Церебропротекторное средство Российский патент 2018 года по МПК A61K31/352 A61P25/28 

Изобретение относится к медицине, конкретно к клинической фармакологии, и может быть использовано для фармакологической коррекции заболеваний ЦНС, и касается лекарственных средств, обладающих церебропротекторным действием, получаемых из растительного сырья.

Коррекция нарушений высших интегративных функций мозга, развивающихся энцефалопатии и сосудистой деменции представляет актуальную проблему для медицины. Полноценное функционирование клеток и глиальных элементов ЦНС, поддержание в них адекватного церебрального кровотока является важнейшим условием нормальной жизнедеятельности человека. Ишемические нарушения вызывают каскад биохимических процессов, включающих нарушения мембранной целостности и ионного транспорта, прогрессирующий протеолиз, расстройства функционального взаимодействия нейромедиаторов, индукцию апоптоза, что приводит к гибели популяции нервных клеток. Современную стратегию терапии подобных изменений невозможно представить без церебропротекции [1-4].

Несмотря на разнообразие средств, обладающих церебропротекторным действием, существующие лекарственные препараты этого класса имеют недостаточную эффективность, вызывают побочные эффекты. Известным церебропротекторным средством является пирацетам, для которого характерна невысокая эффективность и побочные эффекты (нарушение сна, повышение судорожной готовности, общее стимулирующее действие) [4-6].

Особый интерес в терапии функциональных нарушений нервной системы представляют средства растительного происхождения, обладающие выраженным фармакотерапевтическим действием и низкой токсичностью.

Техническим результатом данного изобретения является расширение арсенала средств растительного происхождения, обладающих церебропротекторной активностью.

Технический результат достигается благодаря применению в качестве средства, обладающего церебропротекторным действием, изокверцитрина формулы

Новым является то, что впервые в качестве средства, обладающего церебропротекторным действием, используют изокверцитрин.

В литературе отсутствуют данные о средстве, обладающем церебропротекторным действием и содержащем изокверцитрин.

Применение изокверцитрина по предлагаемому назначению стало возможным благодаря выявлению его новых свойств в эксперименте, а именно способности улучшать функции ЦНС за счет церебропротекторного действия.

Новые свойства изокверцитрина явным образом не вытекают из уровня техники в данной области и неочевидные для специалиста. Впервые установлено, что в качестве средства, обладающего церебропротекторным действием, можно использовать изокверцитрин.

Идентичной совокупности признаков не обнаружено в патентной и научно-медицинской литературе.

Предлагаемое средство с успехом может быть использовано в практическом здравоохранении для коррекции заболеваний ЦНС.

Исходя из вышеизложенного, следует считать предлагаемое изобретение соответствующим условиям патентоспособности «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».

Изобретение будет понятно из следующего описания.

Получение изокверцитрина, обладающего церебропротекторным действием, осуществляют путем экстракции растительного сырья (напр., растений рода Atragene L., Filipendula Mill.., Alfredia Cass.), фракционирования полученного экстракта органическими растворителями, хроматографического разделения фракции и выделения флавонола изокверцитрина.

Пример 1

Надземную часть княжика сибирского собирали в фазу цветения - начала плодоношения. Высушенное воздушным способом сырье измельчали и просеивали через сито с диаметром отверстий 2-3 мм (влажность 11,3%). Экстракт получали обработкой измельченной надземной части растения 70% этанолом на водяной бане с обратным холодильником в течение 2 ч при температуре 80°C и соотношении сырье-экстрагент 1:12. Полученные извлечения объединяли, фильтровали и упаривали в вакууме при температуре не выше 60°C. Полученный экстракт (выход 21,7%) растворяли в воде (1:4) и исчерпывающе экстрагировали в делительной воронке последовательно хлороформом и этилацетатом. Полученную этилацетатную фракцию упаривали в вакууме (выход 15%). Разделение этилацетатной фракции осуществляли методом адсорбционной колоночной хроматографии на силикагеле (L 100/250) при соотношении 1:7. Элюирование проводили последовательно хлороформом, смесью хлороформ-этанол (с увеличением градиента последнего, 98:2→80:20) и этанолом. При элюировании смесью хлороформ-этанол 88:12 в индивидуальном состоянии получили вещество - ярко-желтый мелкокристаллический порошок, т.пл. 238-239°C (этанол-ацетон 1:20), растворим в этаноле, метаноле, мало растворим в ацетоне, не растворяется в хлороформе и воде. Выход 0,03 г. УФ-спектр (C₂H₅OH), λ_max, нм: 257, (303), 363. ИК-спектр (KBr), ν_max, см^-1: 1019, 1059, 1080, 1088 (пиранозное кольцо), 1267 (C-O-C), 1503, 1566, 1606 (C₆H₆), 1657 (аромат. C=O γ-пиронового цикла), 3346 (OH). На пластинке Silufol UV-254 в системе растворителей этилацетат - муравьиная кислота-вода (8:1:1) и на бумаге FN-4 в 30% растворе уксусной кислоты вещество проявляется в виде пятна с R_f 0,50 и 0,60 соответственно. В УФ-свете - темное пятно, с AlCl₃ и ванилин-фосфорным реактивом - желтое, диазореактивом - оранжевое окрашивание. В продуктах кислотного гидролиза (5% H₂SO₄, 100°C, 2 ч) методом хроматографии в тонком слое и на бумаге обнаружили кверцетин и D-глюкозу. В спектре HMBC сигнал атома С-3 (133,4 м.д.) имеет кросс-пик с аномерным протоном молекулы глюкозы (5,46 м.д.). На основании физических, спектральных и хроматографических характеристик в сравнении со стандартным образцом вещество идентифицировали как 3-O-β-D-глюкопиранозид 3',4',3,5,7-пентагидроксифлавона (изокверцитрин).

Фармакологические испытания проводили на аутбредных крысах-самцах CD (I категории, согласно сертификату) массой 200-220 г. Животные получены из отдела экспериментальных биологических моделей «Научно-исследовательского института фармакологии и регенеративной медицины имени Е.Д. Гольдберга» Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук». Эксперименты осуществляли в зимний период. Работы в рамках экспериментальных методик выполняли с 9 до 15 ч. Животных содержали в стандартных условиях вивария на обычном рационе кормления (за исключением тех случаев, где иные условия оговариваются особо) в соответствии с правилами, принятыми Европейской Конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и научных целей (г. Страсбург, 1986).

Фармакологические эффекты изокверцитрина оценивали по влиянию на выработку и воспроизведение сложного условного питьевого рефлекса у животных в условиях модели Т-образного лабиринта после ишемии головного мозга, а также конфликтной ситуации [7-9, 11-12].

Изокверцитрин и препарат сравнения вводили животным курсом ежедневно в течение семи дней однократно через зонд в желудок в виде раствора в воде очищенной за 1 ч до тестирования. Интактные животные получали эквивалентное количество воды очищенной. В качестве препарата сравнения использовали экстракт корня шлемника байкальского Scutellaria baicalensis Georgi сухой, содержащий флавоноиды (байкалеин, байкалин, вогонин, вогонозид) и обладающий церебропротекторным действием (препарат сравнения) [10].

Полученные экспериментальные данные обрабатывали статистически. О достоверности различий судили методом проверки вероятности нулевой гипотезы с использованием t критерия Стьюдента и критерия Вилкоксона. Различия считали достоверными при p≤0,05.

Пример 2.

Изучение влияния изокверцитрина на выработку и воспроизведение сложного условного питьевого рефлекса у животных проводили в шестизвенном Т-образном лабиринте в условиях экспериментальной модели ишемии головного мозга [7]. Опыты выполняли на крысах на фоне водной депривации. Лабиринт представляет собой установку, состоящую из одной стартовой камеры и двух систем коридоров, каждая из которых включает в себя по 3 Т-образных колена, спирально соединенных между собой и заканчивающихся целевыми камерами. Предварительно крыс оставляли без воды на одни сутки. Затем в течение 2 дней каждую крысу дважды в день на 20 мин с интервалом в 1 ч индивидуально помещали в лабиринт, где беспорядочно расставляли 6 поилок (первый этап обучения). На третий день животное помещали в стартовую камеру лабиринта, при этом все поилки из последнего убирали. Крыса начинала искать поилку, выходила из стартовой камеры и делала первый поворот в правую или левую часть лабиринта. Направление первого поворота фиксировали и считали предпочтительным направлением поворота для данного животного. Немедленно вслед за этим в целевую камеру, находящуюся в половине лабиринта, противоположной той, в которую крыса повернула в первый раз, ставили поилку. При всех последующих побежках поилку ставили для данной крысы именно в эту целевую камеру. Это делали для того, чтобы при становлении условного рефлекса исключить влияние предпочтительного направления поворота на процесс обучения. Каждое животное тестировали в лабиринте таким образом в течение 15 мин, если оно не находило поилку раньше. Если животное не находило поилки в течение 15 мин, его помещали в целевую камеру, чтобы крыса могла напиться. Крыс, отказавшихся искать поилку в течение первых 4 побежек, из дальнейших экспериментов исключали. В тот же день животное через 1 ч совершало вторую побежку. Таким образом, каждую крысу обучали в течение 4 дней (2 этап обучения - 5-8 побежки и 3 этап обучения - 9-12 побежки). При этом регистрировали: продолжительность питья, характеризующую силу питьевой мотивации [8], время достижения поилки, количество ошибок (заходы в неправильные рукава лабиринта и тупики), количество вертикальных стоек и груминг. Выделяли также периоды полной неподвижности продолжительностью более 15 с, которые расценивали как фризинговые реакции. Их общую продолжительность регистрировали в качестве самостоятельного показателя. О качестве обучения судили по сокращению времени достижения поилки и количества ошибок. Груминг и вертикальные стойки характеризовали смещенную и ориентировочно-исследовательскую активность, соответственно. Отказ от поиска поилки, после двух успешных ее нахождений, отказ от питья после успешного обнаружения поилки оценивали как проявление невротической реакции [9], которое оценивали в виде отношения общего количества невротических реакций к общему числу побежек. Об эффекте веществ судили по усредненной разнице показателей 9-12 побежек между опытной и контрольной группами на протяжении третьего этапа обучения. Введение изокверцитрина и препарата сравнения начинали с момента лишения животных воды (всего 7 введений). Экспериментальную ишемию вызывали путем полной перевязки под гексобарбиталовым наркозом левой сонной артерии и ограничения кровотока в правой сонной артерии на 50% путем частичной перевязки. Операцию выполняли за 48 ч до первой побежки в лабиринте. Контролем служили ложнооперированные животные.

Экспериментальная ишемия привела к существенному ухудшению выработки рефлекса, что выразилось в увеличении времени достижения поилки, количества ошибок, а также груминга и числа невротических реакций. Курсовое введение изокверцитрина в условиях модели Т-образного лабиринта на фоне экспериментальной ишемии головного мозга снижает время достижения поилки, число ошибок, невротических реакций и смещенную активность (груминг). Результаты проведенного экспериментального исследования свидетельствуют о том, что изокверцитрин, способствуя улучшению выработки у животных условного питьевого рефлекса со сложной ориентировкой, проявляет церебропротекторную активность (табл. 1), превосходя эффект препарата сравнения по выраженности нормализующего влияния на показатели побежек (время достижения поилки, число ошибок и невротических проявлений, груминг), характеризующих качество выработки питьевого рефлекса после экспериментальной ишемии мозга.

Примечания: * - различия достоверны в отношении интактного контроля, ^# - различия достоверны в отношении контроля-ишемии.

Пример 3.

Изучение влияния изокверцитрина на выработку и воспроизведение условного питьевого рефлекса со сложной пространственной ориентировкой в норме и при его нарушении конфликтной ситуацией проводили в шестизвенном Т-образном лабиринте [7, 9]. Опыты выполняли на крысах на фоне водной депривации. Лабиринт представлял собой установку, состоящую из одной стартовой камеры и двух систем коридоров, каждая из которых включает в себя по 3 Т-образных колена, спирально соединенных между собой и заканчивающихся целевыми камерами. Предварительно крыс оставляли без воды на одни сутки. Затем в течение 2 дней каждую крысу дважды в день на 20 мин с интервалом в 1 ч индивидуально помещали в лабиринт, где беспорядочно расставляли 6 поилок (первый этап обучения, побежки 1-4). На третий день животное помещали в стартовую камеру лабиринта, при этом все поилки из последнего убирали. Крыса начинала искать поилку, выходила из стартовой камеры и делала первый поворот в правую или левую часть лабиринта. Направление первого поворота фиксировали и считали предпочтительным направлением поворота для данного животного. Немедленно вслед за этим в целевую камеру, находящуюся в половине лабиринта, противоположной той, в которую крыса повернула в первый раз, ставили поилку. При всех последующих побежках поилку ставили для данной крысы именно в эту целевую камеру. Это делали для того, чтобы при становлении условного рефлекса исключить влияние предпочтительного направления поворота на процесс обучения. Каждое животное тестировали в лабиринте таким образом в течение 15 мин, если оно не находило поилку раньше. Если животное не находило поилки в течение 15 мин, его помещали в целевую камеру, чтобы крыса могла напиться. Крыс, отказавшихся искать поилку в течение первых 4 побежек, из дальнейших экспериментов исключали. В тот же день животное через 1 ч совершало вторую побежку. Таким образом, каждую крысу обучали в течение 2 дней (2 этап обучения - 5-8 побежки), затем в процессе обучения делали перерыв в 5 дней, во время которого моделировали конфликтную ситуацию так, как это будет описано ниже. После этого следовал третий этап выработки рефлекса в Т-образном лабиринте, продолжавшийся 3 дня (9-14 побежки). При обучении в лабиринте регистрировали: продолжительность питья, характеризующую силу питьевой мотивации [8], время достижения поилки, количество ошибок (заходы в неправильные рукава лабиринта и тупики), количество вертикальных стоек и груминг. Выделяли также периоды полной неподвижности продолжительностью более 15 с, которые расценивали как фризинговые реакции. Их общую продолжительность регистрировали в качестве самостоятельного показателя. О качестве обучения судили по сокращению времени достижения поилки и количества ошибок. Груминг и вертикальные стойки характеризовали смещенную и ориентировочно-исследовательскую активность, соответственно. Отказ от поиска поилки, после двух успешных ее нахождений, отказ от питья после успешного обнаружения поилки оценивали как проявление невротической реакции [9], которое оценивали в виде отношения общего количества невротических реакций к общему числу побежек. Об эффекте веществ судили по усредненной разнице показателей 11-14 побежек между опытной и контрольной группами на протяжении третьего этапа обучения. Дополнительно оценивали индекс условно-рефлекторной деятельности (ИУРД) как интенсивность двигательной активности, направленной на достижение поилки (горизонтальные перемещения в лабиринте в единицу времени). Введение изокверцитрина и препарата сравнения начинали с момента лишения животных воды (всего 13 введений).

Конфликтную ситуацию моделировали путем столкновения двух рефлексов: питьевого условного рефлекса и безусловного рефлекса избегания электроболевого раздражения [11, 12]. Животное в течение 4 сут на 20 мин ежедневно помещали в пластиковую камеру размерами 30×40×20 см, в одной из торцевых стенок которой была устроена ниша с поилкой, где крыса могла напиться. При этом происходила выработка питьевого рефлекса в конфликтной камере. В день регистрации крысу помещали в камеру и между металлическим полом камеры и электродом, опущенным в поилку, создавали разность потенциалов в 80 Вт. Таким образом, производили сшибку рефлекса: при попытке взятия воды животное получало удар током. Дополнительными показателями, характеризующими условно-рефлекторную и эмоциональную активность, служили число подходов к поилке, горизонтальные перемещения по клетке, число вертикальных стоек. Каждое животное наблюдали индивидуально в течение 20 мин. Изокверцитрин и препарат сравнения вводили, начиная с первого дня обучения.

В эксперименте формировали 7 групп животных по 8 особей в каждой.

1 Группа интактного контроля - животные, у которых вырабатывали только условный питьевой рефлекс в Т-образном лабиринте.

2 Группа «ложного конфликта» - животные, которых после завершения второго этапа обучения помещали в камеру конфликтной ситуации и вырабатывали питьевой рефлекс в новых условиях, однако сшибки рефлекса на пятый день не проводили.

3 Группа «ложный конфликт + изокверцитрин, 1 мг/кг» - животные, получавшие изокверцитрин в дозе 1 мг/кг, которых после завершения второго этапа обучения помещали в камеру конфликтной ситуации, сшибки рефлекса на пятый день не проводили.

4 Группа «ложный конфликт + препарат сравнения, 50 мг/кг» - животные, получавшие препарат сравнения в дозе 50 мг/кг, которых после завершения второго этапа обучения помещали в камеру конфликтной ситуации, сшибки рефлекса на пятый день не проводили.

5 Группа «контроль-конфликта» - животные, получавшие воду, которым после завершения второго этапа обучения вырабатывали питьевой рефлекс в камере конфликтной ситуации и проводили сшибку рефлекса на 5 день.

6 Группа «конфликт + изокверцитрин, 1 мг/кг» - животные, получавшие изокверцитрин в дозе 1 мг/кг, которым после завершения второго этапа обучения вырабатывали питьевой рефлекс в камере конфликтной ситуации и проводили сшибку рефлекса на 5 день.

7 Группа «конфликт + препарат сравнения, 50 мг/кг» - животные, получавшие препарат сравнения в дозе 50 мг/кг, которым после завершения второго этапа обучения вырабатывали питьевой рефлекс в камере конфликтной ситуации и проводили сшибку рефлекса на 5 день.

Проведенные исследования показали, что в условиях выработки и воспроизведения условного питьевого рефлекса со сложной пространственной ориентировкой в Т-образном лабиринте процедура ложного конфликта умеренно, но статистически значимо увеличивает время достижения поилки, что вероятно связано с воздействием дополнительной обстановочной афферентации конфликтной ситуации. Как препарат сравнения, так и изокверцитрин не оказывают значимого влияния на поведение животных при формировании ложного конфликта (табл. 2).

Перенесенная конфликтная ситуация привела к ухудшению выработки рефлекса: достоверно возросло время достижения поилки, число ошибок и доля невротических реакций, снизились продолжительность питья и индекс условно-рефлекторной деятельности (табл. 2). Изокверцитрин способствует нормализации показателей побежек крыс, характеризующих качество выработки питьевого рефлекса, после перенесенной конфликтной ситуации. Так, курсовое введение вещества достоверно уменьшает латентное время питья, количество ошибок и невротических реакций, одновременно увеличивает количество питья и его продолжительность, индекс условно-рефлекторной деятельности. Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что изокверцитрин улучшает выработку рефлекса, усиливает питьевую мотивацию, проявляет противоневротические свойства, а, кроме того, оказывает положительное влияние на состояние интегративных механизмов, контролирующихся эмоциональной системой достижения цели. Таким образом, за счет церебропротекторного эффекта изокверцитрин способствует изменениям в мотивационной сфере животных, активируя аппетитивное и консуматорное поведение. В проведенном эксперименте препарат сравнения достоверно повышал продолжительность питья и снижал число ошибок, но не оказывал значимого влияния на другие показатели. Влияние изокверцитрина на показатели обучения животных, перенесших конфликтную ситуацию, оказалось более выражено в сравнении с таковым препарата сравнения. Таким образом, изокверцитрин превосходит препарат сравнения по положительному влиянию на условно-рефлекторную деятельность животных при ее нарушении в результате перенесенной конфликтной ситуации.

Примечания: * - различия достоверны в отношении интактного контроля; # - различия достоверны в отношении контроля-конфликта.

Таким образом, изокверцитрин проявляет выраженный церебропротекторный эффект.

Таким образом, при изучении влияния изокверцитрина на выработку и воспроизведение сложного условного питьевого рефлекса у животных в условиях модели Т-образного лабиринта после ишемии головного мозга, а также конфликтной ситуации установлено его выраженное церебропротекторное действие, превосходящее эффективность препарата сравнения (экстракт корня шлемника байкальского Scutellaria baicalensis Georgi сухой, содержащий флавоноиды) по уровню нормализующего влияния на показатели побежек (снижение времени достижения поилки, числа ошибок и невротических проявлений, груминга; увеличение количества и продолжительности питья, индекса условно-рефлекторной деятельности), которые характеризуют качество выработки питьевого рефлекса после перенесенных ишемии головного мозга или конфликтной ситуации.

На основании проведенных экспериментальных исследований можно сделать вывод о том, что применение изокверцитрина является перспективным для получения более высокого лечебного эффекта.

Технический результат достигнут благодаря использованию изокверцитрина в качестве церебропротекторного средства, что позволило расширить арсенал средств растительного происхождения, обладающих церебропротекторным действием, с повышенной терапевтической эффективностью.

Литература

1. Rogalewski A., Schneider A., Ringelstein E.R. et al. Toward a multimodal neuroprotective treatment of stroke // Stroke. - 2006. - Vol. 37. - P. 1129-1136.

2. Островая Т.В., Черний В.И. Церебропротекция в аспекте доказательной медицины // Медицина неотложных состояний. - 2007. - Т. 9, №2. - С. 48-52.

3. Карпов Ю.А. Церебропротекция при лечении больных с высоким риском сердечнососудистых осложнений // Русский медицинский журнал. - 2008. - №21. - С. 1423-1428.

4. Машковский М.Д. Лекарственные средства. - М.: Новая Волна, 2005. - С. 405-409.

5. Воронина Т.А., Молодавкин Г.М., Островская Р.У. и др. Ноотропные и анксиолитические свойства разных доз пирацетама // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2000. - Т. 63, №2. - С. 9-11.

6. Малин Д.И. Побочное действие психотропных средств. - М.: Вузовская книга, 2000. - С. 108-128.

7. Азарашвили А.А. Исследование механизмов памяти с помощью физиологически активных соединений. - М.: Наука. - 1981. - 198 с.

8. Мак-Фарленд Д. Поведение животных. Психобиология, этология и эволюция / Пер. с англ. - М.: Мир, 1988. - С. 416-417.

9. Суслов Н.И. Патогенетическое обоснование психофармакологических эффектов препаратов природного происхождения (экспериментальное исследование): Дисс. докт. мед. наук. - Томск, 1995. - С. 98-100.

10. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Литвиненко В.И. и др. Шлемник байкальский. Фитохимия и фармакологические свойства. - Томск: Изд-во Томского ун-та, 1994. - С. 151-180.

11. Клыгуль Т.А., Кривопалов В.А. Установка с автоматической регистрацией поведения крыс для оценки действия малых транквилизаторов // Фармакология и токсикология. - 1966. - №2. - С. 241-244.

12. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / под ред. Р.У. Хабриева. - 2-изд., перераб. и доп. - М.: Медицина, 2005. - С. 255-256.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к церебропротекторному средству. Применение изокверцитрина формулы

в качестве средства, обладающего церебропротекторным действием. Вышеописанное средство расширяет арсенал средств растительного происхождения, обладающих церебропротекторной активностью, и является эффективным. 2 табл., 3 пр.

Применение изокверцитрина формулы

в качестве церебропротекторного средства.