СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВЫСШИХ СПИРТОВ Российский патент 1994 года по МПК C12Q1/00 G01N33/14 

Изобретение относится к аналитической химии и касается ферментативных методов определения спиртов, а более конкретно высших спиртов.

Для определения высших спиртов используются исключительно физико-химические и химические методы.

Известен способ химического определения суммы спиртов, заключающийся в том, что пробу сточных вод или культуральной жидкости обрабатывают азотистой кислотой, экстрагируют образовавшиеся алкилнитриты гептаном и измеряют оптическую плотность экстракта при 370 нм. Способ позволяет определить сумму спиртов, в т.ч. и высших, в пределах 20-300 мг/л, относительная ошибка определения составляет 7% [1].

Способ позволяет определять лишь спирты, растворенные в водной фазе, т. е. высшие и низшие спирты и следовательно метод не пригоден для определения высших спиртов в присутствии низших.

Известен спектральный способ определения спиртов, заключающийся в оценке интенсивности ИК-спектра поглощения исследуемого образца. Способ основан на существовании характеристической частоты поглощения гидроксильной группы и поэтому селективно определить высшие спирты не позволяет [2].

Наиболее совершенным и принятым по этой причине за способ-прототип является способ определения высших спиртов методом газожидкостной хроматографии, состоящий в том, что исследуемый образец подвергают тонкослойной хроматографии, жидкие спирты ацилируют и разделяют на хроматографической колонке [3].

Способ обладает высокой точностью, но требует наличия сложной аппаратуры, предварительной трудоемкой подготовки образца.

Цель предложенного способа - упрощение процедуры определения высших спиртов за счет исключения необходимости использования сложной аппаратуры и предварительной особой подготовки исследуемых образцов.

Цель достигнута в результате использования ферментативного метода определения высших спиртов, предусматривающего контакт исследуемого образца с препаратом фермента алкогольоксидазы высших спиртов и регистрацию результатов взаимодействия.

Исследуемым образцом может быть водный раствор; органическая жидкость; эмульсия, содержащая водную фазу и фазу органического растворителя; газовоздушная проба.

Поскольку высшие спирты практически не смешиваются с водой, водный раствор может быть объектом исследований лишь в случаях, когда требуется определить наличие в нем низких концентраций загрязняющих его высших спиртов.

Способ применения и для определения наличия и/или концентрации высших спиртов в газовой фазе, в частности в газовых выбросах предприятий, производящих эти продукты. В этом случае можно, например, предварительно барботировать отходящие газы через жидкую фазу и улавливать таким образом высшие спирты.

Исследованиями установлено, что алкогольоксидаза высших спиртов довольно устойчива к органическим растворителям и не инактивируется ими по крайней мере в течение времени, необходимого для реализации предложенного способа.

В этой связи представляется возможным осуществлять предложенный способ, вводя в контакт ферментный препарат непосредственно с фазой органического растворителя или с эмульсией, содержащей органический растворитель, причем введение стабилизаторов в систему и использование промежуточных растворителей не является обязательным.

Алкогольоксидаза высших спиртов - довольно новый ферментный препарат, впервые выделенный в 1988 г. из парафинокисляющих дрожжей. Этот фермент способен в различной степени окислять высшие спирты, но не обладает способностью окислять метанол и этанол. Такие свойства алкогольоксидазы высших спиртов позволяют, в частности, определять примеси высших спиртов в низших спиртах, в первую очередь, в этаноле.

Механизм действия алкогольоксидазы высших спиртов состоит в том, что акцептором электронов в ферментативной реакции выступает молекулярный кислород, который восстанавливается до перекиси водорода. По этой причине добавления в систему каких-либо кофакторов не требуется.

Активность ферментативной реакции окисления высших спиртов можно определять традиционным образом: полярографически - по скорости поглощения кислорода, колориметрически - по интенсивности возникающей окраски индикаторных комплексов и любыми другими доступными средствами.

Предложенный способ позволяет проводить как количественное определение высших спиртов, так и осуществлять качественную пробу на их присутствие, определять концентрацию известного высшего спирта в образце или давать количественную оценку содержанию смеси высших спиртов неиндетифицированного состава.

Для осуществления способа требуется 0,01-0,7 мл жидкого образца, а расход ферментного препарата составляет 0,1-0,8 Е.

В патентной и в доступной научно-технической литературе не было найдено информации об использовании алкогольоксидазы высших спиртов или других ферментов для аналитического определения высших спиртов.

Известна возможность определения низших спиртов с помощью ферментных препаратов алкогольоксидазы низших спиртов и алкогольдегидрогеназы.

Попыток ферментативного определения высших спиртов не предпринималось, видимо, в связи с ограниченностью сведений о ферментах, пригодных для этих целей, и о свойствах ферментов, потенциально для этого пригодных.

В частности, упоминалось о выделении из различных фракций парафинокисляющих дрожжей алкогольдегидрогеназ, способных окислять высшие спирты. При этом фермент, выделенный из цитозольной фракции, обладал широкой субстратной специфичностью, окисляя низшие и высшие спирты, а фермент, выделенный из мембранной фракции, окислял высшие спирты, но не окислял низшие. Более подробно свойства, обосновывающие потенциальную возможность использования упомянутых алкогольдегидрогеназ для определения высших спиртов, не описываются. В частности, отсутствуют сведения о скорости и глубине окисления субстратов, позволяющие установить линейную зависимость скорости реакции от концентрации субстрата.

Для обеспечения возможности протекания ферментативной реакции окисления октанола алкогольоксидазой высших спиртов взаимодействие осуществляли в среде диметилсульфоксида, смешивающегося и с водой и с октанолом, а для стабилизации фермента в реакционную среду вводили глицерин, ЭДТА, ФАД, ФМН, липиды.

Описанные условия использования этого фермента - создание фазы промежуточного растворителя, необходимость набора стабилизатора - ставят под сомнение такую практическую возможность, вследствие сложности их соблюдения.

Изложенное позволяет заключить, что отличительный прием предложенного способа - использование ферментного препарата алкогольоксидазы высших спиртов для определения высших спиртов - ранее для решения поставленной задачи не использовался и однозначно не вытекал из известного уровня знаний. На основании изложенного предложенный способ соответствует критерию существенных отличий.

Сравнительная субстратная специфичность алкогольоксидазы высших спиртов показана в таблице.

Представленные данные показывают, что высшие спирты с длиной цепи С₁₅-С₁₈ или также вторичные спирты могут быть количественно определены, но линейная зависимость между концентрацией спирта и скоростью поглощения кислорода наблюдалась в более узком интервале концентраций спиртов.

П р и м е р 1. Для количественного определения додеканола в декане предварительно была построена калибровочная кривая. Для этого была приготовлена серия образцов, содержащих 0,21%-0,54%-1,17%-1, 81%-2,44%-3,35%-4,31%-5,5% додеканола в декане.

В полярографическую ячейку вносили 3 мл 10 мМ калий фосфатного буфера, рН 7,7, содержащего 0,1 эмульгена 913, а затем добавляли 50 мкл приготовленного раствора спирта и инкубировали реакционную смесь в течение 5 мин. После этого в ячейку вносили 30 мкл алкогольоксидазы высших спиртов с удельной активностью 26 мкМ кислорода/мин.мл.

Количественно степень окисления додеканола в каждом образце оценивалась посредством определения скорости поглощения кислорода, растворенного в буфере.

Способ поясняется фиг.1-4.

На основе полученных результатов была построена калибровочная кривая, изображенная на фиг.1.

Для количественного анализа был приготовлен модельный образец, содержащий 1,25% додеканола и 1% этанола в декане. Исследуемый образец анализировался таким же образом и при тех же условиях, что и при построении калибровочной кривой. Значение скорости поглощения кислорода оказалось равным 0,07 мкМ О₂/мин, что соответствует содержанию додеканола по калибровочной кривой 1,3%. Следовательно, относительная погрешность определения равна 4%.

П р и м е р 2. Таким же образом, как и в примере 1, была построена калибровочная кривая для определения октанола в воде, изображенная на фиг.2. Стандартные растворы октанола в воде 0,0053%-0,0106%-0,021%-0,032%-0,0424% -0,053-0,064% соответствовали пределу растворимости октанола.

Для количественного определения был приготовлен модельный образец, содержащий 0,018% октанола и 0,1% метанола. Все операции по определению концентрации октанола были выполнены как описано в примере 1. Определенное полярографически значение скорости поглощения кислорода равнялось 0,067 мкМ О₂/мин. По калибровочной кривой было установлено, что содержание октанола в модельном образце составляет 0,02%. Следовательно, относительная погрешность определения равна 10%.

П р и м е р 3. Для определения концентрации додеканола в декане была построена калибровочная кривая. Готовилась серия образцов, содержащих 0,21% -0,54% -1,17% -1,81% -2,44% -3,35%-4,31%-5,5% додеканола в декане. В каждую пробу вносили 3,4 мл 10 мМ калий-фосфатного буфера, рН 7,7, 50 мкл раствора красителя N,N¹-дикарбониланилина, 12 мкл 10 мМ раствора гидрозона, 1 Е пероксидазы, а затем 5 мкл алкогольоксидазы высших спиртов с удельной активностью 26 мкМ О₂/мин. Смесь встряхивали в течение 2 мин при 21^оC. Интенсивность развившейся окраски измерялась спектрофотометрически. Калибровочная кривая изображена на фиг.3.

Для количественного анализа был приготовлен модельный образец, содержащий 1% додеканола и 1% этанола. Значение коэффициента экстинции исследуемого образца оказалось равным 0,114, что по калибровочной кривой соответствует величине концентрации спирта 1,1%. Следовательно, относительная погрешность определения составляет 10%.

П р и м е р 4. Для качественного определения наличия высших спиртов в исследуемых образцах была приготовлена серия модельных образцов, содержащих соответственно пентанол, октанол, деканол, додеканол. Спирты были предварительно растворены в декане, каждый образец содержал 1% спирта. В отдельные кюветы помещался исследуемый образец и реактивы, указанные в примере 3. После энергичного встряхивания кювет в течение 2 мин во всех образцах развивалась голубая окраска.

В аналогичных условиях образцы, содержащие метанол и этанол, по окраске не отличались от контроля, не содержащего спиртов.

П р и м е р 5. Исходя из калибровочных кривых, построенных для индивидуальных высших спиртов, была построена усредненная калибровочная кривая, изображенная на фиг.4.

Приготовлен модельный раствор, содержащий эквимолярные концентрации пентанола, гексанола, октанола, нооналола, деканола, додеканола в декане.

В измерительную ячейку внесли 50 мкл модельного образца с конечной суммарной концентрацией высших спиртов, равной 1,5%.

В полярографическую ячейку добавили 0,78 Е алкогольоксидазы высших спиртов. После инкубации была зарегистрирована скорость поглощения кислорода, равная 0,098 мкМ О₂/мин.

По калибровочной кривой было определено, что исследуемый образец содержит 1,58% высших спиртов. Следовательно, относительная погрешность определения составляет 6%.

Таким образом, приведенные примеры показывают достоверную возможность качественного и количественного определения высших спиртов предложенным методом с достаточной чувствительностью и точностью.

Использование предложенного способа позволяет проводить экспрессные определения наличия высших спиртов в исследуемых образцах с удовлетворительной точностью и достаточно простым образом.

Использование: область аналитической химии, определение высших спиртов. Сущность применения: исследуемый образец подвергают контакту с ферментным препаратом алкогольоксидазы высших спиртов и оценивают интенсивность ферментативной реакции. 4 ил., 1 табл.

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВЫСШИХ СПИРТОВ, включающий обработку исследуемого образца с последующей оценкой, отличающийся тем, что для обработки используют препарат алкогольоксидазы высших спиртов, а оценку проводят по интенсивности ферментативной реакции.