СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТОКСИЧНОСТИ ПРИРОДНЫХ ВОД Российский патент 1995 года по МПК G01N33/18 

Изобретение относится к способам биотестирования и может быть использовано в токсикологии, гидробиологии, экологии, зоологии.

Известен способ определения токсичности природных вод путем регистрации двигательной активности пиявок и фиксирования их статичных поз [1].

Способ имеет следующие недостатки: узкий диапазон биотестирования, охватывающий только пресные воды; необходимость приведения тест-объекта в определенное функциональное состояние.

Известен способ определения солености природных вод путем регистрации двигательной активности морских ракообразных и выбора ими градиента оптимальной солености [2].

Способ имеет следующие недостатки: длительность способа; неэкономичность; ненадежность.

Наиболее близким к заявленному изобретению является способ определения токсичности водной среды по измерению скорости движения рыб в оптомоторной установке [3] . Показателем действия токсиканта является снижение скорости движения рыб по сравнению с контрольной группой.

Недостатками прототипа являются длительность определения; неэкономичность способа - необходимость больших емкостей, снабженных продувкой или протоком; неточность способа - невозможность определения концентрации токсиканта по двигательной активности рыб.

Цель достигается следующим образом.

В качестве тест-объекта используют ракообразных (гаммарусов, относящихся к бокоплавам), широко распространенных в морских и пресных водоемах. Гаммарусы, помещенные в небольшие (диаметром от 18 до 29 см) цилиндрические сосуды, обычно плавают равномерно вдоль его стенок (тигмотаксис), часто с постоянной скоростью. У большинства животных наблюдается преимущественно однонаправленное передвижение по периметру сосуда (по часовой стрелке или против нее), т. е. проявляется пространственная асимметрия и тигмотаксис. Остановка и смена направления движения бывает крайне редко.

При наличии в водной среде токсикантов, например нефтяного топлива (солярка), эти показатели поведения бокоплавов существенно меняются. Движение бокоплавов замедляется, становится хаотичным, животные останавливаются, меняют исходное направление движения, нарушается первоначальная траектория, появляется характерное переворачивание вдоль вертикальной оси. Преимущественный выбор направления, характерный для нормальных условий, меняется на противоположный или животное начинает равновероятно перемещаться вдоль и против часовой стрелки. Высокие концентрации токсиканта могут вызывать полную остановку движения и гибель животного. Таким образом изменяется нормальное физиологическое состояние бокоплавов.

Следовательно, измеряя изменения двигательной активности, а также оценивая нарушения качественных показателей ориентационного поведения исследуемых животных (тигмотаксис и двигательная асимметрия), можно определить наличие и величину токсического воздействия. Для достижения цели выполняются операции в следующей последовательности.

Отловленных животных (гаммарусов) для адаптации рассаживают в емкости, в которых создаются условия, адекватные среде их обитания в природе: песчаный грунт, камни на дне для укрытия, водоросли, слой воды от 10 до 20 см. Для адаптации достаточно 1-2 сут. Температурный режим аналогичен условиям обитания вида. Плотность посадки не должна превышать 10 особей на 1 л воды. Смена воды 1 раз в сутки.

Перед тестированием бокоплавов предварительно рассаживают по одному в сосуды емкостью 500-700 мл с количеством воды 200-300 мл, где их выдерживают в течение 1-1,5 ч для адаптации к условиям опыта при естественном освещении.

На фиг. 1-3 показаны схемы и графики, иллюстрирующие предлагаемый способ.

Тестирование осуществляют следующим образом. Каждую особь переносят в сосуд (кристаллизатор) диаметром 18-22 см с координатной сеткой на дне и высотой столба чистой воды 3,5-5,0 см, в котором после 1-1,5 мин адаптации регистрируют общее число и направление движений животного (по и против часовой стрелки) каждые 20-30 с в течение 3-4 мин (фиг. 1).

На дно сосуда нанесена координатная сетка, разделенная на три зоны: периферийная (III), средняя (II), центральная (I) и 8 секторов. За одно движение принимают переходы животного из любого сектора или зоны в соседний сектор или зону.

После первого опыта (в чистой морской воде) воду в сосудах, в которых содержат гаммарусов, заменяют раствором исследуемого токсиканта известной концентрации и снова помещают в них тест-объекты на 1-1,5 ч. Затем проводят повторное тестирование каждого животного. Эту процедуру повторяют 3-4 раза с интервалом 1-2 ч (фиг. 2). Результаты одновременного тестирования 2-х групп: опытной и контрольной (а и б) в зависимости от времени экспозиции в токсиканте 1, 2, 3 ч и в чистой воде - контрольной (по 15-20 особей в каждой группе) представлены в графиках - изменения среднего числа движений в каждой группе в зависимости от времени (часы).

Используют общепринятый критерий действия токсиканта - статистически достоверные различия между контролем и опытом. Из анализа зависимости между концентрацией, временем экспозиции и количеством движений в растворе токсиканта (фиг. 2) выведена формула, позволяющая определить на основе известной (эталонной) концентрации нефти исследуемую неизвестную ее концентрацию в водной среде.

C_i= C_этln ln , (1) где С_i - концентрация нефти (солярка) в исследуемой среде;
С_эт. - эталонная концентрация, при которой проведены измерения движений;
N_эт. - количество движений при эталонной концентрации;
N_эт. (t_o) - количество движений группы, которая используется в опыте с эталонной концентрацией в чистой воде;
N_эт. (t_j) - количество движений в опыте с эталонной концентрацией после экспозиции в растворе токсиканта в течение времени t_j;
N_i(t_o) - количество движений исследуемой группы в чистой воде;
N_i(t_j) - количество движений исследуемой группы после экспозиции длительностью t_j в воде с неизвестной концентрацией нефти.

Пример расчета неизвестной концентрации токсиканта (нефти) в водной среде по формуле (I).

Берут эталонную (известную) концентрацию токсиканта (дизельное топливо - солярка), равную 0,01% (С_эт).

Регистрируют в течение 3 мин число движений животных эталонной группы в норме (в чистой воде), получают N_эт, (t_o) = =100.

Переносят животных эталонной группы (по одному) в токсикант эталонной концентрации (0,01%); через 2 ч снова измеряют N_эт. в течение 3 мин. Получают N_эт. (t = 2) = 80.

Берут новую группу животных (опытную). Измеряют число движений за 3 мин в норме (в чистой воде); это измерение соответствует нулевой точке. Получают N_i(t_o) = =150.

Переносят животных (по одному) в раствор токсиканта неизвестной концентрации (C_i) и через 2 ч снова измеряют число движений в течение 3 мин (t_i). Получают N_i(t=2)=75.

Подставляют полученные результаты в формулу (I) и получают искомую неизвестную концентрацию (С_i):
C_i= 0,01% ln ln = 0,01 =
= 0,01 = 0,03%
Таким образом искомая концентрация нефтяного загрязнения равна 0,03%.

Кроме основного показателя - изменения количества движений также используется такой параметр ориентационного поведения, как моторно-пространственная асимметрия: однонаправленное передвижение гаммарусов по или против часовой стрелки по периметру сосуда с почти постоянной скоростью.

При действии токсиканта этот показатель поведения резко меняется: снижается число животных, сохраняющих определенное направление движения. Гаммарусы начинают перемещаться хаотично, многократно меняя направление движения (фиг. 3). Видно снижение числа животных с достоверно выраженным выбором направления движения в условиях нефтяного загрязнения (а) и контрольной группы без загрязнения (б).

Предлагаемый способ является ускоренным (20-24 ч) по сравнению с прототипом (10-12 сут), более экономичным, так как не требует больших емкостей, снабженных проточной водой или продувкой воздухом, является более точным, так как позволяет по поведенческим реакциям определить концентрацию токсиканта, например, нефтяного загрязнения в водной среде с точностью до 0,01%.

П р и м е р. Гаммарусов (Gammarus oceanicus, беломорский вид) помещают в емкости с морской водой для адаптации, после чего по одной особи переносят в сосуды емкостью 500 мл с количеством чистой воды 200 мл, где выдерживают их 1 ч при естественном освещении. Опыты проводят одновременно на 2-х группах: контрольной и опытной (по 15-20 особей в каждой).

После часовой адаптации определяют двигательную активность животных в чистой воде (нулевая точка), для чего бокоплавов по одному переносят для тестирования в цилиндрический сосуд диаметром 18 см. с координатной сеткой на дне, с высотой столба чистой воды 3,5 см, где проводят адаптацию к новым условиям в течение 1 мин, затем регистрируют общее число движений и количество движений по и против часовой стрелки при перемещении по периметру сосуда каждые 20 с в течение 3 мин. После этого чистую воду в сосудах заменяют раствором токсиканта 0,01% в воде, возвращают в них тест-объекты и выдерживают 1 ч. Затем каждую особь снова переносят в сосуд с координатной сеткой, где регистрируют число и направление движений (тестирование производится в воде, содержащей токсикант).

После тестирования бокоплава возвращают в сосуд с раствором токсиканта. Аналогичным образом производят тестирование через 2 и 3 ч экспозиции в токсиканте. Таким образом после тестирования всех бокоплавов в группах получают калибровочную кривую зависимости общего числа движений от времени экспозиции в токсиканте (фиг. 2). На фиг. 2 видно, что в опытной группе (а) наблюдается резкое снижение двигательной активности в результате токсического воздействия водной среды; при этом в контрольной группе (б) этот показатель практически не меняется. Различия между значениями количества движения в контрольной и опытной группах статистически достоверны.

П р и м е р 2. Гаммарусов по одной особи адаптируют в емкости с морской водой, после чего переносят в сосуды емкостью 700 мл с количеством чистой воды 200 мл, где выдерживают их в течение 1,5 ч при естественном освещении. Затем каждую особь переносят в цилиндрический сосуд диаметром 21 см с координатной сеткой на дне и высотой столба чистой воды 5 см, где проводят адаптацию в течение 1,5 мин, затем регистрируют число и направление движений гаммаруса по периметру сосуда каждые 30 с в течение 4 мин. После этого чистую воду в сосудах заменяют раствором природной воды с неизвестной концентрацией токсиканта (нефтяного загрязнения), возвращают в них гаммарусов и выдерживают их 1,5 ч. Затем по одному переносят в сосуд с координатной сеткой, где повторно регистрируют число и направление движений. В опытной группе (в природной воде) наблюдается статистически достоверное снижение двигательной активности по сравнению с контрольной группой (на 75%). После этого проводят расчет по формуле (I) с использованием калибровочной кривой (фиг. 2), получают неизвестную концентрацию нефтяного загрязнения, равную 0,04%.

П р и м е р 3. Гаммарусов адаптируют в емкости с морской водой, после чего переносят в сосуды емкостью 300 мл с количеством чистой воды 200 мл, выдерживают в течение 0,5 ч, затем переносят в сосуд с координатной сеткой на дне, с высотой столба чистой воды 2,5 см, регистрируют число и направление движений, после чего выдерживают в растворе токсиканта 0,5 ч. Гаммарусы обнаруживают сравнительно большое число движений, которое в контрольной группе статистически не отличается от опытной группы. Исследуемая концентрация не определяется.

Использование: токсикология, гидробиология, экология, зоология. Сущность применения: в качестве тест-объекта используют ракообразных - гаммарусов. При наличии в водной среде токсикантов в животных наблюдается остановка и смена направлений, тогда как в нормальной среде движения однонаправленные по периметру сосуда. Оценивая нарушения качественных показателей ориентационного поведения, определяют наличие и величину токсиканта. 1 з.п.ф-лы, 3 ил.

1. СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТОКСИЧНОСТИ ПРИРОДНЫХ ВОД, включающий адаптацию и измерение параметров движения водных животных, отличающийся тем, что морских ракообразных гаммарусов по одному помещают в сосуды для адаптации емкостью 500 - 700 мл с количеством воды 200 - 300 мл и с камнем в качестве убежища, где выдерживают их в течение 1 - 1,5 ч, после чего каждую особь переносят в цилиндрический сосуд диаметром 18 - 21 см с координатной сеткой на дне и высотой столба чистой воды 3,5 - 5 см, выдерживают 1 - 1,5 мин, затем регистрируют число и направление движений гамаруса каждые 20 - 30 с в течение 3 - 4 мин, после чего воду в сосудах для адаптации заменяют исследуемым раствором, куда возвращают гаммарусов и выдерживают в течение 1 - 1,5 ч, после чего снова замеряют число и направление движений в сосуде с координатной сеткой. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что неизвестную концентрацию токсиканта в воде определяют по формуле

где C - концентрация нефти (солярка) в исследуемой среде;
C_эт - эталонная концентрация, при которой проведены измерения движений;
N_эт - количество движений при эталонной концентрации,
N_эт (t₀) - количество движений группы, которая используется в опыте с эталонной концентрацией в чистой воде;
N_эт.(t_j) - количество движений в опыте с эталонной концентрацией после экспозиции в растворе токсиканта в течение времени t_j;
N_i (t₀) - количество движений исследуемой группы в чистой воде;
N_i (t_j) - количество движений исследуемой группы после экспозиции длительностью t_j в воде с неизвестной концентрацией нефти.