СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ИНАКТИВИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ КЛАССИЧЕСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ Российский патент 1995 года по МПК A61K39/187 C12N7/06 C12N7/06 C12R1/92 

Изобретение относится к вирусологии и может быть использовано в научных и производственных лабораториях, занимающихся конструированием биопрепаратов, а также на предприятиях биологической промышленности.

Известны способы изготовления инактивированных вакцин против классической чумы свиней (КЧС), различающиеся между собой по вируссодержащему сырью, способу инактивации, иммуногенной активности. В прошлом для приготовления инактивированных вакцин против КЧС использовали формалин [1] или кристаллвиолет [2] Вирусным материалом в этих вакцинах являлись вируссодержащие кровь и ткани свиней, инокулированных вирулентным вирусом КЧС.

В нашей стране применялась инактивированная кристаллвиолетом вакцина против КЧС [3] Иммунная реакция у привитых такими вакцинами животных была замедленной и слабой, длилась в течение нескольких месяцев (2-3) даже после нескольких бустер-инъекций. Несмотря на предохранение животных от заболевания, наблюдалась персистенция вирулентного вируса и у новорожденного потомства наблюдались различные расстройства и уродства. В настоящее время эти вакцины не используются, потому что необходимы большие объемы для вакцинации ( ≈ 20 мл), двукратная прививка с интервалом 2-4 недели, короткая длительность иммунитета, дороговизна вакцины и необходимость получения высоких титров вируса, трудности получения полной инактивации.

Известен также способ изготовления инактивированной кристаллвиолетвакцины, получаемой из дефибринированной крови инфицированных вирулентным вирусом свиней [3]
Вакцина состояла из 80 час. дефибринированной крови, содержащей 10 час. 3% -ного раствора фосфата натрия и 10 час. 0,5%-ного раствора кристаллвиолета. После тщательного встряхивания в течение 15 мин смесь вируссодержащего сырья и кристаллвиолета ставили на инактивацию в течение 20 сут. при 37^оС. Этот способ производства предусматривал одновременное содержание большого количества зараженных чумой свиней и их убой, что являлось потенциальным источником рассеивания вируса в окружающей среде. Иммунитет наступал на 18-20 день у 80% животных и продолжался до 8 месяцев. Вакцинированные животные иногда переболевали чумой в скрытой форме и оставались носителями вируса классической чумы свиней. В 1973 году вакцина в связи с изложенными недостатками была снята с производства.

Задачей изобретения является изготовление безвредной, ареактогенной инактивированной вакцины, обеспечивающей 80-100%-ную защиту животных от заболевания КЧС.

Поставленная цель достигается тем, что в качестве вакцины используют вируссодержащий материал, полученный в перевиваемых культурах клеток к активностью 10^5,0-10^6,5 БОЕ₅₀/мл. Нами впервые установлена возможность использования ионов меди в качестве инактиватора для вакцин. В данном случае инактиватором является сернокислая медь, конечная концентрация которой в вируссодержащем сырье составляет 3-6 ммоль/мл. Полноту инактивации проверяют в 3-7 последовательных пассажах на чувствительной культуре клеток РК-15 или на подсвинках 2^х-3^х месячного возраста. К инактивированному сырью добавляют адъювант, которым может быть как гидроокись алюминия, так и масляные адъюванты, используемые по общепринятой методике. Приготовленный таким образом препарат является инактивированной культуральной вакциной.

Пример конкретного выполнения.

Для инфицирования вирусом могут быть использованы следующие культуры клеток.

1. Перевиваемую монослойную культуру клеток РК-15 со сформировавшимся монослоем заражают вирусом КЧС шт. Ши-Мынь 36 пассажа с инфекционной активностью 5,0 lg БОЕ₅₀/мл. Из роллерных бутылей удаляют ростовую среду, вносят вирус в дозе 0,003 БОЕ ₅₀/кл и инкубируют при 37^оС в течение 1,5 ч с целью адсорбции вируса. Затем в культуральные сосуды вносят поддерживающую среду (ИГЛА МЕМ с сывороткой КРС или телят) и инкубируют при 37^оС 72 ч). С целью освобождения внутриклеточного вируса бутыли замораживают и оттаивают. Титрованием определяют инфекционную активность вирусного материала, которая составляет 5,5 lg БОЕ ₅₀/мл.

2. Перевиваемую монослойную культуру клеток почки минисвиньи (ПМС) со сформировавшимся монослоем заражают вирусом КЧС шт.Ши-Мынь 37 пассажа с инфекционной активностью 5,5 lg БОЕ₅₀/мл. Из клинских матрасов со сформировавшимся монослоем удаляют ростовую среду и вносят вирус в дозе 0,05 БОЕ₅₀/кл и инкубируют при 37^оС в течение 1,5 ч.

Затем в культуральные сосуды вносят поддерживающую среду, инкубируют 48 ч при 37^оС. После инкубирования бутыли замораживают.

Инфекционная активность вирусного сырья, определяемая титрованием, методом флуоресцирующих антител составляет 6,0 lg БОЕ₅₀/мл.

3. Перевариваемую монослойную культуру почки свиньи (КПС) со сформировавшимся монослоем заражают вирусом КЧС шт. Ши-Мынь 39 пассажа (инфекционная активность 5,0 lg БОЕ₅₀/мл). Из культуральных сосудов со сформировавшимся монослоем (роллерные бутыли, матрасы) удаляют культуральную жидкость, клетки заражают вирусом 0,005 БОЕ₅₀/кл и инкубируют при 37^оС 2 ч. Затем в культуральные сосуды вносят поддерживающую среду 0,25% ФГМ с сывороткой телят или КРС (2%) и инкубируют при 37^оС 72 ч. После инкубирования сосуды с культурой клеток и культуральной жидкостью замораживают и оттаивают.

Инфекционная активность вирусного сырья, определяемая методом флуоресцирующих антител, составляет 5,75 lg БОЕ₅₀/мл.

Для выбора инактиватора используют А-24 (производное этилендиамина, ДЭИ (димер этиленимина), глютаровый альдегид, сернокислую медь, неионные детергенты тритон х-100 и нонидет NP-40. Концентрация и условия инактивации для перечисленных препаратов за исключением сернокислой меди заимствованы из данных литературы при работе с другими вирусами.

Сернокислая медь при 37^оС инактивирует вирус классической чумы свиней штамм Ши-Мынь в дозе 0,03 ммоль/мл и выше (см. табл.1). Нами для инактивации выбрана концентрация 0,3-0,6 ммоль/мл, так как несмотря на инактивирующий эффект, большая концентрация меди в связи с загрязнением вакцины нецелесообразна.

Вируссодержащий материал инактивируют вышеперечисленными инактиваторами и готовят образцы инактивированной вакцины. Результаты испытания этих препаратов на подсвинках показывают, что наибольшей иммуногенностью обладает препарат, инактиватором, в котором является сернокислая медь (табл. 2). В то время как иммунизация подсвинков препаратами с инактиваторами NP-40, ДЕИ, Тритон х-100 не обеспечивала защиты животных от гибели при контрольном заражении, а с инактиватором А-24 при контрольном заражении только 50%-ную защиту, иммунизация подсвинков инактивированной ионами меди вакциной обеспечивала 100% защиту животных от контрольного заражения вирулентным вирусом. К полученному инактивированному вакцинному препарату добавляют в качестве адьюванта гидрат окиси алюминия (ГОА) до конечной концентрации 0,06% или эмульгируют равные объемы инактивированного вирусного материала и масляного адьюванта.

Приготовленные образцы вакцины вводят внутримышечно в области шеи или бедра двукратно с интервалом в 14 дней. Через 24 дня после первой прививки вакцинированных подсвинков и контрольного заражают вирулентным вирусом классической чумы свиней, в дозе 1000 БОЕ₅₀. Как видно из табл.3, после заражения вирулентным вирусом у контрольного подсвинка наблюдают подъем температуры до 41,2^оС, длившейся в течение 10 дней (max 42,1^оС) и гибель животного.

Вакцинированные двукратно инактивированной вакциной подсвинки на заражение вирулентным вирусом практически не реагируют.

Таким образом предлагаемая инактивированная вакцина по сравнению с прототипом обладает следующими преимуществами.

Как видно из табл.4, предлагаемая вакцина безвредна, ареактогенна, иммуногенна.

Предлагаемая инактивированная вакцина прошла комиссионные испытания, проста в изготовлении, не требует сложного оборудования и реактивов и может быть промышленно применима.

Использование: вирусология, ветеринария, научные и производственные лаборатории по конструированию биопрепаратов, защита свиней от возбудителя чумы. Сущность изобретения: монослойную перевиваемую культуру клеток инфицируют культуральным вирулентным вариантом вируса штамма Ши-Мынь. Полученный вируссодержащий материал с активностью 10^5,0-10^6,5 подвергают замораживанию и оттаиванию и инактивируют сернокислой медью в конечной концентрации 3 6 ммоль/мл вируссодержащего материала. Вакцину вводят внутримышечно в область шеи или бедра двукратно с интервалом 14 дней. Вакцина безвредна, ареактогенна, иммуногенна. 4 табл.

СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ИНАКТИВИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ КЛАССИЧЕСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ, предусматривающий инфицирование биологического объекта вирулентным вирусом, получение вируссодержащего материала и его инактивацию химическим реагентом, отличающийся тем, что инфицирование проводят культуральным вирулентным вариантом вируса штамма Ши Мынь с использованием в качестве биологического объекта монослойной перевиваемой культуры клеток, инактивируют вируссодержащий материал с активностью 10^5,0 - 10^6,5 БОЕ 50/мл, предварительно подвергнутый замораживанию и оттаиванию, а в качестве химического реагента используют сернокислую медь в конечной концентрации 3 6 ммоль/мл вируссодержащего материала.