СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ КОГНИТИВНЫХ НАРУШЕНИЙ У БЕЛЫХ КРЫС Российский патент 2014 года по МПК A61B5/16 G09B23/28 

Изобретение относится к области медицины, конкретно к экспериментальной медицине, и может быть использовано для изучения когнитивных показателей белых крыс в норме и при патологии различного генеза.

Известны способы оценки показателей когнитивных функций путем тестирования экспериментальных животных в тестах «радиальный лабиринт», «лабиринт Морриса», «Т-лабиринт» [2, 5]. Особенностью данных методов является длительный период обучения животных, составляющий в среднем от 8-ми до 15-ти дней и больше.

Наиболее близким способом изучения когнитивных показателей животных (прототип) является способ изучения особенностей высшей нервной деятельности, заключающийся в выработке условного питьевого рефлекса в Т-образном лабиринте [3]. Однако данный способ является достаточно трудоемким и для выработки условного рефлекса у животных требуется продолжительный период времени (10 дней). При планировании экспериментального исследования возникает необходимость предварительной оценки когнитивного потенциала животных, которая позволит расширить или, напротив, сузить набор экспериментальных методов исследования в дальнейшем.

Задачей, решаемой данным изобретением, является разработка способа выявления когнитивных нарушений у белых крыс, позволяющего снизить трудоемкость и временные затраты на проведение эксперимента.

Поставленная задача достигается тем, что проводят тестирование белых крыс в «открытом поле»: в течение 3 минут регистрируют следующие показатели: суммарная длительность актов «локомоции», «обнюхивания», «сидит»; число вертикальных стоек; число актов «фризинг». Рассчитывают прогностические коэффициенты по формулам:

F₁=-20,94+0,28×a₁+0,20×a₂+0,28×a₃+1,23×a₄+0,47×a₅,

F₂=-28,02+0,03×a₁+0,39×a₂+0,39×a₃+4,15×a₄+2,08×a₅,

где F₁ и F₂ - прогностические коэффициенты, a₁ - суммарная длительность акта «обнюхивания» (с), a₂ - суммарная длительность акта «сидит» (с), a₃ - суммарная длительность акта «локомоции» (с), a₄ - число вертикальных стоек, a₅ - число актов «фризинг».

Если F₁ больше F₂, делают заключение об отсутствии когнитивных нарушений у экспериментальных животных, а при F₂ больше F₁ - делают заключение о наличии когнитивных нарушений у экспериментальных животных и определяют степень их выраженности с помощью прогностического индекса (ПИ), который рассчитывают по формуле:

$$ПИ=\frac{1}{1+e^{-(F2-F1)}},$$

где e - основание натурального логарифма (2,72…).

Если ПИ больше 0,5 и меньше 0,64, степень выраженности когнитивных нарушений определяют как низкую, при ПИ больше 0,65 и меньше 0,84 - как среднюю, при ПИ больше 0,85 - как высокую.

Новым в предлагаемом изобретении является то, что по результатам тестирования в «открытом поле» по показателям двигательной и ориентировочно-исследовательской активности и тревожности можно выявлять наличие у данных особей нарушений когнитивных функций, таких как способность к обучению и пространственной ориентации, а также нарушение процессов рабочей памяти. К тому же при вычислении прогностического индекса определяется степень выраженности когнитивных нарушений у животных.

Авторами не найдено в проанализированной литературе способа выявления когнитивных нарушений у белых крыс по показателям их поведения в «открытом поле».

Сравнение предлагаемого изобретения с существующими способами оценки когнитивных способностей белых крыс показало, что впервые предложено устанавливать наличие и оценивать степень нарушения когнитивных функций у крыс путем регистрации показателей их поведения в тесте «открытое поле».

Таким образом, заявленное изобретение соответствует критериям изобретения «Новизна» и «Изобретательский уровень», так как оно явным образом не следует для специалиста из уровня техники. Предлагаемое изобретение соответствует критерию «Промышленная применимость», так как оно может использоваться в экспериментальной медицине, физиологии, патологической физиологии, фармакологии для выявления когнитивных показателей животных и при планировании дизайна экспериментальных исследований.

В многочисленных исследованиях метод «открытое поле» используется для оценки состояния центральной нервной системы животных [1, 4]. Регистрируемые в данном тесте показатели поведения характеризуют ориентировочно-исследовательское поведение (обнюхивания), двигательную активность (локомоции, сидит) и тревожность (фризинг). Ориентировочно-исследовательская активность, как проявление высшей нервной деятельности, представляет собой один из важнейших типов поведения, благодаря которому животные получают знания об окружающей среде и демонстрируют элементарную рассудочную деятельность. В фармакологии повышение локомоторной и ориентировочно-исследовательской активности животных экспериментальных групп при сравнении с контролем указывает на наличие возможного ноотропного эффекта у исследуемых соединений [4, 5]. В то же время для оценки таких показателей когнитивных функций животных, как рабочая память, способность к обучению и пространственной ориентации, необходимо проведение дополнительных исследований с использованием стандартных методик, таких как условный рефлекс активного и пассивного избегания (УРПИ и УРАИ), Т-образный лабиринт, радиальный лабиринт, водный лабиринт Морриса и т.п.

Эксперимент проводили на беспородных крысах в количестве 140 особей массой 180-240 г, полученных из собственного питомника Ангарского филиала ФГБУ «ВСНЦ ЭЧ» СО РАМН. Тестирование белых крыс проводили с использованием установки «открытое поле», представляющую собой круглую арену диаметром 97 см, с высотой стенок - 42 см, диаметром отверстий в полу - 2 см. Наблюдение производили в течение 3 минут с регистрацией следующих показателей: суммарная длительность актов «локомоции», «обнюхивания», «сидит»; число вертикальных стоек; число актов «фризинг».

Полученные результаты исследований обработаны с использованием ППП Statistica 6.0. (критерии Манна-Уитни, дискриминантный анализ, лиц №AXXR004E642326FA).

Таблица 1 позволяет сделать выводы относительно статистической значимости каждой из зависимых переменных, входящих в построенную модель. В данном случае все исследуемые переменные оказывают весьма значимое влияние на зависимую переменную (p<0,05). Уровень значимости для модели составил 0,0001.

Таблица 1 Показатели информативности признаков, включенных в линейные дискриминантные функции Переменная в модели Лямбда Уилкса F p-уровень Суммарная длительность «обнюхиваний» 0,42 44,64 0,00001 Суммарная длительность «сидит» 0,41 41,37 0,0001 Суммарная длительность «локомоции» 0,27 12,01 0,001 Число вертикальных стоек 0,26 10,18 0,0026 Число акта «фризинг» 0,24 7,36 0,0091

Для подтверждения когнитивного статуса белых крыс проводили оценку рабочей памяти, способности к обучению, пространственной ориентации и навигационному научению при тестировании в радиальном лабиринте и водном лабиринте Морриса.

В таблице 2 представлены результаты тестирования животных в «открытом поле», «радиальном лабиринте», водном лабиринте Морриса (данные представлены в виде медианы и интерквартильного размаха).

Таблица 2 Показатели тестирования животных в «открытом поле», «радиальном лабиринте», водном лабиринте Морриса, Me (LQ; UQ) Показатели Варианты исследования   Группа №1 «острая пренатальная гипоксия» Группа №2 «хроническая пренатальная гипоксия» Группа №3 «толуол» Группа №4 «контроль»   Открытое поле   Суммарная длительность «обнюхивания», с 46 (38; 51,5) 31 (25; 37)* 32,5 (28; 39) 52 (42; 71) Число вертикальных стоек 4 (2; 6) 2,5 (1; 4)* 5 (4; 6) 4 (3; 6) Суммарная длительность «локомоций», с 64 (21; 79)* 77 (62; 95) 97 (88; 106)* 73 (61; 92) Суммарная длительность «сидит», с 46 (23; 85)* 43 (23; 56)* 5 (4; 6) 16 (7,5; 26) Число актов «фризинг» 2 (1; 4)* 1 (1; 2)* 1 (0; 2) 1 (0; 1)   Радиальный лабиринт Число ошибок рабочей памяти (последний сеанс тестирования) 0 (0; 0,5) 0,5 (0; 1)* 0 (0; 0,5) 0 (0; 0) Число последовательно посещенных рукавов (последний сеанс тестирования) 3,5 (3; 4) 2 (3; 3)* 3 (3; 4) 4 (3; 4)   Водный лабиринт Морриса Латентный период поиска скрытой платформы, с 68,5 (40,5; 78,0)* 59,5 (46,3; 72,8)* 51,3 (37-73,5)* 42,7 (31,8; 61,5) Примечание: * - различия статистически значимы по сравнению с контролем при p<0,05; число животных в каждой группе - 35

Пример 1.

Белая крыса, подвергавшаяся хронической пренатальной гипоксии. При обследовании в тесте «открытое поле» выявлены числовые значения показателей:

a₁ - суммарная длительность акта «обнюхивания» - 32,5 с,

a₂ - суммарная длительность акта «сидит» - 23 с,

a₃ - суммарная длительность акта «локомоции» - 109,7 с,

a₄ - число вертикальных стоек - 0,

a₅ - число актов «фризинг» - 1.

Вычисляем прогностические коэффициенты F₁ и F₂ по формулам:

F₁=-20,94+0,28×32,5+0,20×23+0,28×109,7+1,23×0+0,47×1=23,63,

F₂=-28,02+0,03×32,5+0,39×23+0,39×109,7+4,15×0+2,08×1=27,26.

F₂ больше F₁, ПИ=0,97.

Заключение: наличие у данной особи когнитивных нарушений высокой степени выраженности. Результаты тестирования в водном и радиальном лабиринтах показали, что у данного животного показатели когнитивных способностей значительно снижены по сравнению с группой контроля. Так, латентный период поиска скрытой платформы в водном лабиринте у данной особи составил 61,9 с, что значительно выше среднего показателя группы контроля (42,7 (31,8; 61,5) с. При обучении в радиальном лабиринте число ошибок рабочей памяти (2 ошибки) в последний сеанс обучения у данной особи превышало показатель контрольной группы 0 (0; 0). Число последовательно посещенных подкрепляемых рукавов лабиринта у данной особи (2) было значительно ниже показателей контрольной группы 4 (3; 4) (табл.2).

Пример 2.

Белая крыса, подвергавшаяся ингаляционному воздействию толуола. При обследовании в тесте «открытое поле» выявлены числовые значения показателей:

a₁ - суммарная длительность акта «обнюхивания» - 55 с,

a₂ - суммарная длительность акта «сидит» - 19,5 с,

a₃ - суммарная длительность акта «локомоции» - 79,7 с,

a₄ - число вертикальных стоек - 1,

a₅ - число актов «фризинг» - 3.

Вычисляем прогностические коэффициенты F1 и F2 по формулам:

F₁=-20,94+0,28×55+0,20×19,5+0,28×79,7+1,23×1+0,47×3=23,09;

F₂=-28,02+0,03×55+0,39×19,5+0,39×79,7+4,15×1+2,08×3=23,12.

F₂ больше F₁, ПИ=0,51.

Заключение: наличие у данной особи когнитивных нарушений низкой степени выраженности. Обследование в водном и радиальном лабиринтах подтвердило наличие когнитивных нарушений у данного животного. У данной особи наблюдалось повышение латентного периода поиска скрытой платформы в водном лабиринте, составившего 57,2 с и значительно превышавшего средний показателя группы контроля (42,7 (31,8; 61,5) с. При обучении в радиальном лабиринте выраженных нарушений рабочей памяти выявлено не было (табл.2).

Пример 3.

Белая крыса, подвергавшаяся острой пренатальной гипоксии. При обследовании в тесте «открытое поле» выявлены числовые значения показателей:

a₁ - суммарная длительность акта «обнюхивания» - 57 с,

a₂ - суммарная длительность акта «сидит» - 23 с,

a₃ - суммарная длительность акта «локомоции» - 85 с,

a₄ - число вертикальных стоек - 1,

a₅ - число актов «фризинг» - 2.

Вычисляем прогностические коэффициенты F₁ и F₂ по формулам:

F₁=-20,94+0,28×57+0,20×23+0,28×85+1,23×1+0,47×2=25,34,

F₂=-28,02+0,03×57+0,39×23+0,39×85+4,15×1+2,08×2=24,56.

F₂ больше F₁, ПИ=0,68.

Заключение: наличие у данной особи когнитивных нарушений средней степени выраженности. При тестировании в водном и радиальном лабиринтах были подтверждены полученные результаты. У данного животного наблюдалось повышение латентного периода поиска скрытой платформы в водном лабиринте (69,1 с) и числа ошибок рабочей памяти при обучении в радиальном лабиринте (3) по сравнению со средними показателями группы контроля (табл.2).

Пример 4.

Белая крыса из контрольной группы. При обследовании в тесте «открытое поле» выявлены числовые значения показателей:

a₁ - суммарная длительность акта «обнюхивания» - 59,2 с,

a₂ - суммарная длительность акта «сидит» - 27,9 с,

a₃ - суммарная длительность акта «локомоции» - 73,2 с,

a₄ - число вертикальных стоек - 0,

a₅ - число актов «фризинг» - 1.

Вычисляем прогностические коэффициенты F1 и F2 по формулам:

F₁=-20,94+0,28×59,2+0,20×27,9+0,28×73,2+1,23×0+0,47×1=21,95,

F₂=-28,02+0,03×59,2+0,39×27,9+0,39×73,2+4,15×0+2,08×1=15,68.

F₁ больше F₂.

Заключение: отсутствуют когнитивные нарушения у данной особи. Тестирование в водном и радиальном лабиринтах подтвердило полученные результаты. Нарушений способности к навигационному научению и изменений процессов пространственной и рабочей памяти не наблюдалось. Показатели когнитивных способностей данной особи - латентный период поиска скрытой платформы (35 с), число ошибок рабочей памяти (0) и число последовательно посещенных подкрепляемых рукавов радиального лабиринта в последний сеанс тестирования (4) - находились в пределах средних показателей контрольной группы (табл.2).

Таким образом, предлагаемый способ менее трудоемок и требует меньше времени на проведение эксперимента.

Литература

1. Обучение в водном лабиринте Морриса самок и самцов крыс, подвергавшихся воздействию гипоксии в различные сроки пренатального периода развития / О.И. Ватаева [и др.] // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. - 2005. - Т.41, №6. - С.530-533.

2. Самотруева М.А. Экспериментальные модели поведения / М.А. Самотруева, Д.Л. Теплый, И.И. Тюренков // Естественные науки. - 2009. - №2. - С.140-152.

3. Першина О.В., Суслов Н.И., Литвиненко В.И., Попова Т.П. Влияние экстракта из надземной части Scutellaria baicalensis Georgi на выработку и воспроизведение условного питьевого рефлекса у интактных животных и животных с алкогольной интоксикацией // Растительные ресурсы. - 2000. - Вып.2. - С.120-124.

4. Иванов Д.Г. Взаимосвязь уровня метаболизма коллагена и поведения крыс в тесте «открытое поле» / Д.Г. Иванов, В.Г. Подковкин // Успехи современного естествознания. - 2010. - №5. - С.16-20.

5. Подковкин В.Г. Влияние краткосрочной изоляции на поведение крыс в тесте «открытое поле» / В.Г. Подковкин, Д.Г. Иванов / Успехи современного естествознания. - 2009. - №6. - С.12-16.

Изобретение относится к области медицины, конкретно к экспериментальной медицине. Осуществляют однократное тестирование белых крыс в установке «открытое поле». Регистрируют суммарную длительность актов «локомоции», «обнюхивания», «сидит», число вертикальных стоек и актов «фризинг». По математическим формулам определяют прогностические коэффициенты F₁ и F₂ с последующим сравнением их величин. При F₂ больше F₁ констатируют наличие когнитивных нарушений у экспериментальных животных, при F₁ больше F₂ - их отсутствие. После этого рассчитывают прогностический индекс (ПИ), с помощью которого определяют степень выраженности когнитивных нарушений: низкая, средняя, высокая. Способ позволяет выявить наличие у крыс нарушений когнитивных функций за счет использования показателей двигательной и ориентировочно-исследовательской активности и тревожности. 1 з.п. ф-лы, 2 табл., 4 пр.

1. Способ выявления когнитивных нарушений у белых крыс, заключающийся в изучении поведения животных, отличающийся тем, что поведение животных исследуют в тесте «открытое поле», в течение трех минут регистрируют суммарные длительности актов «обнюхивание», «сидит», «локомоция», число акта «фризинг» и число вертикальных стоек, определяют прогностические коэффициенты F₁ и F₂ по формулам:
F₁=-20,94+0,28×a₁+0,20×a₂+0,28×a₃+1,23×a₄+0,47×a₅,
F₂=-28,02+0,03×a₁+0,39×a₂+0,39×a₃+4,15×a₄+2,08×a₅,
где F₁ и F₂ - прогностические коэффициенты, a₁ - суммарная длительность акта «обнюхивания» (с), a₂ - суммарная длительность акта «сидит» (с), a₃ - суммарная длительность акта «локомоции» (с), a₄ - число вертикальных стоек, a₅ - число актов «фризинг», и при F1 больше F2, делают заключение об отсутствии когнитивных нарушений у экспериментальных животных, а при F2 больше F1 констатируют наличие когнитивных нарушений у экспериментальных животных.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что при наличии когнитивных нарушений у экспериментальных животных оценивают степень их выраженности по формуле:
$$ПИ=\frac{1}{1+e^{-(F2-F1)}}$$ ,
где ПИ - прогностический индекс,
е - основание натурального логарифма (2,72…),
F₁ и F₂ - прогностические коэффициенты,
при ПИ больше 0,5 и меньше 0,64 степень выраженности когнитивных нарушений определяют как низкую, при ПИ больше 0,65 и меньше 0,84 - как среднюю, при ПИ больше 0,85 - как высокую.