СПОСОБ УДАЛЕНИЯ ФЕНИЛГИДРАЗИДНОЙ ЗАЩИТНОЙ ГРУППЫ, БЛОКИРУЮЩЕЙ КАРБОКСИЛЬНУЮ ФУНКЦИЮ Российский патент 1995 года по МПК C07K1/06 C07K5/08 

Изобретение относится к области органической химии, в частности к области пептидного синтеза, и может быть использовано для удаления временной защитной группы, блокирующей карбоксильную функцию.

Неоднократно делались попытки использовать фенилгидразидную группу для временной защиты карбоксильной функции при синтезе пептидов. Были разработаны способы мягкого и селективного введения этой защиты при помощи ферментов. Было также показано, что фенилгидразидная группа относится к типу "потенциально активируемых" защитных групп и может быть использована как для защиты, так и для последующей активации карбоксильной функции.

Тем не менее фенилгидразидная защита не нашла широкого применения в практике пептидного синтеза, главным образом вследствие того, что удаление этой защиты протекает в довольно жестких условиях.

Известны способы удаления фенилгидразидной защитной группы, блокирующей карбоксильную функцию. Большинство предложенных на сегодняшний день способов деблокирования включают химическое окисление фенилгидразида до высокоактивного неустойчивого фенилдиимида с последующим его самопроизвольным распадом:
-CO-NH-NH-C₆H -CO-N= N-C₆H₅ -> -CO-OH + N₂ + C₆H₆ В качестве окислителей на первой стадии используют перманганат калия, хлорное железо, иод, бромсукцинимид, двуокись марганца, тетраацетат свинца, ацетат меди. При этом реакция с хлорным железом протекает в кислой среде, что накладывает ограничения на использование трет-бутильных и трет-бутилоксикарбонильных защитных групп. Реакция с двуокисью марганца приводит к окислению метионина на 67% реакция с ацетатом меди протекает при температуре 96-97^оС. Использование иода может приводить к модификации циклических структур гистидина и тирозина, а также к отщеплению ацетамидометильной и тритильной защит цистеина. Бромсукцинимид модифицирует триптофан. Триптофан также может подвергаться неспецифическому окислению.

Таким образом, следует сделать вывод что в настоящее время отсутствуют общие способы мягкого и селективного удаления фенилгидразидной защитной группы, пригодные для использования в пептидном синтезе.

Наиболее близким к заявляемому является ферментативный способ удаления фенилгидразидной защиты при помощи лакказы [1] Катализируемое ферментом деблокирование протекает в мягких условиях и без побочных реакций. В качестве окислителя при этом используется кислород воздуха. Недостатками известного способа являются высокая стоимость лакказы [2] и невозможность ее использования для деблокирования гидрофобных пептидов в среде органических растворителей (см. фиг. 1).

Целью изобретения является удешевление и расширение технологических возможностей способа.

Описываемый способ удаления фенилгидразидной защитной группы, блокирующей карбоксильную функцию, заключается в каталитическом окислении фенилгидразидной группы кислородом воздуха под действием органического комплекса меди (II) с низкомолекулярными азотсодержащими и органическими лигандами, получаемыми при взаимодействии солей меди и низкомолекулярных азотсодержащих органических лигандов, взятых в молярном соотношении от 1:1 до 1:500 при значениях рН 4,0-6,5.

Общими признаками описываемого способа и ближайшего технического решения являются: деблокирование, которое включает окисление фенилгидразидной защитной группы до высокоактивного неустойчивого фенилдиимида с последующим самопроизвольным его распадом;
процесс деблокирования является каталитическим, причем катализатором служит органический комплекс меди (медь входит в состав активного центра лакказы);
окислителем является кислород воздуха.

Преимуществами описываемого способа являются:
деблокирующие реагенты (соли двухвалентной меди и органические азотсодержащие лиганды, например пиридин), которые являются дешевыми и доступными в любых, в том числе и препаративных, количествах;
процесс деблокирования эффективно протекает в водно-органической среде с высоким содержанием диметилформамида, что позволяет проводить реакции с гидрофобными пептидами в концентрированных растворах, упрощающих стадию выделения (см. фиг. 1).

Способ осуществляют следующим образом. Пептид, содержащий удаляемую фенилгидразидную группу, растворяют в диметилформамиде, добавляют водный раствор соли двухвалентной меди, водный раствор органического азотсодержащего лиганда, и реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в условиях, обеспечивающих свободный доступ воздуха. Протекание реакции контролируют, например, методом тонкослойной хроматографии. По окончании реакции деблокированный пептид выделяют.

На фиг. 1 показана зависимость степени деблокирования модельного трипептида Phe. Trp-Gly NHNH Ph под действием лактазы от содержания диметилформамида в реакционной смеси; на фиг. 2 зависимость концентрации исходного модельного трипептида Phe-Trp-Gly NHNH Ph от времени при проведении реакции деблокирования, катализируемой комплексами меди (II) с органическими азотсодержащими лигандами: а пиридин, б имидазол, в N-метилимидазол, г без лигандов; на фиг. 3 зависимость степени деблокирования модельного трипептида Phe-Trp-Gly NH NH Ph под действием пиридиниевого комплекса меди (II) от содержания диметилформамида в реакционной смеси; на фиг. 4 спектр протонного магнитного резонанса полностью защищенного трипептида Z-Gly-hys(Boc) Leu NH NH Ph (спектр А) и частично деблокированного трипептида Z Gly hys(Boc)-Leu NH NH Ph (спектр Б); на фиг. 5 то же, что на фиг. 2, при использовании в качестве катализатора комплекса меди (II) с лизином.

П р и м е р 1 (сравнительный). Ферментативное деблокирование модельного трипептида Phe Trp Gly NH NH Ph осуществляют в смеси вода диметилформамид с различным содержанием диметилформамида. Реакционная смесь содержит 1 мМ пептида, 2 об. диметилсульфоксида, 20 мкл раствора лакказы с удельной активностью 800 ед./мл, натрийацетатный буфер, 0,2 М, рН 4,0 и диметилформамид. Общий объем реакционной смеси 1 мл. Протекание реакции контролируют методом офВЭЖХ. На фиг. 1 представлена зависимость степени деблокирования пептида за 50 мин реакции от содержания в реакционной смеси диметилформамида. Видно, что каталитическая активность лакказы существенно подавляется в присутствии диметилформамида. Следовательно, способ ферментативного удаления фенилгидразидной защитной группы ограничено применим в случае гидрофобных пептидов.

П р и м е р 2. Деблокирование модельного трипептида осуществляют кислородом воздуха в присутствии комплексов меди с азотсодержащими органическими лигандами. Реакционная смесь (общий объем 1 мл) содержит 1 мМ пептида, 0,4 мМ хлорида меди (II), 0,5 мл диметилформамида, 0,5 мл 0,2 М натрийацетатного буфера, рН 4,0 и 20 мМ органического лиганда. Реакционную смесь перемешивают в условиях, обеспечивающих свободный доступ воздуха. Протекание реакции контролируют методом офВЭЖХ. На фиг. 2 представлены кинетические кривые, отображающие процесс деблокирования пептида во времени. Видно, что процесс деблокирования кислородом воздуха, катализируемый ионами меди, существенно ускоряется в присутствии азотсодержащих органических лигандов.

П р и м е р 3. Способ осуществляют аналогично примеру 1, но в качестве катализатора используют не лакказу, а CuCl₂ медь (II) и пиридин в концентрациях 0,4 и 20 мМ соответственно. На фиг. 3 представлена зависимость степени деблокирования модельного трипептида Phe Trp Gly NHNH Ph за 30 мин от концентрации диметилформамида в реакционной смеси. Видно, что процесс деблокирования согласно заявленному способу протекает эффективно в среде с высокой концентрацией диметилформамида (ср. с известным способом, фиг. 1).

П р и м е р 4 (препаративный). 6,8 г полностью защищенного трипептида Z-Gly-Lys (Boc)- Leu NHNHPh (фрагмент 10-12 кальцитонина лосося) растворяют в смеси, содержащей 425 мл диоксана, 212 мл 1 М пиридинийацетатного буфера, 106 мл ледяной уксусной кислоты и 10 мл 0,2 М раствора CuCl₂. Смесь интенсивно перемешивают 20 ч при комнатной температуре в условиях, обеспечивающих свободный доступ воздуха. По окончании реакции смесь упаривают досуха на ротонном испарителе и растворяют в смеси 400 мл этилацетата и 300 мл 1 н. серной кислоты. Водный слой отбрасывают, органический слой промывают 200 мл 1 н. серной кислоты и водой до нейтральной реакции. Органический слой упаривают и полученное масло кристаллизуют из смеси диэтилового эфира с гексаном. Выход частично деблокированного трипептида Z-Gly-Lys(Boc) Ley OH 5,63 г (92,3%).

П р и м е р 5. Способ осуществляют аналогично примеру 2, но вместо диметилформамида используют другие органические растворители или процесс осуществляют в водной среде в отсутствии органических растворителей. Результаты анализа реакционной смеси через 30 мин после начала реакции приведены в таблице.

Из таблицы видно, что способ реализуется в водно-органических средах независимо от природы органического растворителя или даже в отсутствие такового. Следовательно, природа органического растворителя не относится к признакам, существенным для реализации способа.

П р и м е р 6. Способ осуществляют аналогично примеру 2, но в качестве лиганда используют лизин. За 30 мин по данным офВЭЖХ степень конверсии составляет 5% Из приведенного примера видно, что в присутствии лизина как лиганда способ реализуется, хотя каталитическая активность комплекса меди (II) с лизином ниже, чем в случае комплекса меди (II) с пиридином.

Соотношение медь (II) лиганд может варьироваться в широких пределах, что подтверждается результатами, приведенными в примере 7.

П р и м е р 7. Способ осуществляют аналогично примеру 2, за исключением того, что в качестве лиганда используют пиридин или имидазол в концентрации от 0,4 мМ до 0,2 М. Результаты представлены на фиг. 5. Из графика видно, что соотношение медь (II) лиганд можно варьировать в диапазоне от 1:1 до 1:500.

Использование: в органической химии, при синтезе пептидов. Сущность изобретения: способ удаления фенилгидразидной защитной группы, блокирующей карбоксильную функцию, путем каталитического окисления фенилгидразидной группы кислородом воздуха под действием комплекса меди (II) с низкомолекулярными азотсодержащими органическими лигандами при молярном соотношении от 1:1 до 1:500 при pH от 4,0 до 6,5. 5 ил., 1 табл.

СПОСОБ УДАЛЕНИЯ ФЕНИЛГИДРАЗИДНОЙ ЗАЩИТНОЙ ГРУППЫ, БЛОКИРУЮЩЕЙ КАРБОКСИЛЬНУЮ ФУНКЦИЮ, включающий каталитическое окисление фенилгидразидной группы кислородом воздуха в среде растворителя в присутствии инициатора, отличающийся тем, что в качестве инициатора используют комплекс меди (II) с низкомолекулярным азотсодержащим органическим лигандом, получаемым взаимодействием соли меди (II) с низкомолекулярным азотсодержащим органическим лигандом в молярном соотношении 1 1 500 при значениях pH 4,0 6,5.