ПЕПТИД, ОБЛАДАЮЩИЙ НЕЙРОТРОПНЫМИ СВОЙСТВАМИ Российский патент 2012 года по МПК C07K14/00 

Изобретение относится к биотехнологии и энзимологии. Представлен новый пептид FRWGPGP, обладающий нейротропными свойствами.

Одним из активно исследуемых классов эндогенных пептидных регуляторов являются АКТГ/МСГ-подобные пептиды, объединяемые в настоящее время термином меланокортины (МК). Исследования эффектов этих пептидов, проводившиеся на протяжении последних 40 лет, показали, что спектр физиологической активности этих пептидов очень широк. МК вовлечены в регуляцию памяти и внимания, эмоционального статуса, полового и пищевого поведения, болевой чувствительности и ряда других физиологических функций [1]. К семейству МК относятся адренокортикотропный гормон (АКТГ) и меланоцит-стимулирующие гормоны (α-, β- и γ-МСГ), а также фрагменты этих гормонов и их синтетические аналоги. Общей последовательностью для всех МК является АКТГ_6-9 - FRWG. Эта последовательность может быть расположена в различных участках пептидной молекулы гормонов. Она необходима для связывания со всеми известными типами рецепторов МК [2]. Особый интерес представляет способность АКТГ и МСГ, а также их фрагментов, лишенных гормональной активности, ускорять обучение животных и улучшать сохранение выработанных навыков. Наиболее активным из исследованных пептидов является АКТГ_4-10. Наименьшим фрагментом АКТГ, сохраняющим ноотропную активность, является АКТГ_4-7. Однако также было показано, что фрагмент АКТГ_7-10 обладает незначительной ноотропной активностью. Удлинение молекулы до АКТГ_7-16 приводит к увеличению активности до уровня, сопоставимого с АКТГ_4-7 и АКТГ_4-10 [3, 4].

Исследования показали, что МК играют важную роль в регуляции эмоционального состояния животных. Однократное введение AKTГ_1-24, α-МСГ и АКТГ_4-10 приводит к повышению тревожности животных [5, 6]. Было высказано предположение, что анксиогенные свойства природных МК определяет наличие в структуре пептида последовательности АКТГ_7-10 [7]. Однако эти же пептиды при хроническом введении снижали у крыс агрессивность, вызванную изолированным размещением [8]. Для оценки роли фрагментов АКТГ в регуляции тревожности необходимы дальнейшие исследования.

Накопленные в настоящее время данные позволяют заключить, что последовательность АКТГ включает в себя несколько сайтов, которые могут активировать различные рецепторы, вызывая при этом широкий спектр физиологических эффектов.

Недостатком большинства природных пептидных регуляторов, в том числе фрагментов АКТГ, является кратковременность их эффектов. Так, длительность действия наиболее эффективного природного фрагмента - АКТГ_4-10 составляет 30-60 мин [9]. Существует препарат Семакс, который сохраняет ноотропное действие природного прототипа, при этом длительность его эффектов составляет 20-24 час [10]. В настоящее время Семакс используется в медицине в качестве ноотропного и нейропротекторного препарата. Эксперименты на животных показали, что однократное введение Семакса оказывает нормализующее воздействие на эмоциональное состояние, а при хроническом введении препарат проявляет анксиолитическую активность [11, 12]. Однако на сегодняшний день по-прежнему существует необходимость в пептидах, обладающих ноотропным действием природного прототипа с пролонгированным временем действия и специализированных для различных стрессовых ситуаций, так как возможны разные поведенческие эффекты новых аналогов фрагментов АКТГ, содержащих в своей структуре природную последовательность и обогащенных пролином PGP.

Изобретение проиллюстрировано следующими рисунками и примерами.

Рис.1. Влияние Семакса и FRWGPGP на выработку пищедобывательного рефлекса в Т-образном лабиринте. Пептиды вводили ежедневно и/н в дозе 0.05 мг/кг за 15 мин до обучения. 1 - контрольные животные, 2 - группа животных, получавших Семакс, 3 - группа животных, получавших FRWGPGP. В каждой группе по 30 крыс. Отличия опыта от контроля отмечены * (р<0.05) и & (р<0.10).

Рис.2. Влияние Семакса и FRWGPGP на выработку условного рефлекса пассивного избегания болевого раздражителя. Пептиды вводили и/н в дозе 0.05 мг/кг за 15 мин до обучения. В каждой группе по 20 крыс. Обозначения такие же, как на рис.1.

Рис.3. Влияние Семакса и FRWGPGP на поведение крыс в тесте "приподнятый крестообразный лабиринт" в условиях низкой стрессорной нагрузки. Пептиды вводили и/н в дозе 0.05 мг/кг за 15 мин до тестирования. В каждой группе по 20 крыс. Отличия опыта от контроля отмечены * (р<0.05) и & (р<0.10), от группы с введением Семакса # (р<0.05). Обозначения такие же, как на рис.1.

Рис.4. Влияние Семакса и FRWGPGP на поведение крыс в тесте "приподнятый крестообразный лабиринт" в условиях повышенной стрессорной нагрузки. Пептиды вводили и/н в дозе 0.05 мг/кг за 15 мин до обучения. В каждой группе по 20 крыс. Обозначения такие же, как на рис.1.

Пример 1

Исследования проводились на самцах нелинейных белых крыс массой 200-250 г. Животных содержали в стандартных условиях вивария со свободным доступом к пище и воде и соблюдением 12-часового светового режима дня. Изучалось влияние пептида AKTT_7-10-PGP (FRWGPGP) на способность к обучению и уровень тревожности крыс. В качестве вещества сравнения использовали препарат Семакс. Вещества вводили интраназально в дозе 0.05 мг/кг в водном растворе из расчета 0.1 мл/кг массы тела за 15 мин до эксперимента. Контрольным животным вводили эквивалентный объем дистиллированной воды. Все использованные пептиды синтезированы в Секторе регуляторных пептидов ИМГ РАН.

Выработку условного пищедобывательного рефлекса проводили в Т-образном лабиринте (размер рукавов лабиринта - 30×10 см; размер стартовой камеры - 20×10 см). За сутки до начала эксперимента животных подвергали пищевой депривации. В последующие 4 дня животное помещали в лабиринт по 5 раз подряд ежедневно, причем длительность каждой посадки не превышала 3-х мин. В дни опыта животных кормили один раз в сутки через час после обучения. Вещества вводили перед каждым сеансом обучения. Ежедневно регистрировали: количество выполненных реакций (КВР, число заходов в подкрепляемый отсек и съедания подкрепления), латентный период (ЛП, время выхода из стартового отсека); количество ошибок (число заходов в неподкрепляемый отсек лабиринта).

Оценку способности животных к обучению проводили также в тесте выработки условного рефлекса пассивного избегания болевого раздражителя. Обучение проводилось в экспериментальной камере (30×22×35 см), разделенной перегородкой с отверстием на два отсека: один - ярко освещенный, другой - затемненный. Камера устанавливалась на решетчатый металлический пол, подсоединенный к источнику тока. В первый день эксперимента животное помещали в освещенный отсек камеры и регистрировали ЛП перехода в темный отсек, в котором крысу подвергали неизбегаемому удару электрическим током длительностью 3 сек. Напряжение подбиралось индивидуально для каждого животного по вокализации (в диапазоне 60-90 В), частота составляла 50 Гц, длительность - 10 мсек. После отключения тока крысу оставляли в затемненном отсеке на 20 секунд. Через 72 часа проводили проверку выработки навыка пассивного избегания болевого раздражителя. Животное на 3 мин помещали в светлый отсек камеры и регистрировали суммарное время, проведенное в светлом отсеке, и число заходов в темный отсек. Препараты вводили в первый день до сеанса обучения.

Уровень тревожности животных оценивали в тесте "Приподнятый крестообразный лабиринт" (ПКЛ). Экспериментальная камера лабиринта состоит из четырех расходящихся из центра рукавов (длина 35 см, высота стенок 20 см). Два противоположных рукава закрыты с торцов стенками; два других открыты. Лабиринт устанавливали на высоте 50 сантиметров от пола. Эксперимент проводился в двух модификациях: (1) - при однородном слабом освещении (низкая стрессорная нагрузка); (2) - закрытые рукава затемнены, открытые ярко освещены (высокая стрессорная нагрузка). Крысу помещали в центр лабиринта и в течение 3 мин регистрировали следующие показатели: общее время нахождения на свету; количество заходов в открытые и закрытые рукава; количество свешиваний с открытых рукавов лабиринта; число стоек (подъемов на задние лапы).

Обработка результатов производилась с помощью пакета статистических программ "Statistica". Определялись внутригрупповые средние и разбросы. Отличия между группами оценивались с помощью однофакторного ANOVA метода и непараметрического критерия χ². Данные на рисунках представлены в виде среднего ± стандартная ошибка среднего. Отличия считали достоверными при р<0.05.

Исследование влияния аналогов фрагментов АКТГ на выработку условного пищедобывательного рефлекса на место в Т-образном лабиринте показало, что введение Семакса приводит к достоверному увеличению количества выполненных реакций в 3-4-й дни обучения по сравнению с контролем (рис.1). Введение FRWGPGP приводило к увеличению КВР в 3-4-й дни обучения относительно контрольных значений.

В качестве модели обучения с отрицательным подкреплением использовали тест выработки условного рефлекса пассивного избегания болевого раздражителя. Было показано, что введение Семакса и FRWGPGP приводит к увеличению общего времени, проведенного в светлом отсеке камеры (рис.2), а также к снижению числа заходов в темный отсек при проверке воспроизведения навыка. Следовательно, пептид улучшает обучение в данном тесте.

Пример 2

Исследовались влияние аналога фрагментов АКТГ на уровень тревожности животных в различных экспериментальных условиях. В тесте ПКЛ при однородном неярком освещении (т.е. в ситуации пониженной стрессорной нагрузки) введение Семакса не приводило к значимому изменению регистрируемых показателей (рис.3). В группе крыс, получавших FRWGPGP, наблюдалось достоверное увеличение количества стоек и заходов в закрытые рукава относительно контрольных значений. Кроме того, у животных этой группы было зарегистрировано значимое увеличение числа стоек и тенденция к возрастанию количества заходов в закрытые рукава (р<0.10) относительно групп крыс, получавших Семакс. Полученные данные свидетельствуют об увеличении исследовательской активности животных, получавших FRWGPGP.

Увеличение стрессорной нагрузки в тесте ПКЛ (яркое освещение открытых рукавов лабиринта) приводит к возрастанию у животных реакции тревоги и страха (рис.3 и 4). Сравнение параметров поведения крыс контрольных групп в тесте ПКЛ в различных экспериментальных условиях показало, что увеличение стрессорной нагрузки приводит к достоверному снижению времени, проведенного на освещенной части лабиринта, числа свешиваний и заходов в открытые рукава (р<0.0001). При этом параметры, отражающие уровень исследовательской активности - число стоек и заходов в закрытые рукава, значимо не изменяются (р>0.15).

При изучении влияния аналога фрагментов АКТГ на поведение крыс в тесте ПКЛ в условиях повышенной стрессорной нагрузки было показано, что введение FRWGPGP приводит к увеличению времени, проведенного на свету, числа свешиваний и заходов в открытые рукава лабиринта (рис.4). При этом изменения числа стоек и заходов в закрытые рукава отмечено не было. Следовательно, в условиях повышенной стрессорной нагрузки пептид вызывает снижение уровня тревожности животных.

Проведенные эксперименты показали, что аналог фрагментов АКТГ - FRWGPGP улучшает воспроизведение рефлекса пассивного избегания болевого раздражителя. Т.е. улучшает обучение животных в тесте с отрицательным подкреплением.

Способность животных к выработке как пищедобывательных, так и оборонительных рефлексов зависит от баланса оборонительной и исследовательской мотиваций. Поэтому при анализе механизмов ноотропных эффектов различных препаратов необходимо учитывать их влияние на исследовательское поведение и уровень тревожности животных. Введение FRWGPGP приводило к снижению тревожности животных в стрессогенных условиях. Однако этот пептид в отличие от Семакса стимулировал исследовательскую активность крыс в условиях незначительной стрессорной нагрузки.

Таким образом, аналог FRWGPGP, содержащий последовательность АКТГ_7-10, положительно влияет на обучение с отрицательным подкреплением.

На основании проведенных экспериментов можно заключить, что аналог фрагментов АКТГ - FRWGPGP улучшает обучение животных и приводит к возрастанию исследовательской активности под действием пептида. В условиях, провоцирующих реакцию тревоги и страха, пептид оказывает анксиолитическое действие.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Starowicz К., Przewlocka В. // Life Sci. 2003, v.73(7). P.823-847.

2. Cain J.P., Mayorov A.V., Cai M. et al. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2006. V.16(20). P.5462-5467.

3. De Wied D. // Behavioural Brain Res. 1997. V.83. p.83-90.

4. De Wied D., De Kloet E.R. // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1987. V.512. P.328-337.

5. Kokare D.M., Chopde C.T., Subhedar N.K. // Neuropharmacology. 2006. V.51 (3). P.536-545.

6. File S.E., Seth P. // Eur. J. Pharmacol. 2003. V.463. P.35-53.

7. Wolterink G., van Ree J.M., van Nispen J.W. // Life Sci. 1991. V.48. P.155-161.

8. De Wied D. // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1993. V.680. P.20-28.

9. Ashmarin I.P., Nezavibatko V.N., Levitskaya N.G. et al. // Neurosci. Res. Comm. 1995. V.16. P.105-112.

10. Ашмарин И.П., Незавибатько В.Н., Мясоедов Н.Ф. и др. // Ж. ВНД. 1997, т.47, с.426-436.

11. Левицкая Н.Г., Виленский Д.А., Себенцова Е.А. и др. // Известия Академии наук 2010(2), с.231-237.

12. Виленский Д.А., Левицкая Н.Г., Андреева Л.А. и др. // Рос. физиол. журн. им. И.М.Сеченова. 2007, т.93(6), с.661-669.

13. Левицкая Н.Г., Себенцова Е.А., Глазова Н.Ю. и др. // ДАН. 2000 т.372(2). С.268-271.

Изобретение относится к биотехнологии. Описан пептид FRWGPGP, обладающий нейротропными свойствами. Изобретение расширяет спектр нейротропных средств. Использование пептида улучшает обучение животных и приводит к возрастанию их исследовательской активности. 4 ил., 2 пр.

Пептид FRWGPGP, обладающий нейротропными свойствами.