ИНАКТИВИРОВАННАЯ ВАКЦИНА ПРОТИВ ВЕНЕСУЭЛЬСКОГО ЭНЦЕФАЛОМИЕЛИТА ЛОШАДЕЙ И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 1995 года по МПК A61K39/193 

Изобретение относится к медицине, в частности к производству вирусных вакцинных препаратов.

Известна инактивированная вакцина ВЭЛ на основе аттенуированного штамма ТС-83, названная С-84, которая индуцирует синтез вируснейтрализующих антител в организме животных и человека и обеспечивает протективный эффект у иммунизированных. В состав вакцины входят штамм ТС-83 и культуральная жидкость.

Вакцину С-84 получают путем размножения вируса ТС-83 на культуре фибробластов утиных эмбрионов в течение 20 ч при 37^оС с последующим сбором вируссодержащей культуральной жидкости, очисткой при помощи фильтрации и инактивацией 0,1% -ным раствором формалина при 37^оС в течение 3 сут. Титр вирусного материала до инактивации составляет 9,5-10,0 lg/мл.

Недостатком вакцинного препарата С-84 является невысокая иммуногенная активность, проявляющаяся, в частности, отсутствием защиты при аэрозольном способе заражения, который является одним из основных путем инфицирования сотрудников лабораторий, имеющих непосредственный контакт с вирулентными штаммами вируса ВЭЛ.

Цель изобретения повышение иммуногенной активности вакцинного препарата и создание защиты при аэрозольном способе заражения.

Вакцину готовят из вирулентного штамма Тринидад вируса ВЭЛ (получен из коллекции вирусов Института вирусологии им. Д.И.Ивановского, ГКВ N 536) путем культивирования в клетках Л-68 (ВСКК (МБЧ) N 18/9/175).

Предлагаемая вакцина против венесуэльского энцефаломиелита лошадей имеет следующий компонентный состав,
Вируссодержащий материал
из штамма
Тринидад (с активностью
3,3-3,9 lg ГАЕ), инактивиро-
ванный формальдегидом 0,009-0,011
Гидроокись алюминия 0,09-0,11
Забуференный физиоло-
гический раствор,
рН 7,3 ± 0,1 Остальное
Способ изготовления инактивированной вакцины против ВЭЛ заключается в следующем: диплоидные клетки фибробластов эмбрионов человека Л-68 (ВСКК (МБЧ) N 18/9/175) заражают штаммом Тринидад вируса ВЭЛ, ГКВ N 536, в дозе 0,1-0,01 БОЕ/клетку. Сбор вируссодержащей культуральной жидкости проводят через 18-24 ч культивирования при 37^оС, концентрируют полиэтиленгликолем с мол. м. 6000, обрабатывают ультразвуком 3 раза по 15 с при 25 кГц и частоте 60 нм, очистку вируса проводят в сахарозном градиенте. Очищенную вирусную суспензию подвергают инактивации 0,05%-ным формальдегидом в течение 48 ч и сорбируют вирусный материал на гидроокиси алюминия в соотношении 0,8-1,2/8-12 при рН 7,3 ± 0,1. Конечная концентрация белка в вакцине составляет 100 ± 10 мкг/мл, с активностью 3,3-3,9 lg ГАЕ.

Предложенный новый препарат вакцины против венесуэльского энцефаломиелита лошадей и способ его изготовления.

Новыми признаками способа по сравнению с прототипом являются следующие:
использование в качестве источника вируса ВЭЛ вирулентного штамма Тринидад, выращиваемого на диплоидных клетках легкого эмбриона человека Л-68;
перед концентрированием в сахарозном градиенте вирусный материал обрабатывают ультразвуком 3 раза по 15 с при 25 кГц с частотой 60 нм;
инактивацию очищенного вируса 0,05%-ным формальдегидом проводят в течение 48 ч;
сорбцию вируса на гидроокиси алюминия проводят при рН 7,3± 0,1 в соотношении 0,8 1,2/8 12.

Полученная вакцина обладает более высокой иммуногенной активностью за счет полноты антигенного спектра вирулентного вируса по сравнению с аттенуированным штаммом; для наработки вируса используется аттестованная и разрешенная к использованию в СССР линия клеток Л-68; инактивации подвергают уже очищенный препарат вируса, за счет этого достигаются безопасность и ареактогенность вакцинного препарата.

Совокупность всех существенных признаков объектов изобретения экспериментально найдена, неизвестна из опубликованных источников информации, что позволяет сделать вывод о существенных отличиях предлагаемых объектов от известных.

П р и м е р 1. Монослой клеток линии Л-68 получают роллерным способом культивирования в роллерных бутылках объемом 2,0 л, посадочная концентрация 0,125-0,150 млн. клеток/мл среды. Через 72-96 ч среду культивирования сливают, монослой промывают раствором Хенкса и проводят заражение культуры штаммом Тринидад вируса ВЭЛ в дозе 0,1-0,01 БОЕ/клетку. Контакт вирус-клетка 45-60 мин при температуре 37 ± 0,5^оС, после чего бутылки заливают поддерживающей питательной средой, состоящей из среды ДМЕМ с 1%-ной эмбриональной сывороткой крупного рогатого скота, в объеме 100 мл на бутылку. Культивирование вируса проводят при температуре 37-0,5^оС в течение 18-24 ч в роллерной установке со скоростью вращения 15 об/ч. Полученную вируссодержащую культуральную жидкость обрабатывают полиэтиленгликолем, имеющим мол. м. 6000 (ПЭГ-6000), до создания конечной массовой доли 90± 5 г/л и после полного растворения устанавливают в холодильник при температуре 4-6^оС на 18-20 ч. Затем вируссодержащую суспензию центрифугируют при 9000 об/мин в течение 30-40 мин. Надосадочную жидкость удаляют, а осадок ресуспендируют в забуференном растворе (ЗР) (0,02 М трис-HCl, 0,1 М хлористый натрий, водородный показатель 8,0 ± 0,1 рН), объем которого составляет 1/10 к объему культуральной жидкости. Для полной дезагрегации вирусных конгломератов применяют ультразвуковой дезинтегратор, время озвучивания 3 раза по 15 с с промежутками, равными 10 с при 60 нм. Дезинтегрированный вирусный препарат наносят на 25%-ный раствор сахарозы и центрифугируют при 27000 об/мин в течение 2 ч при температуре 5^оС. После окончания центрифугирования надосадочную жидкость удаляют, а осадок ресуспендируют в 5-10 см³ ЗР. Дополнительную очистку проводят с использованием заранее приготовленного линейного градиента сахарозы (20-50% ), на который наносят вирусный препарат, полученный на предыдущем этапе. Центрифугирование осуществляют при скорости вращения, равной 27000 об/мин в течение 4 ч при температуре 5^оС. Опалесцирующую полосу на уровне 37% сахарозы, содержащую вирус, осторожно отбирают с помощью пипетки, разводят в двух объемах ЗР и наслаивают на 25%-ный раствор сахарозы. Центрифугируют при скорости вращения 35000 об/мин в течение 1 ч, удаляют надосадочную жидкость, а осадок суспендируют в забуференном физиологическом растворе, водородный показатель 7,4 ± 0,2 рН. После определения общего белка по методу Лоури доводят концентрацию препарата до 200-300 мкг/см³ по белку и подвергают инактивации с помощью 0,05%-ного раствора формальдегида при температуре 37^оС в течение 48 ч. Конечная концентрация препарата по общему белку должна составлять 100 ±10 мкг/см³. Для усиления иммунного ответа к препарату инактивированной цельновирионной вакцины в качестве адъюванта добавляют гель гидроокиси алюминия в соотношении 0,8-1,2/8-12. Объем вакцины в ампуле составляет 2,0 ±0,1 см³, что соответствует четырем дозам для человека.

П р и м е р 2. Изучение безвредности, безопасности и иммуногенности инактивированной вакцины вируса ВЭЛ проводят на белых мышах, морских свинках и кроликах. Стерильность проверяют на тиогликолевой среде по ВФС-42-18-44-88.

Остаточную инфекционность определяют путем двукратного пассажа через мозг белых мышей при интрацеребральном инфицировании с последующим подкожным введением 10% мозговой суспензии белым мышам. Наблюдение осуществляют в течение 10 сут. Гибели животных не наблюдалось, вакцина лишена остаточной инфекционности.

Токсичность определяют на белых мышах и морских свинках. Для этого животным вводят внутрибрюшинно по 0,5 мл готового препарата вакцины и наблюдают в течение 7 сут. Гибели, повышения температуры или падения массы животных не отмечалось, вакцина нетоксична.

Пирогенность проверяют на кроликах массой 2,5-3,0 кг, которым в наружную ушную вену вводят по 50 ± 5 мкг вакцины без адъюванта с последующим измерение температурной реакции в течение 3 ч. Температурной реакции не наблюдали, т.е. препарат непирогенен.

Стерильность определяют при высеве проб на тиогликолевую среду, делят на две группы и устанавливают одну при 22^оС, другую при 37^оС. Наблюдение в течение 14 сут. Пророста не наблюдалось, вакцина стерильна.

Титр вируснейтрализующих антител в крови иммунизированных кроликов после однократного введения на 0 и 14 день 25 мкг достигал 2,2-2,5 lg, после двукратного 2,5-3,5 lg. Максимальное значение титра антител отмечается при однократной вакцинации на 21-28 день, при двукратной на 28-35 день после иммунизации и сохраняется до 9 месяцев (срок наблюдения).

П р и м е р 3. Протективную активность инактивированной вакцины определяют в экспериментах на белых мышах и кроликах породы "Шиншилла". Доза иммунизации для мышей составляют 2, 5, 8 и 10 мкг, для кроликов 10, 30, 50, 100 мкг. Инокуляцию препарата проводят однократно и двукратно с интервалом 14 дней подкожно. Срок наблюдения до заражения составляет 21-28 дней со дня последней иммунизации. В качестве вируса используют высоковирулентный штамм Тринидад вируса ВЭЛ. Заражение животных осуществляют как подкожно, так и аэрозольно, lg титра вируса составляет 9,5 ± 0,5 ЛД₅₀ для данных животных при подкожном способе заражения.

Результаты экспериментов (табл.1 и 2) демонстрируют высокую протективную активность инактивированной вакцины, приготовленной на основе штамма Тринидад вируса ВЭЛ.

П р и м е р 4. Определение иммунологической характеристики инактивированной вакцины вируса ВЭЛ проводили на ограниченной группе волонтеров. Доза вакцинации составляла 50 ± 10 мкг, через 14 дней инъекцию повторили той же дозой. Взятие крови и приготовление сыворотки осуществляли каждые 7 дней. Уровень вирусспецифических антител определяли в реакции радиоиммунного анализа (РИА). Результаты проверки представлены в табл.3.

Использование: медицина, вирусология. Сущность изобретения: вирус венесуэльского энцефаломиелита лошадей штамм Тринидад (ГКВ N 536) размножают в культуре диплоидных клеток легкого эмбриона человека Л-68. Клетки заражают вирусом в дозе 0,1-0,01 БОЕ/клетку, инкубируют при 37 °С в течение 18-24 ч, концентрируют полиэтиленгликолем с мол.м. 6000, обрабатывают ультразвуком 3 раза в 15 с. Вируссодержащий материал очищают в градиенте плотности сахарозы, инактивируют 0,05% -ным формальдегидом в течение 48 ч и сорбируют на гидроокиси алюминия в соотношении 0,8-1,2/8 -12 при рН 7,37,3 ± 0,10,1. Конечная концентрация белка в вакцине составляет 100100 ± 1010 мкг/мл с активностью 3,3-3,9 lg ГАЕ. 2 с.п.ф-лы, 3 табл.

1. Инактивированная вакцина против венесуэльского энцефаломиелита лошадей, включающая инактивированный формальдегидом вируссодержащий материал из штамма венесуэльского энцефаломиелита лошадей, гидроокись алюминия и разбавитель, отличающаяся тем, что из штаммов вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей используют штамм Тринидад, инактивированный формальдегидом, с активностью 3,3 3,9 lg ГАЕ, а из разбавителей - забуференный физиологический раствор pH 7,3 ± 0,1 при следующем соотношении компонентов,
Вируссодержащий материал из штамма вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей Тринидад, инактивированный формальдегидом, с активностью 3,3 3,9 lg ГАЕ 0,009 0,011
Гидроокись алюминия 0,09 0,11
Забуференный физиологический раствор pH 7,3 ± 0,1 Остальное
2. Способ получения инактивированной вакцины против венесуэльского энцефаломиелита лошадей, включающий размножение штамма вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей в культуре клеток, сбор вируссодержащего материала с последующей концентрацией, очисткой в градиенте сахарозы, инактивацией формальдегидом и сорбцию на гидроокиси алюминия, отличающийся тем, что из штаммов венесуэльского энцефаломиелита лошадей используют штамм Тринидад, из культур клеток используют культуру диплоидных клеток легкого эмбриона человека Л-68, клетки заражают вирусом в дозе 0,1 0,0160 Е/клетку, культивирование проводят при 37^oС в течение 18 24 ч, перед очисткой вируссодержащий материал обрабатывают ультразвуком трехкратно по 15 с при 25 кГц и частоте 60 нм, инактивацию очищенного вируса осуществляют в течение 48 ч, а сорбцию вируса на гидроокиси алюминия проводят в соотношении 0,8 8 1,2 12 при рН 7,3 ± 0,1.