СПОСОБ ПОДАВЛЕНИЯ РОСТА ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК И СРЕДСТВО ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ Российский патент 1995 года по МПК A61K38/22 G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, в частности к онкологии, и может найти применение при химиотерапии, особенно в послеоперационный период онкологических пациентов, страдающих раком печени: первичным раком печени, раком легкого и опухолями мочеполовой системы.

Предлагается новое средство, которое представляет собой комплекс доксорубицин-эстрон, растворенный в Lipiodol Ultrafluid.

Комплекс получен химическим синтезом. В качестве ближайшего аналога предлагается рассматривать комплекс дауномицин-арахидоновая кислота. Для получения комплекса дауномицин-арахи- доновая кислота, проявляющего цитотоксический эффект, осуществляют следующие операции: 10-20 мг дауномицина, содержащего 50-100 мг маннитола, химически связывает с арахидоновой кислотой посредством 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (HCl) при рН 4,4-4,7 при комнатной температуре в течение 10 ч. Реакционный объем составляет 4-6 мл. Молярное соотношение арахидоновой кислоты, 1-этил-3-(диметиламинопропил)карбодии-мида и дауномицина составляет 1,5:6:1. Процесс связывания осуществляют в 50%-ном ацетонитриле. После этого реакционную среду разводят водой до конечного объема 75 мл, доводят рН до 10-11 концентрированной NH₄OH и полученный раствор экстрагируют хлороформом для удаления синтезированного комплекса. Затем хлороформ упаривают.

Предлагаемое средство, содержащее доксорубицин-эстрон, растворенный в Lipiodol Ultrafluid, получают следующим образом.

П р и м е р 1. Комплекс доксорубицин-экстрон получали химическим синтезом при помощи взаимодействия доксорубицина с N-оксисукцинимидным эфиром экстрон 3-гемисукцината. Выход реакции составлял 42% Активированный эфир эстрон 3-гемисукцината был синтезирован из эстрон 3-гемисукцината и N-гидроксисукцинимида с помощью N,N'-дициклогексилкарбодиимида. Lipiodol Ultrafluid был получен фирмой Cuerbet Laboratories (нормативное техническая документация в России 42-1501-92, регистрационное удостоверение П-8-242 N 00803, 01.10.80). Комплекс доксорубицин-эстрон в количестве 10 мг растворяли в 10 мл Lipiodol Ultrafluid с интенсивным перемешиванием. После этого полученный раствор стерилизовали фильтрованием.

Комплекс доксорубицин-эстро представляет собой темно-красный кристаллический порошок формулы С₄₉Н₄₇О₁₅N мол.м. 895,96 и следующей химической структуры:

Предпосылками создания предлагаемого средства явились исследования доктора Конно. Им было предложено использовать для направленной доставки противоопухолевых препаратов в некоторые типы опухолевых клеток гидрофобное соединение Lipiodol Ultrafluid. Изначально Lipiodol Ultrafluid был синтезирован как контрастное вещество для рентгеновского обследования из-за высокого содержания йода. Lipiodol Ultrafluid представляет собой масло из макового семени с замещенным этиловым эфиром на эфир глицерина. Вязкость соединения при 15^оС составляет 70 снs, плотность при 15^оС 1,280. 1 г Lipiodol Ultrafluid содержит 0,38 г йодина. При внутриартериальном введении Lipiodol Ultrafluid диспергирует на мелкие жировые капли. Из-за морфологических различий между капиллярами опухолевой и нормальной тканей эти капли задерживаются в первой и быстро удаляются из второй. Например, в ткани первичного рака печени Lipiodol Ultrafluid может находиться до 3 мес. в метастазирующем раке печени, раке легкого и некоторых опухолях мочеполовой системы несколько недель. Из нормальных же тканей Lipiodol Ultrafluid выводится в среднем за 24 ч. Это свойство доктор Конно использовал для направленной доставки противоопухолевых препаратов в клетки первичного рака печени. Противоопухолевый препарат предварительно растворяли в Lipiodol Ultrafluid и затем внутриартериально вводился пациенту. Благодаря этому в опухолевые ткани лекарственный препарат проникал растворимым в жировых пузырьках, из которых происходила его медленная диффузия в окружающее пространство. Таким образом, Lipiodol Ultrafluid служил своеобразным резервуаром противоопухолевого препарата, что позволяло поддерживать относительно высокие его концентрации на протяжении нескольких месяцев. Как показали дальнейшие исследования метод Конно позволяет увеличить эффективность химиотерапевтического воздействия при терапии первичного рака печени в 2,5-3 раза по сравнению с результатами, наблюдаемыми при применении противоопухолевого препарата в свободном виде. В качестве противоопухолевых препаратов доктор Конно применял доксорубицин, митомицин С, SMANCS, акларубицин и некоторые др.

В предлагаемом способе гидрофобный растворитель Lipiodol Ultrafluid был использован для доставки в опухолевые ткани комплекса доксорубицин-эстрон. Показано, что этот комплекс способен из-за входящего в его состав эстрона эффективно взаимодействовать с белком плазмы крови альфафетопротеином, который в свою очередь по механизму рецепторного эндоцитоза направленно проникает в некоторые опухолевые, но не нормальные клетки. Этими опухолевыми клетками являются те, что сами способны секретировать альфа-фетопротеин (первичный рак печени, рак легких, желудочно-кишечного тракта, некоторые опухоли молеполовой системы, нейробластома и др.). Таким образом, была создана ситуация, когда в опухолевой ткани на длительное время достигается высокая концентрация противоопухолевого антибиотика доксорубицина и вместе с тем имеет место высокое содержание альфа-фетопротеина, способного селективно доставлять доксорубицин в комплексе с эстроном в опухолевые клетки. Кроме комплекса доксорубицин-эстрон предложенным способом в опухолевые клетки может также направленно доставляться комплекс доксорубицин-арахидоновая кислота, синтезированный доктором Дейчем.

Таким образом техническим результатом предложения является создание нового противоопухолевого средства и повышение эффективности химиотерапии, что выражается в увеличении срока ремиссии в послеоперационный период.

Ближайшим аналогом в части способа является способ химиотерапии, описанный также Дейчем. Средство и способ были получены в опытах in vitro и апробированы в условиях стационара Астраханской областной больницы. Результаты приведены в примерах 2,3,4.

П р и м е р 2. Экспериментальное изучение специфической активности комплекса доксорубицин-эстрон.

Цитотоксическую активность комплекса доксорубицин-эстрон исследовали в асцитной линии клеток крыс АН 66, которая с высокой эффективностью способна секретировать и поглощать альфа-фетопротеин. Асцитную жидкость, взятую у белых беспородных мышей-самцов на 7-й день после эксплантации опухоли, центрифугировали в течение 5 мин при 1200g, затем осадок ресуспендировали в питательной среде Игла с добавлением 5%-ной сыворотки крупного рогатого скота. В суспензию, содержащую 1000 пролиферирующих опухолевых клеток в мл среды Игла, добавляли метил-(3Н)тимидин, удельная активность 1,80х10⁶ бк/мг. Гибель опухолевых клеток определяли по ингибированию встраивания метил-(3Н)тимидина. В качестве контроля использовали свободный доксорубицин, Lipiodol Ultrafluid. Клетки АН 66 (10˙3 клеток/мл) поддерживали в среде инкубации с различным количеством комплекса доксорубицин-эстрон и доксорубицина. В среду инкубации кроме меченного метил-(3Н)тимидина вносили немеченный тимидин в конечной концентрации 10 мкг/мл. Пробы инкубировали в термостате при 37^оС в течение 3 ч. После инкубации пробы последовательно обрабатывали 10%-ной ледяной трихлоруксусной кислотой, промывали этанолом и помещали в толуоловый сцинтиллятор. Радиоактивность проб измеряли сразу после добавления предшественников к питательной среде с опухолевыми клетками. Растворы тестируемых препаратов добавляли к суспензии опухолевых клеток одновременно с меченным предшественниками. Комплекс доксорубицин-эстрон и свободный доксорубицин предварительно растворяли в гидрофобном растворителе Lipiodol Ultrafluid. Содержание альфа-фетопротеина, секре- тируемого опухолевыми клетками, составляло около 40 мкг/мл (иммуноферментный анализ с помощью наборов фирмы "АС", г.Москва, Институт морфологии человека).

На чертеже представлены полученные результаты.

Как видно, цитотоксическая активность комплекса доксорубицин-эстрон в сравнении со свободным доксорубицином в присутствии секретируемого клетками АН 66 альфа-фетопротеина в 6,8 раза выше.

П р и м е р 3. Цитостатическая активность комплекса доксорубицин-эстрон.

Исследования проводили на крысах с привитой асцитной линией АН 66, способной эффективно секретировать альфа-фетопротеин. Цитотоксическую активность комплекса доксорубицин-эстрон в сравнении со свободным доксорубицином определяли по увеличению продолжительности жизни животных и по количеству выживших животных (продолжительность жизни более 100 дней со дня инъекции клеток АН 66). В экспериментах использовали беспородных белых крыс-самок массой 130-160 г. Клетки асцитной линии АН 66 вводили внутрибрюшинно в количестве 10х4. На 4-й, 5-й и 6-й дни после этого внутривенно вводили 200 мкг доксорубицина или эквивалентное количество (по содержанию доксорубицина) комплекса доксорубицин-эстрон в Lipiodol Ultrafluid (объем растворителя 0,7 мл). В качестве контроля использовали Lipiodol Ultrafluid.

Полученные данные по влиянию комплекса доксорубицин-эстрон в сравнении с доксорубицином на рост клеток АН 66 представлены в табл.1.

Как видно из представленной табл.1 применение комплекса доксорубицин-эстрон существенно увеличивает продолжительность жизни (приблизительно в 3 раза) и количество выживших опухоленосящих животных (6 из 7 против 0 и 13) по сравнению с экспериментом, в котором терапевтическое воздействие осуществляли свободным доксорубицином.

П р и м е р 4. Клинические испытания средства.

Клинические испытания комплекса доксорубицин-эстрон проводили на пациентах с первичным раком печени в Астраханской областной больнице. Возраст пациентов составлял от 17 до 54 лет (всего 5 человек женского и мужского пола). Все пациенты были прооперированы по поводу онкологического заболевания. Контрольная группа (n= 6) проходила обычный химиотерапевтический курс. Начальная концентрация альфа-фетопротеина в плазме крови пациентов в обеих группах составляла 150-200 мкг/мл. Непосредственно перед проведением химиотерапии стерильный препарат комплекса доксорубицин-эстрон в количестве 10 мг растворяли в гидрофобном стерильном растворителе Lipiodol Ultrafluid (объем 10 мл). После этого полученный раствор стерилизовали фильтрацией (шприц емкостью 20 мл с фильтрационной насадкой 20 мкм). Раствор препарата вводили внутриартериально по методу Солдигера. Инъекции проводили 2 раза в неделю. Курс повторяли 4 раза с интервалом в 1 неделю между курсами. Полученные результаты представлены в табл.2.

Таким образом, полученный комплекс отличается повышенной цитотоксической активностью, увеличивает продолжительность жизни экспериментальных животных и увеличивает срок ремиссии в послеоперационный период.

Изобретение относится к медицине, в частности онкологии, и может найти применение при химиотерапии, особенно в послеоперациионный период онкологических пациентов, страдающих раком печени: первичным раком печени, раком легкого с опухолями мочеполовой системы. Получают химическим синтезом комплекс доксорубицин-эстрон. Растворяют его в гидрофобном растворителе Lipiodol Vlfrafluid. Проводят инъекции пациентам с первичным раком печени. Раствор препарата вводят внутриартериально. Полученный комплекс отличается повышенной цитотоксической активностью, увеличивает срок жизни и увеличивает срок ремиссии в послеоперационный период. 3 з.п. ф-лы, 1 ил., 2 табл.

1. Способ подавления роста опухолевых клеток, включающий воздействие на них химическим препаратом, отличающийся тем, что воздействие осуществляют средством, содержащим комплекс доксорубицин-эстрон, растворенный в Lipiodol ultrafluid. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что воздействие осуществляют in vitro. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что воздействие осуществляют in vitro. 4. Средство для подавления роста опухолевых клеток, отличающееся тем, что оно содержит комплекс доксорубицин-эстрон структурной формулы

растворенный в Lipiodol ultrafluid в соотношении на 10 мг комплекса 1 мл Lipiodol ultrafluid.