СПОСОБ ЗАЩИТЫ ЛИМФОИДНЫХ КЛЕТОК КРОВИ ЧЕЛОВЕКА ОТ ВИЧ Российский патент 1998 года по МПК G01N33/68 

Изобретение относится к области медицины, в частности к вирусологии. Может найти применение при профилактике СПИДа, а также при терапии пациентов, инфицированных ВИЧ.

Одной из актуальных проблем современной медицины является создание эффективных препаратов, способных предотвращать развитие симптомов иммунодефицита у инфицированных ВИЧ пациентов. В этом направлении достигнуты определенные результаты. Созданные препараты во многих случаях позволяют предотвратить развитие заболевания у инфицированных пациентов. Наиболее ярким тому примером служит создание лекарственных препаратов на основе глицирризиновой кислоты, которые препятствуют связыванию ВИЧ с клеткой-мишенью (Ito M. et al. , Ibid, 1988, 10, 289 - 298). Однако подавляющее большинство лекарств, обладающих подобной активностью, эффективны только при применении в высоких дозах (для глицирама, например, она составляет более 0,5 г ежедневно), что сопряжено с возникновением ряда побочных токсических эффектов.

Для предотвращения инфицирования здоровых клеток крови ВИЧ нами предлагается использование фетального альфа-фетопротеина (АФП) человека. Обнаружено, что этот онкофетальный белок (Abelev G.I., Tuvor Biol., 1989, 10, 63 - 74; Tatarinov Y.S. et al., Tumor Biol., 1991, 12, 125 - 130; Deutsch H.F., Adv. Cancer Res., 1989, 56, 253 - 315) способен эффективно взаимодействовать с гликопротеином gp120, входящим в состав ВИЧ и ответственным за связывание вируса с клетками-мишенями (Pharmacol Res., 1992, 26, 64 - 65; Proc. Natl. Acad. Sci USA, 1992, 15, 9434 - 9438). Таким образом, АФП препятствует этому взаимодействию и, следовательно, предотвращает инфицирование здоровых клеток.

Наиболее близким аналогом предложенному нами способу защиты нормальных клеток крови от ВИЧ следует рассматривать работу Плясуновой О.А. с соавторами (Вопр. Вирусологии, 1992, 37, 5 - 6, 120 - 125). В этой работе показано, что бета-глицирризиловая кислота in vitro обладает выраженной противовирусной активностью по отношению к штаммам ВИЧ-1 (ЭВК) и ВИЧ-2 (rot) d в культурах лимфоидных клеток МТ-4 и Н9. Эффективная противовирусная активность наблюдалась при концентрации препарата 100 - 200 мкг/мл среды.

Таким образом, результатом предложения является создание нового анти-ВИЧ препарата.

Реализация способ защиты нормальных клеток крови от ВИЧ. Для оценки противовирусной активности АФП использовали модель первично-инфицированных ВИЧ лимфоидных клеток МТ-4. Контрольные и инфицированные клетки культивировали в среде RPMI-1640 с добавлением 15% фетальной сыворотки, 300 мкг/мл L-глутамина, 100 мкг/мл гентамицина в 96-луночных культуральных планшетках при температуре 37^oC и 5% двуокиси углерода. Штамм ВИЧ-1 (ЭВК) получен из института Вирусологии им. Д.И.Ивановского (г. Москва). Инфицирование клеток МТ-4 ВИЧ-1 проводили добавлением вируса к клеточной суспензии с концентрацией 3 • 10,6 клеток/мл и множественностью заражения 0,4 - 0,6 с с последующей адсорбцией вируса в течение 40 мин при 37^oC. Инфицированные клетки культивировали с посевной концентрацией 6 • 10,5 клеток/мл в 96-луночных планшетах.

Препарат АФП получен последовательным применением ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-сефарозе, аффинной хроматографии на BrCN-сефарозе и гельфильтрации на колонке с AcA-34. Аффинная хроматография включает в себя иммуносорбцию на поликлональных антителах кролика против АФП человека, на антителах кролика против белков нормальной сыворотки человека и на антителах крысы против иммуноглобулинов кролика. Предварительную очистку проводили с помощью ионообменной хроматографии на колонке с ДЕАЕ-сефарозой, уравновешенной 0,04 М калий-фосфатным буфером, pH 6,2. Сыворотку, содержащую альфа-фетопротеин в концентрации не менее 50 мкг/мл перед нанесением на колонку разводили в три раза стартовым буфером. После нанесения сыворотки колонку промывали стартовым буферным раствором, содержащим 0,05 М хлорида натрия. Сорбировавшийся на колонке белок снимали 0,04 М калий-фосфатным буфером, содержащим 0,2 М хлористого натрия. Фракцию, содержащую АФП, концентрировали до объема 150 мл, добавляли в нее концентрированный раствор Трис-HCl (pH 8,0) до конечной концентрации 0,05 М и концентрированный раствор хлористого натрия до конечной концентрации 0,5 М. Затем эту фракцию наносили на иммуноаффинную колонку 2,6 • 6,0 см с ковалентно связанным с BrCN-активированной сефарозой CL-4B поликлональными антителами кролика против АФП человека. Перед нанесением колонку промывали сначала 0,01 М раствором HCl, затем уравновешивали буферным раствором 0,05 М Трис-HCl, pH 8,0. Скорость нанесения составляла 400 мл в час. После нанесения содержащей АФП фракции колонку промывали стартовым буфером до тех пор, пока оптическая плотность выходящего с колонки раствора не снижалась до 0,005 оптических единиц. Затем АФП снимали, пропуская через колонку 0,01 М раствор HCl. Профиль элюции контролировали спектрофотометрически, по поглощению при 280 нм. Практически весь белок сходил с колонки в интервале pH от 6 до 5. Сразу после снятия белка с колонки pH раствора поднимали до pH 8,0, добавляя концентрированный Трис-HCl буфер. Объем снятой с аффинной колонки фракции АФП составлял около 100 мл, концентрация приблизительно 1 мг/мл.

Дополнительная хроматографическая очистка. Для того, чтобы очистить выделенный АФП от возможных следовых количеств белков сыворотки или фрагментов иммуноглобулинов кролика, которые могли быть внесены на стадии аффинной хроматографии, полученная фракция наносилась последовательно на аффинную колонку с антителами кролика против белков нормальной сыворотки человека и аффинную колонку с антителами крысы против иммуноглобулинов кролика. Полученный после аффинной хроматографии белок концентрировали на концентрирующей ячейке с мембраной YM 30 до объема 5 мл и наносили на гельхроматографическую колонку с биогелем AcA-34, уравновешенную 0,005 М натрий фосфатным буфером, pH 7,5. Фракции 7 - 12 содержат незначительное количество олигомерных форм АФП. В качестве конечного продукта берут только фракции 13 - 16. Сразу после стадии гельфильтрации белок был сконцентрирован в концентрирующей ячейке с мембраной YM 30 до конечной концентрации 45 мг/мл и лиофильно высушен. Все операции производились при температуре не выше +8^oC.

Препарат АФП вносили в суспензию клеток до конечной концентрации 1 - 100 мкг/мл сразу после адсорбции вируса. Эффект препарата оценивали на 5-е сутки культивирования по активности вирусспецифичного фермента РНК-зависимой ДНК-полимеразы, содержанию вирусного антигена иммуноферментным методом и количеству живых клеток. Активность обратной транскриптазы определили как описано в работе Lee M.H. et al. (J. Clin. Microbiol., 1987, N 25, 1717 - 1720). Количество вирусных белков определяли прямым иммуноферментным методом (Жданов В.П. и др., Вопр. Вирусологии, 1988, N 3, 294 - 296).

Жизнеспособность инфицированных клеток резко возрастает даже при низких концентрациях АФП (около 1 мкг/мл), достигает максимума при концентрации препарата 8 - 10 мг/мл и затем монотонно снижается. При этом уровень вирусного антигена монотонно снижается при возрастании концентрации АФП. Иная закономерность наблюдается при воздействии АФП на неинфицированные клетки. В данном случае жизнеспособность клеток монотонно снижается с увеличением содержания препарата. Таким образом АФП в концентрации около 10 мкг/мл способен эффективно предотвращать инфицирование нормальных клеток вирусом ВИЧ-1. В высоких концентрациях (около 100 мкг/мл) АФП снижает жизнеспособность как инфицированных, так и нормальных клеток. Это связано, как показали наши дальнейшие исследования, с явлением индуцированного препаратом абаптозиса. Закономерности, обнаруженные при исследовании влияния АФП на жизнеспособность клеток и уровень вирусспецифичного антигена, сохранились при изучении действия препарата на количество живых инфицированных и неинфицированных клеток.

Использование: медицина, вирусология, для защиты клеток крови человека от ВИЧ. Сущность: лимфоидные клетки крови человека обрабатывают в процессе культивирования препаратом, препятствующим связыванию ВИЧ с клеткой-мишенью, при этом в качестве препарата используют фатальный альфа-фетопротеин человека в концентрации 2 - 15 мкг/мл среды культивирования. Способ прост, эффективен, не требует дополнительных материальных и технических затрат.

Способ защиты лимфоидных клеток крови человека от ВИЧ, включающий обработку клеток в процессе культивирования препаратом, препятствующим связыванию ВИЧ с клеткой-мишенью, отличающийся тем, что в качестве препарата используют фетальный альфа-фетопротеин человека в концентрации 2 - 15 мкг/мл среды культивирования.