ВАКЦИНА, АССОЦИИРОВАННАЯ ПРОТИВ ДИАРЕИ ТЕЛЯТ Российский патент 1995 года по МПК A61K39/116 

Изобретение относится к инактивированным бактериальным вакцинам против диарреи телят.

Известны ассоциированные вакцины для специфической профилактики острых кишечных заболеваний молодняка сельскохозяйственных животных, содержащие антигены энетеробактерий E.coli и Salmonella [1]
В качестве прототипа выбраны коммерческие вакцины эшерихиозная и паратифозная (сальмонеллезная), применяемые для специфической профилактики диарей молодняка крупного рогатого скота [2,3]
Вакцины обладают более высокой эффективностью, чем ранее предлагавшиеся и применяемые вакцины, однако они имеют ряд недостатков.

Вакцины применяют раздельно, что связано с огромными затратами труда ветеринарных специалистов, многократным беспокойством животных, созданием у них стрессового состояния и неблагоприятным влиянием на иммунологическую реактивность животных на прививки. Полиэтиологичность острых кишечных заболеваний бактериальной природы диктует необходимость расширения валентности вакцины, что сдерживалось ранее тем, что ассоциированные вакцины обычно оказывались менее эффективными, чем моновакцины. Вакцины рекомендованы для применения не только стельным коровам, но и телятам с 8-10 до 17-20-дневного возраста. В связи с недостаточным развитием иммунной системы у телят этого возраста, а также возможностью нейтрализации у них колостральных антител специфическими антигенами вакцины и огромными иммунологическими нагрузками, которые выдерживают телята этого возраста, эффективность подобных прививок представляется сомнительной.

Целью изобретения являлось повышение эффективности специфической иммунопрофилактики, диарей и снижение затрат труда на проведение вакцинации.

Цель достигается тем, что вакцина включает смесь микробных суспензий энтеробактерий E.coli 09: K99, E.coli 0138: K88, E.coli 200, Salmonella typhimurium 195, Salmonella dublin 196, Salmonella enteritidis 197, Klebsiella pneumoniae 201, 202, Proteus vulgaris 198 и Proteus mirabilis 199, инактивированных этанолом и депонированных на гидроокиси алюминия при следующем соотношении компонентов, об.

антигены энтеробактерий (инактивированные микробные взвеси)
E.coli 09 К99 с кон-
центрацией 1,8-2,2 млрд.микр.кл. в 1 мл 5,0-6,0
E.coli 0138 К88 с кон-
центрацией 1,8-2,2 млрд.микр.кл. в 1 мл 5,0-6,0
E.coli 200 с кон-
центрацией 1,8-2,2 млрд. микр. кл. в 1 мл 5,0-6,0
P.vulgaris 198 с кон-
центрацией 1,8-2,2 млрд.микр.кл. в 1 мл 5,0-6,0
P.mirabilis 199 с кон-
центрацией 1,8-2,2 млрд.микр.кл. в 1 мл 5,0-6,0
K.pneumoniae 201 с кон-
центрацией 1,8-2,2 млрд.микр.кл. в 1 мл 5,0-6,0
K.pneumoniae 202 с кон-
центрацией 1,8-2,2 млрд.микр.кл. в 1 мл 5,0-6,0
Salmonella typgimurium
195 с концентрацией
0,9-1,1 млрд.микр.кл. 1 мл 2,0-3,0
Salmonella dublin 196 с
концентрацией 0,9-1,1 млрд.микр.кл. в 1 мл 2,0-3,0
Salmonella enteritidis 197
с концентрацией 0,9-1,1 млрд.микр.кл. 1 мл 2,0-3,0 Гидроокись алюминия 32,0-35,0 Фенол 0,2-0,25
Хлорид натрия, изото- нический раствор Остальное
Таким образом, ассоциированная бактериальная вакцина с ГОА состоит из стерильных микронных взвесей десяти вакцинных штаммов энтеробaктерий в фенолизированном (0,25% ) изотоническом растворе хлорида натрия, депонированных на гидроокиси алюминия. Микробные взвеси по концентрации объединены в две группы: в первую включены взвеси трех штаммов эшерихий, двух клебсиел и двух протеев. Их вводят в вакцину из расчета 2,0+0,2 млрд.микр.кл. 1 мл. Во вторую группу входят микробные взвеси трех штаммов сальмонелл по 1,0+0,1 млрд. микр. кл. в 1 мл. Концентрацию микробных взвесей определяют нефелометрически по коммерческому стандарту мутности.

Штаммы в составе вакцины подобраны из представителей энтеробактерий, наиболее частых возбудителей острых кишечных заболеваний, общих для человека и животных. Штаммы типичны по основным биологическим свойствам. Особенностью настоящих штаммов является то, что наряду со специфическими соматическими О-антигенами они содержат антигены вирулентности адгезины, энтеротоксины и гемолизины. Последние способны образовать антитела, препятствующие пусковым звеньям инфекционного процесса, а именно колонизации возбудителя на слизистой кишечника и продукции энтеротоксинов. Перечисленные свойства штаммов обеспечивают повышение профилактической эффективности вакцины. Все штаммы депонированы в Государственном институте стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича и являются предметом самостоятельной заявки, в которой представлены справки о депонировании этих штаммов (заявка на изобретение 4844860/13 (059515) с приоритетом от 29.05.90 г. Признака изобретения 31.02.91 г.).

П р и м е р. Для приготовления ассоциированной бактериальной вакцины против остpых кишечных заболеваний телят получают инактивированные микробные взвеси из 10 вакцинных штаммов. Биомассу каждого вакцинного штамма (эшерихий 3, клебсиел 2, протеев 2, сальмонелл 3) получают отдельно общеизвестным реакторным методом. Культивирование производят в жидкой питательной среде из ферментативного гидролизата казеизна с содержанием аминного азота 200-220 мг. пептона 0,2-0,4% рН 7,8-8,0 в ферментере с непрерывной аэрацией воздухом (1 объем на 1 объем питательной среды в 1 мин) и перемешиванием (400-500 оборотов мешалки в минуту) при 37+1^оС. Углеводное питание подача 40%-ного раствора глюкозы до концентрации 0,1-0,2% Через 8-10 ч культивирования концентрация микробных взвесей достигает 50+10 млрд. микробных клеток в 1 мл. Инактивацию микробных взвесей осуществляют однократной обработкой этанолом в соотношении: микробная взвесь этанол1:4 при перемешивании. Через 48 ч образуется плотный осадок. Надосадочную жидкость, состоящую из этанола и питательной среды, удаляют с помощью специального сифона, а к осадку добавляют изотонический раствор хлорида натрия до исходного объема микробной взвеси. В полученной инактивированной микробной взвеси этанол практически отсутствует.

Вакцину приготовят в соответствии с компонентным составом, приведенным в табл.1.

Испытание эффективности вакцины с различными соотношениями компонентов проводили на экспериментальных животных (кролики весом 2-2,5 кг). Вакцину в указанных в табл.1 концентрациях вводили животным однократно подкожно в дозе 1 мл. Вакцину каждой концентрации вводили трем кроликам. Первой группе вводили минимальное количество вакцины, второй группе среднее, третьей максимальное, четвертой меньше минимального и пятой больше максимального значений.

Кровь для определения уровня специфических антител брали из краевой вены до иммунизации (фон) и через 2 недели после иммунизации.

Было установлено отсутствие антагонистического действия компонентов вакцины, что обосновывает возможность их ассоциации и их иммунологическую эффективность (см. табл.2). При этом уровни специфических антител при средней и максимальной концентрации существенно на отличались, а дальнейшее увеличение концентрации не приводило к увеличению уровней специфических антител. Использование для иммунизации вакцины в дозах меньше минимальных оказалось неэффективным, так как не вызывало выработку антител в титрах, обеспечивающих защиту против бактериальных инфекций.

В связи с этим в табл.2 и далее в примерах описанных только эффективные дозы вакцины в пределах граничных значений (минимальные, средние и максимальные).

Для определения безвредности вакцины использовали два вида экспериментальных животных белые мыши весом 15-18 г и беспородные кролики весом 1,8-2 кг, а также стельных коров. Белым мышам вводили вакцину внутрибрюшинно в объеме 0,5 мл в трех концентрациях микробных клеток минимальные, средние и максимальные.

Безвредность готовой вакцины определялась также при внутрибрюшинном введении трем кроликам в объеме 2 мл, т.е. в концентрации 43 млрд. микробных тел (две средних дозы). Результаты опыта приведены в табл.3. Кроме того, безвредность вакцины определялась на группе клинически здоровых коров (5 животных). После клинического осмотра коровам вводили ассоциированную вакцину с концентрацией микробных клеток 17 млрд./мл (средняя концентрация микробных тел) подкожно в область средней трети шеи в объеме 7 мл (Всего 120+1 млрд. микробных клеток). Учет реакции на введение вакцины проводили через 8-10 и 24 ч путем внешнего клинического осмотра и термометрии. Как местные, так и общие реакции на введение вакцины практически отсутствовали. Лишь у двух животных наблюдалось незначительное слюноотделение и припухлость на месте введения, проходящие на 3 сутки.

Таким образом, вакцина предложенного состава полностью безвредна для животных.

Иммунизацию коров проводили по следующей схеме:
Трем группам клинически здоровых коров (по 5 голов в группе, всего 15 животных) вводили ассоциированную вакцину с общей концентрацией 17 млрд./мл микробных клеток подкожно двукратно с интервалом 2 недели в область средней трети шеи в объеме 7 мл.

Второй и третьей группам вводили в качестве контроля в соответствии с утвержденными наставлениями по применению, коммерческие вакцины формолтиомерсановая против колибактериоза и концентрированная формолквасцовая вакцина против сальмонеллеза телят. Иммунологическая активность вакцин по уровню антителообразования к входящим в вакцины антигенам приведена в табл.4.

Таким образом в крови коров, иммунизированных предложенной вакциной, отмечалось не только более высокий уровень специфических антител к эшерихиям и сальмонеллам, чем после иммунизации известными вакцинами того же назначения, но дополнительно присутствовали в достаточно высоких титрах антитела к клебсииеллезному и протейному антигенам. То есть удалось достичь нового качества насыщение крови и соответственно молозива коров широким спектром антител против возбудителей острых кишечных заболеваний телят, имеющих этиологическое значение в практических условиях, а вследствие этого, обеспечение высокой степени устойчивости телят против этих заболеваний в первые дни и даже часы жизни телят, то есть тогда, когда их иммунная система еще не развита, когда они наиболее подвержены этим инфекциям и когда вакцинопрофилактика на телятах оказывается по этим причинам неэффективной.

Использование преложенной вакцины сопровождается меньшими трудозатратами по сравнению с известными вакцинами, которые, обладая более низкой профилактической эффективностью, требуют значительных трудозатрат, так как их применение предусматривает раздельную вакцинацию и ревакцинацию.

Более высокая профилактическая активность предложенной вакцины по сравнению с известными вакцинами того же назначения была подтверждена испытаниями, проведенными в условиях животноводческих хозяйств.

Использование: биотехнология, вакцина ассоциированная, диарея, энтеробактерии телят. Сущность изобретения: вакцина представляет собой композицию из 10 штаммов энтеробактерий, инактивированных этанолом и депонированных на гидроокиси алюминия, фенол и изотонический р-р хлорида натрия. Предложенные соотношения компонентов обеспечивают высокую профилактическую эффективность вакцины при диареях и значительно снижают затраты труда на проведение вакцинаций. 4 табл.

ВАКЦИНА, АССОЦИИРОВАННАЯ ПРОТИВ ДИАРЕИ ТЕЛЯТ, содержащая инактивированные антигены эшерихий и сальмонелл и адъювант, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит инактивированные этанолом клетки штаммов Proteus vulgaris ГИСК N 198, Proteus mirabilis ГИСК N 199, Klebsiella pneumoniae ГИСК N 201, и Klebsiella pneumoniae N ГИСК N 202, фенол и изотонический раствор хлорида натрия, из антигенов эшерихий и сальмонелл инактивированные этанолом клетки штаммов Escherichia coli 09 K99, Escherichia coli 0138 К88, Escherichia soli ГИСК N 200, Salmonella tuphimurium ГИСК N 195, Salmonella dublin ГИСК N 196, Salmonella enteriti dis ГИСК N 197, а в качестве адъюванта гидроокись алюминия при следующем соотношении компонентов, об.

Инактивированные этанолом клетки штамма Escherichia coli 09 К99 в титре 1,8 · 10⁹ 2,2 · 10⁹ кл/мл 5,0 6,0
Инактивированные этанолом клетки штамма Escherichia coli 0138 К88 в титре 1,8 · 10⁹ 2,2 · 10⁹ кл/мл 5,0 6,0
Инактивированные этанолом клетки штамма Escherichia coli ГИСК N 200 в титре 1,8 · 10⁹ 2,2 · 10⁹ кл/мл 5,0 6,0
Инактивированные этанолом клетки штамма Proteus vulgaris ГИСК N 198 в титре 1,8 · 10⁹ 2,2 · 10⁹ кл/мл 5,0 6,0
Инактивированные этанолом клетки штамма Proteus mirabilis ГИСК N 199 в титре 1,8 · 10⁹ 2,2 · 10⁹ кл/мл 5,0 6,0
Инактивированные этанолом клетки штамма Klebsiella pneumoniae ГИСК N 201 в титре 1,8 · 10⁹ 2,2 · 10⁹ кл/мл 5,0 6,0
Инактивированные этанолом клетки штамма Klebsiella pneumoniae ГИСК N 202 в титре 1,8 · 10⁹ 2,2 · 10⁹ кл/мл 5,0 6,0
Инактивированные этанолом клетки штамма Salmonella typhimurium ГИСК N 195 в титре 0,9 · 10⁹ 1,1 · 10⁹ кл/мл 2,0 3,0
Инактивированные этанолом клетки штамма Salmonella dublin ГИСК N 196 в титре 0,9 · 10⁹ 1,1 · 10⁹ кл/мл 2,0 3,0
Инактивированные этанолом клетки штамма Salmonella enteritidis ГИСК N 197 в титре 0,9 · 10⁹ 1,1 · 10⁹ кл/мл 2,0 3,0
Гидроокись алюминия 32,0 35,0
Фенол 0,2 0,25
Изотонический раствор хлорида натрия Остальное