СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ УСЛОВНО-РЕФЛЕКТОРНЫХ ЭФФЕКТОВ МИКРОВОЛН Российский патент 1995 года по МПК G09B23/28 

Изобретение относится к области экспериментальной биологии и медицины и может быть использовано при изучении влияния электромагнитных полей микроволнового диапазона на организм.

К микроволновому излучению относится электромагнитное излучение с частотой от 300 МГц до 300 ГГц (длина волны от 1 м до 1 мм) [1] Важнейшей составной частью процесса исследования микроволн с целью их гигиенической оценки и изучения механизмов действия является выявление действия микроволн на условные рефлексы [2]
Известен ряд способов выявления условно-рефлекторных эффектов микроволн. По способу [3, 4] вначале осуществляется облучение животных микроволнами, а затем у них вырабатывают условные рефлексы с пищевым [3] или электрокожным подкреплением [4] и сравнивают параметры рефлексов облученных животных и контроля.

Недостатком этих способов является отсутствие учета индивидуальных особенностей животных до облучения, что увеличивает случайную ошибку эксперимента и препятствует выявлению отличий. В то же время существует опасность формирования неоднородных экспериментальных групп и, вследствие этого, выявления ложных достоверных отличий, существующих еще до начала облучения.

По способу [5, 6, 7] у животных вырабатывают условный рефлекс с пищевым подкреплением до начала облучения, что позволяет исключить создание неоднородных групп, затем выработку условного рефлекса продолжают в процессе повторяющегося ежесуточно облучения [5, 6] или после однократного облучения [7] Для выявления эффекта сравнивают параметры облученной и контрольной групп. Этими способами для условных рефлексов с пищевым подкреплением была выявлена минимальная действующая плотность потока энергии (ППЭ) для хронического (длительного) облучения (равная 5 мкВт/см²) и однократного облучения (1000 мкВт/см²). Эти способы препятствуют выявлению ложных отличий, но не учитывают индивидуальную вариабельность животных, что увеличивает случайную ошибку эксперимента.

Общим недостатком методик с пищевым подкреплением является большая трудоемкость: они требуют многодневного обучения и постоянного поддержания уровня обученности. Так, способ [7] требует 13 недель для предварительного обучения крыс, а способ [5, 6] ежедневного доучивания крыс в течение месяцев. Этих недостатков лишены методики с электрокожным подкреплением, которые требуют нескольких сеансов для выработки рефлекса.

Способ [14] заключается в выработке условного рефлекса пассивного избегания с электрокожным подкреплением, облучение микроволнами и проверку сохранения условного рефлекса после облучения. Он требует однократного сеанса обучения и не занимает много времени, однако он не предусматривает проверку степени обученности до облучения, распределения животных в однородные группы по степени обученности и рассчитан только на однократные облучения. Эффект микроволн с использованием этого метода не был выявлен при уровне 10000 мкВт/см² [14]
Наиболее близким к предлагаемому способу является способ [8] Он включает в себя выработку условного рефлекса активного избегания с электрокожным подкреплением до начала облучения, создание однородных групп животных, осуществление облучения и последующую проверку сохранения условного рефлекса. Минимальная ППЭ действующая при длительном облучении выявлена этим способом на уровне 5 мкВт/см². При однократном воздействии микроволнами изучение условных рефлексов этим способом не проводилось. Недостатком этого способа также является отсутствие учета индивидуальных особенностей животных.

Целью изобретения является увеличение чувствительности способа выявления условно-рефлексорных эффектов микроволн за счет учета индивидуальных особенностей животных и снижения случайной ошибки эксперимента.

Указанная цель достигается тем, что обучение осуществляется до стабилизации условно-рефлекторных параметров, что позволяет выявить индивидуальные отличия животных, а условно-рефлекторный эффект выявляют путем сравнения изменений параметров относительно фоновых значений.

Способ осуществляется следующим образом.

У белых крыс исследуют двигательно-оборонительный условный рефлекс активного избегания в челночной камере собственной конструкции, состоящей из двух отсеков с токопроводящей внутренней поверхностью стенок корпуса [10] с перегородкой в виде горизонтально расположенного, свободно вращающегося вокруг своей оси вала. Камера выполнена из плексигласса. Длина камер 60 см, ширина и высота по 24 см. Пол в обоих отсеках выполнен из алюминиевых прутьев диаметром 5 мм. Пол представляет собой единую деталь с осью вращения под перегородкой камеры, поэтому перемещение крысы из одной половины камеры в другую влечет за собой качание пола и замыкание герконового контакта с той стороны, где находится животное. Расстояние между центрами прутьев 15 мм. На крышке камеры, над центром, размещен динамик.

Челночные камеры размещены в звукосветоизолирующих боксах, освещенных лампами 15 Вт, 220 В.

В качестве условного сигнала используется звуковой сигнал высотой 3 кГц, амплитудой 85 дБ, длительностью до 25 с с временем изолированного действия 4 с, подкрепляемый электрокожным раздражением, стабилизированным постоянным током с амплитудой 0,8 мА и временем сканирования 8-и соседних электродов 75 мс от системы подкрепления описанной в [11] В случае побежки животного условный сигнал отключается, безусловный (ток) предотвращается или отключается (если побежка совершается после включения электрокожного подкрепления). Интервал между пробами варьирует от 20 до 40 с (в среднем 28 с). Характеристики сигналов и структура пробы выбраны наиболее типичными для методики [4, 8, 11]
Длительность одного сеанса обучения 75 проб.

До начала облучения животные обучаются в 3 сеансах. Последний (третий) сеанс, характеризующийся стабильными параметрами условного рефлекса, считается фоновым. Стабильность параметров позволяет считать их значения индивидуальными свойствами животных. По данным фона животных распределяют в однородные группы (при этом плохо обученных крыс с УР<10 отбраковываем). Режим обучения до облучения подобран в специальных исследованиях таким образом, чтобы он занимал минимум времени, позволял выработать стабильный условный рефлекс с высоким уровнем обученности и специализации, характеристики которого сохраняются длительное время. Этот режим оптимален для устройства камер и характеристик сигналов.

После облучения микроволнами произвольной длительности в одном сеансе из 75 проб изучается сохранение условного рефлекса.

За последние 51-75-ю пробы и за весь сеанс регистрируется: общий латентный период всех реакций (ЛП), количество условных реакций (УР), средняя скорость реакции животного или работоспособность (РС), количество выпадений безусловных реакций (ВБР) отсутствие побежек животного даже при электрокожном подкреплении, количество межсигнальных реакций (МР) побежек вне действия сигналов. При наличии ВБР считают, что ЛП равен 4 с. Работоспособность животных рассчитывают по формуле
PC (Σ 10/ЛП_i)/n, где ЛП₁ латентный период i-й реакции животного; n количество учитываемых проб (25 или 75), 10 константа, введенная для удобства оперирования с целыми числами. При ЛП₁ более 4 с считаем, что РС₁ равно нулю. Регистрируемые параметры предлагались, в основном, ранее для челночных камер при изучении микроволн [12] Добавлены хорошо зарекомендовавшие себя показатели работоспособности, позволяющие достичь нормального распределения преобразованным величинам латентного периода.

Кроме того, регистрируется 2 показателя, характеризующие консолидацию памятного следа: количество проб до достижения критерия обученности в 5 условных реакций подряд (П_кр) и среднюю длину серий условных реакций М_су). Серией считали появление любого количества условных реакций подряд, в том числе и одной. Если критерий обученности не достигается, величину П_кр принимают равной 80 (т.е. длина сеанса плюс 5 проб).

Для оценки достоверности отличий сравнивают средние значения параметров после облучения, как в прототипе [8] Но, кроме того, используют сравнение средних значений изменений показателей по отношению к собственным фоновым данным (3-му сеансу до облучения) и вычисляют разницу изменений для животных опытной и контрольной групп, связанных (близких) по фоновым значениям параметров, и определяют достоверность этой разницы, что позволяет уменьшить величину случайной ошибки эксперимента за счет учета индивидуальных особенностей животных.

Ход расчетов можно пояснить следующим примером (табл.1). В таблице представлены данные о величине латентного периода за весь тест (за все 75 проб) для контрольной и опытной групп до облучения (столбец 2 и 6), после облучения (столбец 3 и 7), изменения относительно фона (столбец 4 и 8) и разница изменений (столбец 9). В столбцах 1 и 5 реальные номера животных из эксперимента. Данные о животных ранжированы по величине фоновых латентных периодов. При этом в одной строке располaгaются дaнные по животным из контроля и облученной группы с одинaковым ранговым местом. Разница изменений образуется вычитанием из изменения облученного животного величины изменения контрольного расположенного на одной с ним строке, то есть с одинаковым рангом. Таким образом, учитывается индивидуальная особенность крыс, определенная до начала облучения. Для выявления эффекта микроволн производится сравнение средних латентных периодов (2,80±0,14 и 3,00±0,13), сравнение изменений (-0,11± 0,06 и 0,17±0,09) и оценка достоверности разниц изменений по критерию Стьюдента для выборок с попарно связанными вариантами (t=M/m=0,28/0,11). Средние (М), ошибки (m), количество животных (n), критерии Стьюдента (t) для каждого сравнения, число степеней свободы (f) и вероятность ошибки (Р) приведены в табл. 1. Кaк видим по величинaм изменений и рaзнице изменений выявляется увеличение лaтентного периодa рeaкции.

Кроме критерия Стьюдентa, особенно при нескольких облученных группaх, aдеквaтным является метод обрaботки изменений относительно фонa с помощью двухфaкторного дисперсионного aнaлизa при одном наблюдении на клетку таблицы [13]
Основным особенностям и эффективности методики можно привести следующие подтверждения.

Необходимость и возможность учетa индивидуaльных особенностей животных, проявляющихся в стабильных фоновых данных, доказывается наличием высокой корреляции между фоновыми значениями параметров и значениями параметров и их изменениями относительно фона, зарегистрированными через определенный временной интервал. В табл.2 приведены коэффициенты корреляции между параметрами условного рефлекса при их регистрации с интервалом в 6 мес (данные получены на 24 крысах-самцах). Следует отметить, что выпадений безусловных реакций у обученных крыс практически нет, поэтому данных по ВБР нет в таблице. Как видим, линейная связь достоверна, а при более коротких интервалах регистрации достоверность возрастает.

Оптимальный режим обучения, обеспечивающий стабильность параметров рефлекса, был подобран в следующем эксперименте.

Белых крыс-самок обучали в челночной камере с различным количеством проб в сеансе обучения: 25, 50, 75 и 100 проб, при этом было проведено 12, 6, 4 и 3 сеанса, так что при каждом режиме животных исследовали в 300 пробах (12 блоках по 25 проб). Были получены следующие результаты. Степень обученности (по количеству УР и величинам ЛП) была достоверно ниже у крыс с 25 пробами за сеанс. Специализация условного рефлекса (резкое снижение межсигнальных реакций до стабильного уровня в блоках по 25 проб) начиналась для крыс с количеством проб 50/сеанс с 4-го сеанса, 75 и 100/сеанс с 3-го. То есть для обучения с количеством проб по 50/сеанс достаточно 4 сеансов, по 75 и 100 3 сеансов. Три сеанса предпочтительнее, так как требуется меньше дней работы, а из них меньше проб требует режим с 75 пробами на сеанс.

Эффективность способа доказывается следующими данными. При исследовании микроволн было проведено 538 сравнений различных параметров контрольной и облученной групп. При этом при использовании метода выявления отличий применяемого в аналогах и прототипе (то есть по средним после воздействия) получено 11 достоверных (Р<0,05) отличий, при сравнении изменений 40, при сравнении разностей изменений 60, а при применении предлагаемого метода (то есть всех 3 способов сравнения) 73. Это в 6,5 раз больше, и отличие в чувствительности высоко достоверно (Р<0,001) по критерию кси-квадрат.

Эффективность способа доказывается также и путем сравнения с данными литературы. Минимальная ППЭ микроволн, которая вызывала условно-рефлекторные изменения при хроническом облучении, составляла 5 мкВт/см² [5, 6, 8] а при однократном облучении 1000 мкВт/см² [7] Предлагаемый метод выявил пороговую ППЭ микроволн на уровне 10 мкВт/см²при однократном воздействии, то есть на 2 порядка ниже, чем известно по литературе [7] и близко к хроническим порогам. Это тем более убедительно, что все пороги установлены для близких частот 2375-3000 МГц.

П р и м е р 1. Обученных белых беспородных крыс-самцов массой 280-360 г облучали однократно в течение 30 мин с ППЭ 10 мкВт/см²импульсно-прерывистыми микроволнами (частота 3000 МГц, прямоугольная модуляция 400 Гц, длительность импульса 2 мкс, излучалась пачка из 4 импульсов каждые 3,75 с). Исследование условных рефлексов выявило угнетение рефлексов непосредственно после облучения (табл.3). Этот эффект выявлен на уровне на 2 порядка ниже, чем обнаруживали до сих пор при кратковременном воздействии.

П р и м е р 2. Обученных белых крыс-самцов линии Фишер-344 массой 170-325 г облучали однократно в течение 7 ч с ППЭ 1000 мкВт/см²микроволнами непрерывной генерации (частота 2450 МГц). Условный рефлекс регистрировали через 1 и 4 сут после облучения (табл.4).

Выявлено отсутствие эффекта через 1 сут и так называемая "отсроченная" активация через 4 сут, проявившаяся в увеличении работоспособности. Эти данные полностью совпадают с отсроченной активацией, выявленной в те же сроки и при тех же режимах облучения с помощью методики регистрации двигательной активности [9]
П р и м е р 3. Обученных белых крыс-самцов линии Фишер-344 массой 170-325 г облучали однократно в течение 0,5 и 6 ч с ППЭ 1000 мкВт/см²микроволнами непрерывной генерации (частота 2450 МГц). Условный рефлекс регистрировали непосредственно после облучения (табл.5). Выявили типичную фазность для воздействий разных длительностей активацию при малой длительности и угнетение при большей длительности. Изменения демонстрируются на примере параметра работоспособности.

Таким образом, предлагаемый способ обеспечивает высокую чувствительность к микроволнами и низкую трудоемкость.

Способ успешно апробирован в Республиканском научном гигиеническом центре Минздрава УССР при выполнении НИР ВН.14.01.0034.86.

Источники информации
1. Radiofrequency and microwaves: Environmental Health Criteria 16/World Health Organization. Geneva, WHO. 1981. 134 p.

2. Холодов Ю. А. Реакции нервной системы на электромагнитные поля. М. Наука, 1975. 207 с.

3. Behavioral effects of prolonged exposure to 0.5 mW/cm², 2450 MHz microwawes/D'Andrea J.A. DeWitt J.R. Gandi O.P. et al.//Bioelectromagnetics. 1985. Vol. 7, N1. P.45-56.

4. Руднев М.И. Навакатикян М.А. и Артюх В.П. Поведенческие и биохимические параметры состояния организма белых крыс при месячном микроволновом облучении. Гигиена и санитария, 1988, N 5, c. 33-35.

5. Думанский Ю.Д. Сердюк А.М. и Лось И.П. Влияние электромагнитных полей радиочастот на человека. Киев: Здоровье, 1975. 159 с.

6. Ершова Л. К. и Думанский Ю.Д. Физиологические изменения центральной нервной системы животных при хроническом воздействии непрерывных СВЧ-полей. Гигиена населенных мест. Респ. межвед. сб. вып. 14 Киев: Здоровье, 1975. с. 89-92.

7. Thomas J.R. Maitland G. Microwaves radiation and dextroamphetamine: Evidence of combined effects on behavior of rats//Radio Science. 1979. Vol. 14, N 6S. P. 253-258.

8. Навакатикян М.А. Изменение активности и условнорефлекторной деятельности белых крыс в период хронического микроволнового облучения и после него. Радиобиология, 1988, т.28, N 1. c. 120-125.

9. Навакатикян М.А. и Ногачевская С.И. Эффект отсроченной поведенческой активации при однократном микроволновом воздействии. Радиобиология, 1988, т. 28, N 2, с. 281-283.

10. Авторское свидетельство СССР N 1600700, кл. А 61 В 5/16, 1990.

11. Навакатикян М.А. и Роде И.Г. Устройство для подкрепления стабилизированным током со сканированием электродов. Журнал высшей нервной деятельности, 1988, т.38, N 3, с. 571-573.

12. Навакатикян М.А. Сравнительная информативность параметров оборонительного условного рефлекса. Гигиена и санитария, 1981, N 5, с. 38-40.

13. Закс Л. Статистическое оценивание. М. Статистика, 1976, 598 с.

14. Навакатикян М.А. Некоторые параметры поведения белых крыс при действии микроволнового облучения. Материалы 5-го сов.-амер. рабочего совещания по проблеме: "Изучение биологического действия физических факторов окружающей среды". Киев, 1987, с. 129-135.

Использование: экспериментальная биология и медицина, изобретение может быть использовано при изучении влияния электромагнитных полей микроволнового диапазона на организм. Целью изобретения является увеличение чувствительности способа. Сущность изобретения: у животных вырабатывают оборонительный условный рефлекс активного избегания в челночной камере до воздействия микроволн, распределяют животных в однородные группы, осуществляют воздействие микроволнами и последующую проверку сохранения условного рефлекса. Обучение осуществляется до стабилизации условно-рефлекторных параметров, а условно-рефлекторный эффект выявляют путем сравнения изменений параметров относительно фоновых значений. 5 табл.

СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ УСЛОВНО-РЕФЛЕКТОРНЫХ ЭФФЕКТОВ МИКРОВОЛН, включающий обучение оборонительному условному рефлексу активного избегания в челночной камере до воздействия микроволн, распределение животных в однородные группы, осуществление воздействия микроволнами и последующую проверку сохранения условного рефлекса контрольной и облученной групп, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа, обучение осуществляется до стабилизации условно-рефлекторных параметров, а условно-рефлекторный эффект выявляют путем сравнения изменений параметров относительно фоновых значений.