценции связанного ИП значительно выше, чем свободного, отмывание не проводили. С помощью флуоресцентного микроскопа оценивали количество мертвых и живых клеток, подсчитывая в каждом образце не менее 200 сперматозоидов.

4. Определение агглютинирующей активности.

Навеску лектинного препарата разводили в среде 199 непосредственно перед началом экспериментов и добавляли к суспензии сперматозоидов в ячейке 96 луночных микротестов в различных концентрациях. Агглютинацию оценивали немедленно после добавления и после 4 ч инкубации при 37oC в СО2 ингибиторе. Для этого использовали фазово-контрастный микроскоп фирмы LЕIТZ. Оценивали количество свободных активно подвижных сперматозоидов и характер агглютинатов в каждом образце. Следует отметить, что для проявления спермагглютинирующей активности не имело значения от какого донора (человека) взята сперма. Аналогичное действие проявлялось и на сперме различных животных.

Изучение спермагглютинирующей активности вещества "Хоуп" проводили с использованием фракции отмытых от семенной жидкости активно подвижных сперматозоидов, а также с использованием цельной спермы. Суспензию активно подвижных сперматозоидов помещали в ячейке 96-луночного микротеста с различными разведениями вещества "Хоуп" в среде 199. В первых трех экспериментах использовали следующие концентрации: 10 мг/мл, 1 мг/мл, 100 мкг/мл, 10 мкг/мл, 1 мкг/мл, 0,1 мкг/мл. Во всех экспериментах наблюдалась мгновенная агглютинация сперматозоидов при добавлении вещества "Хоуп" в концентрации 1 мкг/мл и выше. В дальнейшем проводили изучение агглютинирующего действия в интервале концентраций вещества "Хоуп" от 100 до 0,1 мкг/мл. Наблюдали зависимость характера агглютинации от концентрации вещества "Хоуп". При концентрации от 10 до 2,5 мкг/мл наблюдали агглютинация в виде тяжей и нитей сцепленных между собой сперматозоидов, причем отмечались взаимодействие как голова-голова, хвост-голова и голова-хвост. Наблюдали также адгезию части клеток на пластик. В этом интервале концентраций наблюдалась 100%-ная агглютинация сперматозоидов. Отдельные подвижные сперматозоиды отсутствовали. Начиная с концентрации 1 мкг/мл характер агглютинации менялся: наблюдались сферические агглютинаты, а также подвижные сперматозоиды. При снижении концентрации вещества "Хоуп" до 0,5 мкг/мл количество свободных сперматозоидов резко возрастало. Подобная концентрационная зависимость наблюдалась в пяти экспериментах.

При инкубации сперматозоидов с веществом "Хоуп" в течение 4 ч при 37oC в СО2 инкубаторе наблюдалась обратимость агглютинации при концентрациях ниже 10 мкг/мл - количество агглютинатов уменьшалось и появлялось много одиночных активно подвижных сперматозоидов. При концентрации 10 мкг/мл наблюдались отдельные подвижные сперматозоиды, при концентрациях 20 мкг/мл и выше единичных сперматозоидов не обнаруживалось.

При использовании цельной спермы 100%-ная необратимая агглютинация наблюдалась при дозе вещества "Хоуп" 50 мкг/мл и выше.

С помощью флуоресцентного зонда иодида пропидия было проведено изучение цитотоксического действия вещества "Хоуп" на сперматозоиды. На чертеже приведена дозовая зависимость жизнеспособности сперматозоидов после четырех часов инкубации с различными концентрациями вещества "Хоуп" ("Х"). За 100% принята жизнеспособность сперматозоидов в среде 199. Как следует из чертежа, обнаружена очень незначительная цитотоксическая активность вещества при концентрациях от 500 до 1 мкг/мл. Испытание спермагглютинирующей активности лектинов из "Datura innохia" на различных донорах проводилось в Институте охраны здоровья матери и ребенка Минздрава России (г. Москва).

Похожие патенты RU2029558C1

название год авторы номер документа
Способ определения активности спермы 1986
  • Белоиваненко Виктор Иванович
  • Дахно Федор Власович
  • Крамар Мария Иосиповна
  • Чурилов Юрий Семенович
  • Чадаев Валерий Евгеньевич
  • Паращук Юрий Степанович
SU1357018A1
СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ХИМИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ 2002
  • Луцкий Д.Л.
  • Николаев А.А.
RU2217750C2
СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ МУЖСКОГО СЕКРЕТОРНОГО БЕСПЛОДИЯ 1994
  • Божедомов Владимир Александрович
  • Билич Габриэль Лазаревич
  • Сухих Геннадий Тихонович
RU2089188C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЛКА ИЗ ХЛОПКОВОГО ШРОТА 1991
  • Юнусов Тимур Сабирович
  • Рафиков Рустем Ахмедович
  • Стопницкий Александр Янович
  • Черный Владимир Владиленович
  • Рамазанов Сервер Исмаилович
RU2019977C1
СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНО-МЕТАБОЛИЧЕСКОГО СТАТУСА СПЕРМАТОЗОИДОВ, ПОЛУЧЕННЫХ ИЗ СЕМЕННОЙ ЖИДКОСТИ ЗДОРОВОГО ЧЕЛОВЕКА В УСЛОВИЯХ IN VITRO ПОД ДЕЙСТВИЕМ ЛАЗЕРА НИЗКОЙ ИНТЕНСИВНОСТИ 2015
  • Гизингер Оксана Анатольевна
  • Долгушин Илья Ильич
  • Францева Ольга Валерьевна
  • Куренков Евгений Леонидович
RU2583949C1
Способ прогнозирования идиопатического бесплодия мужчин 2019
  • Николаев Александр Аркадьевич
  • Ушакова Мария Владимировна
  • Голубкина Светлана Александровна
RU2697395C1
СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ АУТОИММУННОГО МУЖСКОГО БЕСПЛОДИЯ 1998
  • Сухих Г.Т.
  • Божедомов В.А.
  • Кулаков В.И.
RU2155596C2
ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЕ СРЕДСТВО И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ 2001
  • Самылина И.А.
  • Новожилова Т.И.
  • Киселевский М.В.
  • Зайчикова С.Г.
RU2181052C1
СРЕДСТВО ДЛЯ ИММУНОСТИМУЛЯЦИИ 1998
  • Ковальчук Л.В.
  • Ганковская Л.В.
RU2145500C1
Способ определения жизнеспособности сперматозоидов человека 2018
  • Доценко Анна Андреевна
  • Кудрявцев Игорь Владимирович
  • Серебрякова Мария Константиновна
  • Полевщиков Александр Витальевич
RU2689791C1

Иллюстрации к изобретению RU 2 029 558 C1

Реферат патента 1995 года СПЕРМАГГЛЮТИНИРУЮЩЕЕ СРЕДСТВО РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

Изобретение относится к области растительных лектинов, обладающих различным физиологическим действием. Растительный спермагглютинин - лектинный препарат из семян Datura innoxia (сем. Salanaceal) состоит из двух гомогенных лектинов (содержание в препарате соответственно I 70%, II 30%. Препарат обладает выраженной спермагглютинирующей (сперма человека) активностью при концентрациях 50 мкг/мл и выше и незначительным сперматоксическим действием. 1 ил.

Формула изобретения RU 2 029 558 C1

СПЕРМАГГЛЮТИНИРУЮЩЕЕ СРЕДСТВО РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ, отличающееся тем, что оно представляет собой лектин из семян Datura innoxia семейства Solanaceae.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 1995 года RU2029558C1

Аппарат для очищения воды при помощи химических реактивов 1917
  • Гордон И.Д.
SU2A1
Royd W.C.Etal - J.Immunology, 1949, vol.62, p.333-338.

RU 2 029 558 C1

Авторы

Юнусов Тимур Сабирович[Uz]

Стопницкий Александр Янович[Uz]

Даты

1995-02-27Публикация

1992-09-09Подача