СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИТИМОЦИТАРНОГО ГЛОБУЛИНА ДЛЯ ВНУТРИВЕННОГО ВВЕДЕНИЯ Российский патент 2005 года по МПК A61K39/395 

Изобретение относится к медицине, а именно к получению иммунобиологических лекарственных препаратов, используемых для внутривенного введения при коррекции иммунодефицитных состояний различного генеза.

Известен способ получения иммуноглобулина из биологических жидкостей путем их адсорбции на активированном угле [1].

Недостатком этого способа является малая емкость углей в отношении иммуноглобулинов и низкая избирательная способность указанного сорбента, что обеспечивает выделение не более 1% иммуноглобулинов от общего количества адсорбированного белка.

Известен также способ извлечения иммуноглобулинов из биологических жидкостей путем их пропускания через сорбенты, в качестве которых применяется макропористый сополимер стирола и дивинилбензола, содержащий группы несимметричных диметилэтилен-бис-аммониевых оснований [2].

Недостатком указанного способа является его трудоемкость и невысокая степень очистки, что не позволяет использовать препарат для внутривенного введения из-за его несоответствия современным требованиям, предъявляемым к таким препаратам.

Известен способ получения иммуноглобулинов путем фракционирования белков крови с использованием этанола [3].

Недостатком указанного способа является необходимость использования высоких концентраций этанола, создающих опасность денатурации белков, что делает необходимым проведение процесса при отрицательных температурах.

Другим недостатком этого способа является необходимость использования ионообменной хроматографии с последующей ультрафильтрацией для дополнительной очистки иммуноглобулинов от примесей балластных белков и этанола, что значительно усложняет процесс, ухудшает качество препарата и повышает его стоимость.

Наиболее близким к заявляемому изобретению является способ приготовления антилимфоцитарного глобулина, основанный на получении препарата из плазмы крови животных (например, кроликов, коз, лошадей), иммунизированных клетками вилочковой железы эмбриона человека, путем фракционирования ее риванолом для освобождения от балластных белков, последующей адсорбцией гетероагглютининов плазмы на эритроцитах АВ (IV) группы донорской крови человека и доочисткой полупродукта с использованием полиэтиленгликоля (ПЭГ) 6000 [4].

Основным недостатком этого метода является трудоемкость процесса фракционирования риванолом и необходимость дальнейшей очистки полупродукта от этого реагента.

Кроме того, в настоящее время производство риванола в России прекращено, а стоимость зарубежного реактива очень высока, что делает его малодоступным для применения в широкомасштабном производстве препарата антитимоцитарного глобулина.

Задачей данного изобретения является усовершенствование способа получения высокоочищенного ареактогенного антитимоцитарного глобулина (АТГ) для внутривенного введения в масштабах, необходимых для нужд здравоохранения.

Техническим результатом использования изобретения является разработка высокотехнологичного крупномасштабного способа получения АТГ, который полностью соответствует требованиям, предъявляемым к аналогичным препаратам для внутривенного введения и используемым для предупреждения и купирования кризов отторжения трансплантатов органов, в частности, почек, печени, а также для лечения апластической анемии, борьбы с гнойно-воспалительными состояниями и т.д.

Сущность предлагаемого способа получения АТГ для внутривенного введения заключается в том, что животных, например коз, кроликов, лошадей, иммунизируют клетками вилочковой железы эмбриона человека, выделяют плазму иммунизированных животных, проводят ее истощение человеческой плазмой АВ (IV) группы, добавляя последнюю в соотношении 20-25/1-1,5 (об/об) соответственно. Затем фракционируют белки плазмы с помощью ПЭГ 6000, удаляют из фракционированной смеси антитела к нелимфоидным антигенам последовательной обработкой смесью отмытых донорских эритроцитов и концентратом тромбоцитов четырех групп крови человека. Далее проводят очистку целевого продукта осаждением ПЭГ 6000, добавляя его до конечной концентрации 10-12% (вес/об) и проводя последующее центрифугирование. Полученный осадок белка, состоящий из иммуноглобулинов, растворяют физиологическим раствором, добавляют в качестве стабилизатора глицин, проводят осветляющую и стерилизующую фильтрацию, розлив и лиофилизацию препарата. При этом фракционирование белков истощенной плазмы производят в три этапа: на первом этапе осаждают целевой продукт ПЭГ 6000, рН 7,0-7,2, при его конечной концентрации 10-12% вес/объем, на втором этапе осажденный продукт суспендируют в дистиллированной воде и удаляют высокомолекулярные белки осаждением их ПЭГ 20000 при его конечной концентрации 2-2,5% вес/объем, рН 5,4, с последующим центрифугированием и на третьем этапе проводят повторное осаждение целевого продукта из фракционированной смеси ПЭГ 6000 при конечной концентрации 10-12% вес/объем, рН 7,0-7,2.

Способ осуществляется следующим образом. Многократно иммунизируют животных, например, коз, кроликов, лошадей, взвесью клеток вилочковой железы человека, взятой от плода человека, погибшего в результате асфиксии или родовой травмы (при первой иммунизации используют полный адъювант Фрейнда). Спустя 2 недели после последней иммунизации проводят взятие крови у животных-продуцентов с последующим отделением иммунной плазмы. К полученной плазме добавляют плазму донорской крови человека АВ (IV) группы в соотношении 20-25:1-1,5 соответственно. Затем проводят фракционирование белков истощенной плазмы в три этапа: на первом этапе осаждают целевой продукт ПЭГ 6000, рН 7,0-7,2, добавляя его до конечной концентрации 10-12% (вес/об) и проводят низкоскоростное центрифугирование при 3000 об/мин в течение 10 минут на центрифуге типа HERMLE ZK 630. Потом к суспендированному в дистиллированной воде осадку добавляют ПЭГ 20000, рН 5,4, до конечной концентрации 2-2,5% (вес/об), центрифугируют и отделяют осадок высокомолекулярных белков. На третьем этапе к надосадочной жидкости, рН которой доводят до 7,0-7,2, добавляют ПЭГ 6000 до конечной концентрации 10-12% (вес/об), проводят центрифугирование, удаляют надосадочную жидкость, растворяют осадок иммуноглобулинов в физиологическом растворе. Антитела к нелимфоидным антигенам истощают последовательно смесью эритроцитов и тромбоцитов четырех групп крови человека и центрифугируют. Целевой продукт осаждают с помощью ПЭГ 6000, добавляя его до конечной концентрации 10-12% (вес/объем). После центрифугирования при 3000-3500 об/мин в течение 10-15 минут осадок белков, представляющий собой (не менее 90%) иммуноглобулины класса G и М, растворяют физиологическим раствором, добавляют в качестве стабилизатора глицин (15-25 г/л растворенного белка), затем проводят осветляющую и стерилизующую фильтрацию, розлив и последующую лиофилизацию. Целевой продукт перед использованием растворяют в физиологическом растворе. Активность препарата в лимфоцитотоксическом тесте (ЛЦТТ) не менее 1024-2048.

Пример 1. Здоровых коз обоего пола в возрасте 1-3 года весом 18-30 кг 6-кратно иммунизируют взвесью клеток, полученных из вилочковых желез плода или трупов новорожденных детей, погибших в результате асфиксии или родовой травмы в первые дни после родов. При первой иммунизации животных антиген вводят одновременно с полным адъювантом Фрейнда. Смесь, состоящую из 2 мл взвеси клеток вилочковой железы человека в концентрации 3×10⁸ и 2 мл адъюванта, вводят животным внутримышечно по 1 мл в четыре точки. Через две недели проводят 5 последующих иммунизаций с интервалом в 3-5 дней. Каждому животному вводят по 2 мл антигена. Через две недели после последней иммунизации производят заготовку крови с гемоконсервантом, что исключает гемолиз эритроцитов. Иммунную плазму отделяют от клеток крови центрифугированием. Затем эту плазму обрабатывают плазмой донорской крови человека АВ (IV) группы в соотношении 20:1. Смесь тщательно перемешивают в течение не менее 30 минут. Затем проводят выделение и очистку целевого продукта в три этапа. На первом этапе осаждают целевой продукт ПЭГ 6000, рН 7,0-7,2, добавляя его до конечной концентрации 10% (вес/объем) и проводя низкоскоростное центрифугирование при 3000 об/мин в течение 10 минут на центрифуге типа HERMLE ZK 630. На втором этапе к осажденному продукту, суспендированному в дистиллированной воде, добавляют ПЭГ 20000 до конечной концентрации 2,5% (вес/объем), доводят рН до 5,4, центрифугируют при тех же условиях и для удаления высокомолекулярных белков. На третьем этапе к надосадочной жидкости, рН которой доводят до 7,0-7,2, добавляют ПЭГ 6000 до конечной концентрации 10% (вес/объем), проводят центрифугирование при 3000 об/мин в течение 10 минут, удаляют надосадочную жидкость, растворяют осадок иммуноглобулинов в физиологическом растворе.

Для освобождения фракционированной смеси от антител к нелимфоидным антигенам вносят последовательно смесь отмытых донорских эритроцитов и концентраты тромбоцитов четырех групп крови человека. Суспензию отмытых эритроцитов добавляют в соотношении 0,75:1 (об/об), несколько раз тщательно перемешивают. После 10-минутной экспозиции смесь центрифугируют 10 мин при 2500 об/мин при 10°С, а затем добавляют тромбоциты человека из расчета 1,75 мл/л исходной плазмы, оставляют на 30-минутный контакт при комнатной температуре и периодическом перемешивании, после чего центрифугируют 20 мин при 3900 об/мин при температуре 10°С. Надосадочную жидкость стерильно собирают и проводят выделение целевого продукта с помощью ПЭГ 6000, который вносят до конечной концентрации 11% (вес/об) при непрерывном перемешивании в течение 30 мин. Потом смесь центрифугируют в течение 10 мин при 3000 об/мин, надосадочную жидкость удаляют, а к осадку белка добавляют физиологический раствор хлористого натрия до полного растворения осадка. Содержание общего белка в полупродукте, определяемое, например, биуретовым методом, составляет 10-15 мг/мл. Затем добавляют в качестве стабилизатора глицин из расчета 20 г/л растворенного белка, доводят рН до 7,3-7,5, а потом проводят осветляющую и стерилизующую фильтрацию препарата через мембранные фильтры типа "Миллипор" с соответствующими размерами пор, розлив препарата в ампулы и его лиофилизацию.

В одной ампуле целевого продукта объемом 3-5 мл содержится 50±10 мг белка, который при контроле методом электрофореза на ацетат-целлюлозных пленках более чем на 90% состоит из иммуноглобулинов. Такая степень очистки соответствует национальным и международным требованиям, предъявляемым к иммуноглобулинам для внутривенного введения. Препарат не содержит консервантов и антибиотиков, его активность в ЛЦТТ не менее 1:1024-2048.

Пример 2. Полученный предлагаемым способом препарат АТГ (коммерческое наименование Антилимфолин) был использован для лечения больного П-ва 34 лет (история болезни №748). Диагноз: острый геморрагический панкреонекроз, обширная забрюшинная флегмона, перитонит. Сопутствующие заболевания: левосторонний гидроторакс, гидроперикард.

Несмотря на все общепринятые методы лечения, современную комплексную терапию, общее состояние больного оставалось очень тяжелым. Иммунограмма свидетельствовала о резком снижении иммунного статуса больного. На 2-е сутки после введения Антилимфолина значительно повысилась фагоцитарная активность нейтрофилов (ФАН). На 7-е сутки после применения препарата значительно повысилось (в 2-3 раза) количество иммунокомпетентных клеток, отмечалось дальнейшее повышение ФАН; наблюдалось увеличение количества иммуноглобулинов G и М. Применение Антилимфолина оказало иммуностимулирующий эффект и способствовало значительному улучшению состояния больного, который был вскоре переведен из реанимационного отделения в палату общей хирургии с последующей выпиской домой..

Пример 3. Больной К. 23 лет (история болезни №4819) поступил в клинику с жалобами на общую слабость, одышку при физической нагрузке, носовые и десневые кровотечения. На производстве имел контакт с бензольными соединениями. Анализ крови при поступлении: Hb - 47 г/л, эритроциты 1,5·10¹² /л, лейкоциты 2,6·10⁹ /л, сегментоядерные - 12% (0,312·10 /л), лимфоциты 87% (2,26·10⁹ /л), тромбоциты 6·10⁹ /л. В пунктате костного мозга: миелокариоциты 9,0·10⁹ /л, незрелые гранулоциты 7,5%, зрелые - 17,5%, лимфоциты 70,5%, эритронормобласты 4,5%. В трепанобиоптате - аплазия кроветворения. Выявлены лишь небольшие скопления эритрокариоцитов, лимфоциты и единичные сидерофаги. В иммунограмме: CD₃ ⁺CD₈ ⁺ - 47% (0,9·10⁹ /л), CD₃ ⁺CD₄ ⁺ - 40,7% (0,8·10⁹ /л), CD₂₀ ⁺ 2,5% (0,05·10⁹ /л), CD₃ ⁺CD₁₆ ⁺ - 18,6% (0,4·10⁹ /л). МДК в костном мозге: эритроидный ряд - 20%, гранулоцитарный - 40%, лимфоидный ряд - 40%. МДК в периферической крови: эритроциты - 36%, гранулоциты - 15%, лимфоциты - 30%. В течение 5 дней больной получал Антилимфолин по 15 мг/кг массы тела. Суммарная доза составила 4,62 г белка. На третий день введения препарата поднялась температура до 38°С, появились кожные петехии, усилились геморрагические проявления. Дополнительно проводилась антигистаминная терапия. В последующем была добавлена гемотрансфузионная, гемостатическая, антибактериальная терапия в связи с появившимися инфекционными осложнениями (правосторонняя пневмония, острый пиелонефрит). Через 1,5 месяца после лечения была достигнута клиническая ремиссия и больной выписан домой. Анализ крови при выписке: Hb - 86 г/л, эритроциты - 2,7·10¹² /л, лейкоциты - 3,0·10⁹ /л, сегментоядерные - 31%, лимфоциты - 65%, тромбоциты - 7,0·10⁹ /л. Геморрагических проявлений нет. Динамика показателей периферической крови и костного мозга была положительной. В течение периода наблюдения сохраняется клинико-гематологическая ремиссия. Пациент учится и работает.

ЛИТЕРАТУРА

1. Лопухин Ю.М., Молоденков М.Н. Гемосорбция. - М. - Медицина. - 1978. - С.31-34; 139-141.

2. Авторское свидетельство СССР №1121619 от 29.03.83.

3. Авторское свидетельство СССР №1403414 от 15.02.88.

4. Патент РФ №2178309 от 12.01.2000.

Изобретение относится к медицине, а именно к получению иммунобиологических лекарственных препаратов, используемых для внутривенного введения при коррекции иммунодефицитных состояний различного генеза. Способ получения антитимоцитарного глобулина для внутривенного введения заключается в иммунизации животных клетками вилочковой железы человека, выделении иммунной плазмы, истощении ее белками плазмы АВ (IV) группы крови человека, последующем фракционировании плазмы ПЭГ 6000 и 20000, истощении полупродукта клеточными компонентами смеси всех четырех групп крови человека и очистки целевого продукта с помощью ПЭГ 6000. В качестве стабилизатора используется глицин. Преимущество изобретения заключается в упрощении способа. 4 з.п. ф-лы.

1. Способ получения антитимоцитарного глобулина для внутривенного введения, включающий иммунизацию животных клетками вилочковой железы человека, истощение полученной плазмы обработкой ее человеческой плазмой АВ (IV) группы, фракционирование белков плазмы, удаление из фракционированной смеси антител к нелимфоидным антигенам последовательной обработкой смесью отмытых донорских эритроцитов и концентратом тромбоцитов четырех групп крови человека, очистку целевого продукта путем осаждения ПЭГ 6000, растворение полученных иммуноглобулинов в физиологическом растворе, добавление глицина и осветляющую и стерилизующую фильтрацию, отличающийся тем, что фракционирование белков истощенной плазмы производят в три этапа: на первом этапе осаждают целевой продукт ПЭГ 6000, рН 7,0-7,2, суспендируют осажденный продукт в дистиллированной воде и удаляют примеси низкоскоростным центрифугированием, на втором этапе из осажденного продукта удаляют высокомолекулярные белки осаждением их ПЭГ 20000, рН 5,4 и на третьем этапе проводят повторное осаждение целевого продукта из фракционированной смеси ПЭГ 6000, рН 7,0-7,2.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что осаждение целевого продукта из истощенной плазмы на первом этапе фракционирования проводят ПЭГ 6000 при конечной концентрации 10-12% вес/объем.3. Способ по п.1, отличающийся тем, что высокомолекулярные белки на втором этапе осаждают ПЭГ 20000, рН 5,4 при конечной концентрации 2-2,5% вес/объем.4. Способ по п.1, отличающийся тем, что повторное осаждение целевого продукта из фракционированной смеси на третьем этапе осуществляют при конечной концентрации ПЭГ 6000 10-12% вес/объем.5. Способ по п.1, отличающийся тем, что после стерилизующей и осветляющей фильтрации полученный антитимоцитарный глобулин подвергают лиофилизации.