КОМПЛЕКС ПРИРОДНЫХ КАТИОННЫХ БЕЛКОВ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2001 года по МПК A61K38/02 A61K38/00 C07K1/14 C07K1/16 

Изобретение относится к области медицины, в частности к лекарственным препаратам, содержащим белковые вещества, и способам их получения, а именно природным катионным белкам из ткани тимуса телят - гистонам.

Гистоны - катионные (основные) белки, которые содержатся в клеточных ядрах всех тканей животных и растений. Всего известно пять классов гистонов, которые различаются между собой по содержанию в их молекуле основных аминокислот - лизина и аргинина.

Классы гистонов имеют следующие обозначения: гистон H1 (богатый лизином), гистон H2B (умеренно богатый лизином), гистон H2A (богатый аргинином и лизином), гистон H3 (богатый аргинином), гистон H4 (богатый аргинином и глицином). Гистоны гетерогенны и по молекулярному весу. Наибольшую молекулярную массу имеет гистон H1 - 21500, следующие по величине гистоны H3, H2A, H2B, H4 - 15320, 14000, 13774, 11280 Да соответственно. Экзогенные гистоны являются антибактериальными и антивирусными агентами широкого спектра действия, и некоторые из них оказывают потенцирующее действие на активность антибактериальных агентов при совместном их применении. Вместе с тем, отдельные классы гистонов различаются по спектру и интенсивности их прямого антибиотического действия, что ограничивает возможность использования каждого из них в качестве фармакологического средства широкого спектра действия. Комплексы гистонов одновременно обладают антибиотической активностью, способностью оказывать потенцирующее действие на активность антибактериальных агентов, а также могут выступать в качестве белка-носителя для транспорта тех лекарственных средств, которые характеризуются ограниченной проницаемостью через клеточные мембраны и тканевые барьеры, что позволяет расширить спектр практического применения гистонов в качестве лекарственного средства [1].

Известен способ получения комплекса природных катионных белков-гистонов из ткани тимуса телят [2]. Данный известный способ получения комплекса гистонов основан на хроматографическом фракционировании суммарного гистона сернокислого из ткани тимуса телят, включающем первичное растворение исходного продукта в среде, содержащей 0,02 н. HCl, 8 М мочевину, 1% 2-меркаптоэтанол, хроматографию на биогеле P-60 при pH 1,7, в результате которой получают четыре белковых пика: гистон H1, смесь гистонов H2A+H3, гистон H2B и гистон H4, первичного диализа целевого продукта против дистиллированной воды и первичной его лиофилизации. Этот способ позволяет проводить отделение гистона H1 от гистонов H2A, H2B, H3, H4, но к его недостаткам следует отнести протеолитическую деградацию отдельных классов гистонов в процессе хроматографического разделения.

Наиболее близким по технической сущности к настоящему изобретению является комплекс природных катионных белков из ткани тимуса телят и способ его получения [3]. Этот способ позволяет получить высокоочищенный комплекс природных катионных белков из ткани тимуса телят, содержащий в своем составе недеградированные гистоны H2A, H2B, H3, H4, за счет предотвращения их протеолитической деградации в процессе хроматографии, что достигается использованием для фракционирования препарата гистона сернокислого из ткани тимуса телят, не содержащего гистона H1, с которым связаны негистоновые белки, обладающие протеиназной активностью. Данный известный способ получения комплекса гистонов основан на первичном растворении суммарного гистона сернокислого из ткани тимуса телят в HCl, обработки раствора неорганической кислотой (хлорной кислотой) до конечной концентрации 0,5М для отделения растворимого в хлорной кислоте гистона H1 от нерастворимых гистонов H2A, H2B, H3, H4, отделения осадка перхлоратов гистонов центрифугированием, вторичном его растворении и хроматографическом разделении, при этом получают: следы гистона H1, гистон H2B, смесь гистонов H2A+H3 и гистон H4, после чего белковые фракции объединяют и проводят первичный диализ целевого продукта против 0,01-0,02 н. HCl и его первичную лиофилизацию. В растворах низкой ионной силы (физиологический раствор хлористого натрия или 0,01 М фосфат натрия) и в средах организма гистоны H2A, H2B, H3, H4 взаимодействуют между собой и существуют в виде белкового комплекса с высоким положительным зарядом на поверхности всей молекулы. Взаимодействие между гетерологичными гистонами значительно сильнее, чем между гомологичными, и нековалентное взаимодействие (ионные связи, водородные связи, гидрофобное взаимодействие) между гетерологичными гистонами высокоспецифично: сильные белок-белковые взаимодействия образуются между парами гистонов H2A-H2B, H3-H4, H2B-H4 и слабые связи между парами H2A-H3, H2B-H3, H2A-H4 [4]. Вместе с тем нековалентное взаимодействие между гистонами в растворах высокой ионной силы и при низких значениях pH нарушается, и в таких растворах гистоны существуют в виде мономеров [5].

Решаемой задачей и техническим результатом настоящего изобретения является создание высокоочищенного комплекса гистонов из ткани тимуса телят, обладающего стабильностью в растворах высокой ионной силы и при низких значениях pH, сохраняющего антибиотическую активность всех классов гистонов, входящих в его состав, легко проникающего через биологические мембраны, и получение такого комплекса гистонов связано единым изобретательским замыслом с созданием способа его получения.

Целевой продукт в конкретных условиях представляет собой комплекс химически перекрестно сшитых белков, образованный ковалетно связанными между собой гистонами из ряда H2A, H2B, H3, H4 с образованием устойчивых в растворах конъюгатов белков, которые образуют димеры и олигомеры с молекулярной массой не свыше 30 кДа и не свыше 70 кДа соответственно. В этом белковом комплексе нет гистона H1 и негистоновых белков, которые связаны с ним, а также нет продуктов деградации отдельных классов гистонов, а гистоны находятся в составе комплексов в растворах широкого диапазона ионной силы и pH за счет ковалентного связывания взаимодействующих белков, это достигается тем, что продукт, полученный после первичной лиофилизации, растворяют в растворе средней ионной силы и осуществляют ковальное связывание белков сшивающим агентом без осаждения белков из раствора при pH, температуре и времени инкубации реакционной смеси для полной модификации доступных аминогрупп белков в препарате с образованием устойчивых в растворе конъюгатов белков с молекулярной массой не свыше 30 кДа и не свыше 70 кДа, причем реакцию ковалентного связывания останавливают восстанавливающим агентом, после чего осуществляют повторный диализ целевого продукта против буферного раствора низкой ионной силы и его повторно лиофилизируют.

В частном конкретном случае комплекс химически перекрестно сшитых природных катионных белков из ткани тимуса телят содержит устойчивые в растворе гетерогенные по молекулярной массе конъюгаты белков, образованные ковалентно связанными между собой через глутаровый альдегид по свободным аминогруппам лизина гистонами из ряда H2A, H2B, H3, H4. Ковалентно связанные между собой гистоны из ряда H2A, H2B, H3, H4 образуют димеры и олигомеры с молекулярной массой 25-30 кДа и 65-70 кДа соответственно.

В частном конкретном случае способ получения комплекса природных катионных белков из ткани тимуса телят осуществляют следующим образом: белковый продукт после повторной лиофилизации растворяют в растворе pH 7,6-7,8 до конечной концентрации белка в растворе не более 0,4% и к полученному раствору добавляют бифункциональный сшивающий реагент, в качестве которого используют глутаровый альдегид в концентрации не более 0,5•10^-2 моль/л, и проводят реакцию ковалентного связывания при температуре не более 23^oC, времени инкубации не более 30 минут, причем повторный диализ целевого продукта проводят при температуре не более 10^oC в течение времени не более 24 часов против 0,01 М фосфатного буферного раствора pH 7,0.

Благодаря высокой эффективности взаимодействия с аминогруппами белков бифункциональный сшивающий агент - глутаровый альдегид широко используется при синтезе ковалентных конъюгатов, при этом осуществление реакции не требует предварительной модификации белков. Химическое связывание с помощью глутарового альдегида не лимитируется фиксированным набором правил по проведению реакции ковалентного связывания белков при использовании этого сшивающего реагента. В каждом конкретном случае необходимо подбирать условия максимального связывания белков, которое контролируется комбинацией ряда параметров и зависит от концентрации глутарового альдегида в среде инкубации и количества реагента на единицу массы белка, величины pH инкубационной среды, температуры и времени инкубации, при которых продукт реакции остается в растворе, и при этом все доступные аминогруппы белков модифицированы.

В ходе экспериментов установлено, что молярное содержание доступных для модифицикации аминогрупп в препарате, содержащем гистоны H2A, H2B, H3, H4, составляет 6,7 ± 0,1•10^-4 моль/г (количество свободных аминогрупп определяют в реакции с 2,4,6-тринитробензолсульфокислотой (6)), а действующая концентрация глутарового альдегида эквимолярна количеству доступных для модификации аминогрупп в препарате и составляет 0,3-0,5•10^-2 моль/л. При концентрации белка в растворе 0,2-0,4% продукт реакции устойчив в растворе, и при этом модифицированы все аминогруппы белков. При увеличении концентрации белка в растворе в два раза происходит агрегация конъюгатов белков и образуется гель, а при увеличении концентрации белка и глутарового альдегида в два раза образуется осадок. При исследовании влияния величины pH инкубационной среды, температуры и времени инкубации на ход реакции выявлено, что связывание необходимо проводить при pH 7,6-7,8, температуре 21-23^oC в течение 15-30 минут, и при этих условиях происходит полная модификация аминогрупп белков и продукт реакции находится в растворе. Реакцию ковалентного связывания белков останавливают с помощью восстанавливающего реагента, после чего проводят диализ целевого продукта против 0,01М фосфатного буфера pH 7,0 при температуре 8-10^oC в течение 18-24 часов и его лиофилизируют. Оценку молекулярной массы и заряда молекул в составе синтезированного целевого продукта, содержащего конъюгаты гистонов из ряда H2A, H2B, H3, H4, проводят на основании результатов его электрофоретического анализа в полиакриламидном геле в различных системах разделения.

Пример 1.

Препараты суммарного гистона сернокислого из ткани тимуса телят получают известным способом [7] . Образец суммарного гистона сернокислого из ткани тимуса телят в количестве 100 мг растворяют в 20 мл 0,01 н. HCl. К белковому раствору добавляют хлорную кислоту до конечной концентрации 0,5 М. Раствор центрифугируют. На этом этапе отделяют растворимый в 0,5 М хлорной кислоте гистон H1. Осадок перхлоратов гистонов, содержащий гистоны H2A, H2B, H3, H4, промывают ацетоном и высушивают под вакуумом. Хроматографическое разделение гистонов проводят на акрилексе П-30. Для этого 75 мг образца препарата, содержащего гистоны H2A, H2B, H3, H4, растворяют в 5 мл раствора следующего состава: 0,015 н. HCl, 005 М натрий хлористый, pH 1,7. Белковый раствор вносят в колонку длиной 94 см и диаметром 2,5 см, заполненную гелем акрилекса П-30. Хроматографию проводят при комнатной температуре. Элюцию белка с колонки проводят исходным раствором. Регистрацию выхода белка с колонки осуществляют спектрофотометрически при длине волны 230 нм и на основании этих данных строят профиль элюции белка с колонки. Получают четыре белковых пика: пик 1 - следы гистона H1, пик 2 - смесь гистонов H2A+H3, пик 3 - гистон H2B, пик 4 - гистон H4. Белковые фракции, соответствующие пикам 2-4, объединяют и диализируют против 0,01 н. HCl при 4^oC и лиофилизируют. Образец препарата после первичной лиофилизации, содержащий гистоны H2A, H2B, H3, H4, растворяют в 3 мл 0,1 М фосфатного буфера pH 7,9 до конечной концентрации белка в растворе 4 мг в 1 мл. К раствору белка при постоянном перемешивании на магнитной мешалке по каплям добавляют раствор глутарового альдегида (исходный раствор предварительно разбавляют в 10 раз) до конечной концентрации 0,5•10^-2 моль/л и через 2 минуты с помощью 0,1 М NaOH pH реакционной смеси доводят до 7,8 (при добавлении глутарового альдегида pH раствора снижается до pH 7,3-7,4), Инкубацию реакционной смеси проводят при температуре 23^oC при постоянном перемешивании на магнитной мешалке и после 30-минутной экспозиции реакцию останавливают добавлением к инкубационной смеси восстанавливающего реагента, после чего реакционную смесь дважды диализируют при 10^oC против 300 мл 0,01 М фосфатного буфера pH 7,0, последовательно в течение 3 и 15 часов и целевой продукт лиофилизируют.

Для определения молекулярной массы ковалентных конъюгатов гистонов проводят электрофоретическое разделение целевого продукта в 18%-ном полиакриламидном геле в присутствии 0,1%-ного додецилсульфата натрия [8]. По данным электрофоретического разделения в полиакриламидном геле целевого продукт является гетерогенным по молекулярной массе (фиг. 1). На фиг. 1 приведены экспериментальные данные по электрофоретическому разделению ковалентных конъюгатов гистонов в 18%-ном полиакриламидном геле в присутствии 0,1%-ного додецилсульфата натрия, время разделения 3 часа 30 минут, количество белка, внесенного в одну лунку геля 30 мкг, где обозначено: (A) - препарат суммарного гистона; (B) - препарат, содержащий гистоны H2A, H2B, H3, H4; (C) - препарат ковалентных конъюгатов гистонов; 1-3 - белковые зоны. При сопоставлении электрофореграмм разделения ковалентных конъюгатов гистонов с исходным препаратом, содержащим гистоны H2A, H2B, H3, H4, и суммарным гистоном, использованных в качестве контрольных образцов, видно, что препараты конъюгатов гистонов занимают в полиакриламидном геле две позиции (белковые зоны 1 и 2) со значением R_f ниже значения R_f всех фракций гистонов. Согласно этому наблюдению молекулярная масса полученных конъюгатов гистонов, определенная по калибровочной кривой, построенной с учетом подведения маркерных белков (альбумин, пепсин, РНКаза, цитохром C, инсулин), расположена в интервале 25-30 кДа и 65-70 кДа при их весовом соотношении не менее 10:1 соответственно (по данным денситометрии белковых пиков). Отсутствие в образцах конъюгатов "свободных" фракций гистонов, говорит о том, что они вовлечены в комплекс, т. е. ковалентно связаны друг с другом через глутаровый альдегид с образованием димеров и олигомеров гистонов. Необходимо отметить, что на электрофореграммах в данной системе электрофоретического разделения белков имеется минорная белковая зона 3 со значением R_f, близким значению R_f гистона H2B. На основании имеющихся данных трудно с определенностью установить, какая именно фракция гистонов присутствует в зоне 3. Можно предположить, что часть молекул гистона H2B не вовлечена в образование ковалентных конъюгатов гистонов, вместе с тем нельзя исключить того, что зона 3 соответствует гомологичным димерам гистона H4.

Содержание в составе ковалентных конъюгатов гистонов белковых молекул, несущих положительный заряд, оценивают на основании данных электрофоретического разделения целевого продукта в 15%-ном полиакриламидном геле в системе уксусная кислота - мочевина [9].

По данным электрофоретического разделения в этой системе целевой продукт является гетерогенным по заряду (фиг. 2). На фиг. 2 приведены экспериментальные данные по электрофоретическому разделению ковалентных конъюгатов гистонов в 15%-ном полиакриламидном геле в кислой буферной системе в присутствии 2,5 М мочевины, время разделения 3 часа 30 минут, количество белка, внесенного на 1 трубку геля, 30 мкг (A) и 100 мкг (B), где обозначено: (A) - препарат суммарного гистона; (B) - препарат ковалентных конъюгатов гистонов; 1-3 - белковые зоны. При сравнительном анализе электрофореграмм препарата ковалентных конъюгатов гистонов с препаратом суммарного гистона, взятого в качестве контрольного образца, видно, что в целевом продукте содержатся конъюгаты гистонов с низкой, средней и высокой электрофоретической подвижностью, которые условно можно разделить на три белковые зоны. При этом в препарате конъюгатов гистонов отсутствуют "свободные" фракции гистонов, которые в данной системе разделения занимают в полиакриламидном геле позиции с определенным значением R_f. Конъюгаты гистонов зоны 1 характеризуются низкой электрофоретической подвижностью и занимают положение в полиакриламидном геле, близкое к "старту", т.е. они имеют низкий положительный заряд на поверхности белковой молекулы. Напротив, конъюгаты белков минорной зоны 2 и мажорной зоны 3 характеризуются средней и высокой электрофоретической подвижностью в полиакриламидном геле. При этом конъюгаты гистонов зоны 2 имеют значение R_f, близкое к значению R_f гистона H1, а конъюгаты гистонов зоны 3 имеют значение R_f выше, чем значение R_f гистона H4. Присутствие в целевом продукте мажорной белковой зоны 3 указывает на то, что в его составе имеются ковалентные конъюгаты гистонов с высоким положительным зарядом на поверхности молекулы.

Пример 2. Получение препарата, содержащего гистоны H2A, H2B, H3, H4, проводят так же, как в примере 1, за исключением того, что при хроматографии гистонов элюцию белка с колонки, заполненной гелем акрилекса П-30, проводят раствором, который не содержит в своем составе хлористого натрия. Получают два белковых пика: пик 1 - следы гистона H1, пик 2 - смесь гистонов H2A+H2B+H3+H4. Реакцию ковалентного связывания гистонов проводят так же, как в примере 1, за исключением того, что к раствору белка после его активации глутаровым альдегидом добавляют глицин (2 мг/мл реакционной среды) и проводят реакцию ковалентного связывания, как описано выше. Присутствие аминокислоты в инкубационной среде препятствует формированию нерастворимых агрегатов димеров и олигомеров белков.

Свойства синтезированного продукта, содержащего конъюгаты гистонов, оцененные по результатам электрофоретического анализа целевого продукта в двух системах полиакриламидного геля, идентичны при использовании в реакции ковалентного связывания гистонов из ряда H2A, H2B, H3, H4, полученных при их хроматографическом разделении на акрилексе П-30.

Источники информации
1. Патент N 2045278 РФ. Средство, потенцирующее противотуберкулезное действие изониазида/ Ашмарин И.П., Перельман А.Е., Горюхина О.А., Вишневский Б.И., Габер Н.Э., Вавилин Г.И., БИ N 28. - 1995. - С. 127.

2. Von Holt C., Brandt W.F. Fractionation of histones on molecular sieve matrices// In Methods in cell Biology. - 1977. - Vol. 16. - P. 205-225. Acad. Press, New York.

3. Патент N 1319352 A1 РФ. Способ очистки препарата гистона H4 из ткани тимуса/ Горюхина О.А., Мюльберг А.А., Криева М.А., Тишкина Т.Е. 1985.

4. D'Anna J.A., Isenberg I. A histone cross-complexing pattern// Biochemistry. - 1974. - Vol. 13, N 24. - P. 4992-4997.

5. Добрецов Г. Е. , Горюхина О.А., Борщевская Т.А. Состояние полярных групп и агрегация гистонов в водных растворах// Биохимия. - 1969. - Т. 34, вып. 4. - С. 806-809.

6. Sarantonis E.G., Diamandis E.P., Karayannis M.I. Kinetic study of the reaction between trinitrobenzenesulfonic acid and amino acids with a trinitrobenzenesulfonate ion-selective electrode// Anal. Biochem. - 1986. - Vol. 115, N 1. - P. 129-134.

7. Патент N 843915 РФ. Способ получения суммарного гистона из животного сырья// Горюхина О.А., Миглиниеце М.П., Криева М.А., БИ N 25. - 1981. - С. 102.

8. Weber K., Osborn M. The reliability of molecular weight determination by dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis// J. Biol. Chem. - 1969. - Vol. 224, N 16. - P. 4406-4412.

9. Panyim S., Chalkley R. High resolution acrylamide gel electrophoresis of histones// Arch. Biochem. Biophys. - 1969. - Vol. 130, N 1-2. - P. 337-346.

Изобретение относится к медицине, в частности к лекарственным препаратам, содержащим белковые вещества, и способам их получения, а именно природным катионным белкам из ткани тимуса телят - гистонам. Сущность изобретения состоит в получении природного комплекса катионных белков, содержащего гистоны Н2А, Н2В, Н3, Н4 из ткани тимуса телят, которые образуют устойчивые в растворе гетерогенные по молекулярной массе конъюгаты белков, образованные ковалентно связанными между собой по свободным аминогруппам лизина гистонами, а также способы их получения с помощью сшивающего агента при рН, температуре и времени инкубации реакционной смеси для полной модификации доступных аминогрупп белков в препарате. Техническим результатом настоящего изобретения является создание высокоочищенного комплекса гистонов из ткани тимуса телят, обладающего стабильностью в растворах высокой ионной силы и при низких значениях рН, сохраняющего антибиотическую активность всех классов гистонов, входящих в его состав, легко проникающего через биологические мембраны, и способ получения такого комплекса. 2 с.п. ф-лы, 2 ил.

1. Комплекс природных катионных белков, содержащий гистоны Н2А, Н2В, Н3, Н4, из ткани тимуса телят, отличающийся тем, что химически перекрестно сшитые белки комплекса образуют в растворе гетерогенные по заряду и молекулярной массе конъюгаты гистонов, ковалентно связанные между собой по свободным аминогруппам лизина гистонами из ряда Н2А, Н2В, Н3, Н4 с образованием димеров и олигомеров с мол. м. не свыше 30 кДа и 70 кДа соответственно при весовом соотношении 10:1, причем молярное содержание свободных аминогрупп в исходном препарате составляет 6,7±0,1•10^-4 моль/г. 2. Способ получения комплекса природных катионных белков путем первичного растворения суммарного гистона сернокислого из ткани тимуса телят и осаждения из полученного раствора гистонов Н2А, Н2В, Н3, Н4 раствором неорганической кислоты и последующего вторичного растворения осадка и хроматографического отделения целевого продукта, последующих первичного диализа и первичной лиофилизации, отличающийся тем, что продукт, полученный после первичной лиофилизации, растворяют в растворе средней ионной силы и осуществляют ковалентное связывание белков сшивающим агентом без осаждения белков из раствора при рН, температуре и времени инкубации реакционной смеси для полной модификации доступных аминогрупп белков в препарате с образованием устойчивых в растворе конъюгатов белков с мол. м. не свыше 30 кДа и не свыше 70 кДа, причем в качестве сшивающего агента используют бифункциональный реагент, в качестве которого выбирают глутаровый альдегид в концентрации не более 0,5•10^-2 моль/л при концентрации белка в растворе не более 0,4%, а реакцию ковалентного связывания проводят при рН 7,6-7,8, температуре не более 23^oС, времени инкубации не более 30 мин, и реакцию ковалентного связывания останавливают восстанавливающим агентом, после чего осуществляют повторный диализ целевого продукта против буферного раствора низкой ионной силы, причем диализ проводят при температуре не более 10^oС в течение времени не более 24 ч против 0,01М буферного раствора рН 7,0 и целевой продукт повторно лиофилизируют.