СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА, ОБЛАДАЮЩЕГО СВОЙСТВАМИ КОСТНОГО МОЗГА Российский патент 1995 года по МПК A61K35/14 A61K35/28 

Изобретение относится к биологии, в частности к обработке и консервированию крови и костного мозга. Предлагаемый способ может быть положен в основу производства препаратов, необходимых для лечения людей и животных, пораженных лучевой болезнью, и заменяющих костный мозг, получаемый в настоящее время от доноров.

В современной биологии апробированы и внедрены в практику способы длительного консервирования костного мозга при умеренно низких и ультранизких температурах в консервирующих глицериносодержащих средах.

Известны способы обработки и консервации живых клеток, включая костный мозг, глубоким замораживанием под защитой криопротекторов со скоростью замораживания 0,1-0,2 сек до температуры минус 196^оС (авт.св. N 1144673, N 1192828, кл. A 61 K 35/16 и др.). Это наиболее современные и совершенные способы консервирования, позволяющие хранить костный мозг длительное время (до 20 лет).

Однако все известные способы сложны и трудоемки, требуют дорогостоящего оборудования и не позволяют осуществить взятие на хранение достаточно большого количества костного мозга. Кроме того, при трансфузии костного мозга в большинстве случаев требуется подавление иммунологической реакции реципиента.

Биокриогенным способам присущи и другие недостатки:
требуется обязательное наличие жидкого азота, что в значительной степени ограничивает региональное применение этих способов;
приживаемость криоконсервированного костного мозга, как известно, весьма ограничена;
диглицеризация размораживаемых клеток костного мозга также является сложным и трудоемким процессом, сдерживающим применение криогенного консервирования.

В качестве прототипа рассмотрен патент РСТ/US 87/00869, A 61 K 35/28, от 15.04.87.

Принципиальной особенностью предлагаемого способа является то, что для сохранения биологической активности препарата свернувшуюся кровь промывают физраствором, выдерживают в ингибиторе нуклеаз и только после этого применяют дальнейшую обработку.

В общем виде методика получения сухого препарата представляется следующим образом.

Берут свернувшуюся кровь, отмывают от плазмы физраствором, заливают 5% -ным раствором цитрата натрия (являющегося ингибитором нуклеаз) и выдерживают порядка 12 час; центрифугируют и к полученному осадку добавляют воду; после полного гемолиза снова центрифугируют; полученный гемолизат заливают ацетоном и после встряхивания смесь центрифугируют; последнюю операцию повторяют несколько раз, меняя ацетон; затем к осадку, снова разбавленному ацетоном, добавляют чистую концентрированную соляную кислоту при непрерывном помешивании в количестве 0,1 от объема ацетона и выдерживают несколько минут, центрифугируют и полученный осадок снова несколько раз промывают ацетоном, затем отфильтровывают и просушивают. В итоге получают порошок белесо-сероватого оттенка. Он может храниться длительное время при комнатной температуре в защищенном от света контейнере.

Кроме того, имеется возможность приготовления указанного препарата индивидуального для каждого человека из его крови. В этом случае не предусматривается обработка соляной кислотой. Получаемая разновидность препарата имеет темно-вишневый цвет.

Если препарат, полученный по предлагаемой методике, смешать с раствором Рингера-Локка, то через несколько часов начинается рост клеток крови.

П р и м е р. К 0,5 мл дважды отмытой физраствором от плазмы эритроцитарной массы, полученный из свернувшейся крови, добавляется 2,5-5 мл 5%-ного раствора цитрата натрия. Оставляют стоять на 12 ч при температуре + 3-+5^оС. Центрифугируют, центрифугат отстаивают, а к осадку добавляют 3 мл воды и оставляют стоять до полного гемолиза. Снова центрифугируют, прозрачный гемолизат отсасывают. К гемолизату добавляют тройной объем ацетона, тщательно встряхивают и опять центрифугируют. Выпавший осадок дважды промывают таким же количеством ацетона с последующим центрифугированием. После третьего промывания к осадку добавляют 5,4 мл ацетона, взмучивают и по капле вливают 0,6 мл чистой соляной кислоты. Встряхивают содержание пробирки после каждой капли. Через 3-5 мин на дно выпадает насыщенно красный осадок, надосадочная жидкость имеет тот же цвет. Центрифугируют, центрифугат отсасывают, осадок несколько раз промывают ацетоном, пока надосадочная жидкость перестает окрашиваться. Фильтруют через бумажный фильтр. Осадок на фильтре еще два-три раза промывают ацетоном и высушивают на воздухе. Высушенный препарат хранят в темной стеклянной посуде с притертой крышкой.

Способность препарата к формированию клеток проводится в микрокамере под микроскопом. Для этой цели на предметное стекло кладут 2-3 крупинки препарата, на которую наносят одну-две капли раствора Рингера-Локка или физраствора и закрывают сверху покровным стеклышком, размеры которого чуть меньше предметного стекла. Предметное стеклышко слегка придавливают, чтобы под ним не было пузырьков воздуха. Для предохранения от высыхания края образовавшейся микрокамеры смазывают стерильным вазелиновым маслом с помощью стеклянной палочки. При микроскопии уже через час-два наблюдается образование эритроцитов, а еще позже клеток костного мозга и даже его пульпы, а также зачатков кровеносных сосудов по эмбриональному типу кроветворения.

Периодически проверяли жизнеспособность препарата, полученного 10 лет назад, и он не утратил своих биологических свойств к формированию клеток крови "ин витро".

Возможность получения из крови человека и животных, в том числе периферической, сухого препарата, способного к длительному хранению и обладающего при смешивании с раствором Рингера-Локка свойствами костного мозга, предоставляет медицине большие перспективы. Препарат может послужить основой для разработки нового способа лечения лучевой болезни, некоторых анемий и других заболеваний.

Изобретение относится к биологии, в частности к обработке и консервированию крови и костного мозга. Из крови выделяют сухой препарат, для получения которого берут свернувшуюся кровь, отмывают от плазмы физраствором, заливают 5% - ным раствором цитрата натрия и выдерживают около 12 ч; центрифугируют и к полученному осадку добавляют воду; после полного гемолиза снова центрифугируют, отделяют гемолизат и заливают его ацетоном; смесь центрифугируют, жидкость удаляют, а осадок еще несколько раз промывают ацетоном, центрифугируют, фильтруют и высушивают. Порошок имеет вишневый цвет. Могут изготавливаться модификации препарата, в частности без антигенных свойств, для чего до фильтрования и высушивания вышеописанного образца к осадку, снова разбавленному ацетоном, добавляют при непрерывном помешивании концентрированную соляную кислоту в количестве 0,1 от объема ацетона, выдерживают несколько минут, центрифугируют и полученный осадок снова несколько раз промывают ацетоном, отфильтровывают и просушивают. Порошок имеет белесо-сероватый цвет. При смешавании порошка с раствором, в частности Рингера-Локка через несколько часов в нем начинают формироваться клетки крови и костного мозга. 1 з.п. ф-лы.

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА, ОБЛАДАЮЩЕГО СВОЙСТВАМИ КОСТНОГО МОЗГА, путем обработки периферической крови млекопитающих, отличающийся тем, что эритроцитарную массу крови отмывают физиологическим раствором, добавляют цитрат натрия, инкубируют, центрифугируют, к осадку добавляют воду, центрифугируют, к надосадочной жидкости добавляют ацетон, осадок, содержащий целевой продукт, промывают ацетоном, фильтруют и высушивают. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что осадок после промывания ацетоном разбавляют ацетоном и добавляют концентрированную соляную кислоту.