ПЕПТИДЫ И КОМПОЗИЦИЯ НА ИХ ОСНОВЕ, СПОСОБНАЯ РЕГУЛИРОВАТЬ ИММУННУЮ ФУНКЦИЮ МЛЕКОПИТАЮЩИХ Российский патент 1995 года по МПК C07K5/10 A61K38/00 

Изобретение относится к пептидам и композиции на их основе, способной регулировать иммунную функцию млекопитающих, которые могут найти применение в медицине.

Известны иммуномодуляторные белки, тимопойетин и тиспленин (или просто "спленин"), выделенные из зобной железы и селезенки, соответственно быка и человека. Кроме того, известны синтетические пептиды, у которых биологическая активность тимопойетина и тиспленина была дополнительно модифицирована с приобретением дополнительных качественных признаков, таких как стойкость к ферментному воздействию.

Известен пентапептидтилопентин, который является активным сайтом тимопойетина и имеет последовательность Arp-Lys-Аsp-Val-Туr. Известны также пептидные композиции, в которых в указанном пентапептиде у амино- и/или карбоксильного конца имеются различные заместители. Как тимопойетин, так и тимопентин индуцируют биологические изменения в двух человеческих Т-клеточных линиях, СЕМ и MOLT-4, показывая тем самым их участие в стимулировании активности Т-клеток как супрессора и как клетки-помощника. Недостаток этих пептидов, содержащих в пептидной цепи по крайней мере 5 аминокислотных остатков, состоит в их труднодоступности, кроме того, они не обладают способностью стимулировать активность супрессора и помощника иммунной системы человека при различных Т-клеточных нарушениях.

Впервые было обнаружено, что ряд тетрапептидов, содержащих амиды с концевым замещением карбоксильной группы, обладает активностью Т-клеточного супрессора, характерной для тимопентина в циклической GMP в клетках СЕМ. Это открытие является удивительным ввиду того, что те же тетрапептиды со свободной карбокси концевой группой или амидированные различными С-концевыми амидными группами, не вызывают такую активность Т-клеточного супрессора.

Цель изобретения поиск в ряду производных пептидов, содержащих небольшое число аминокислотных остатков, новых соединений, обладающих способностью регулировать недостаточную или избыточную Т-клеточную функцию организма, а также создание композиций на основе этих пептидов.

Поставленная задача решается пептидами общей формулы I:
Arp-Lys-Аsp-ValNR¹R² где NR₁R₂ выбирают из группы, включающей анилинамид, метиламид, 2-фенилгидразин, пиперидинамид, циклогексиламид и изопропиламид; предпочтительными являются пептиды, обладающие способностью регулировать недостаточную или избыточную Т-клеточную функцию организма. А также композицией, способной регулировать иммунную функцию млекопитающих, содержащей пептид и фармацевтически приемлемый носитель, в которой упомянутый пептид представляет собой соединение формулы I:
Arp-Lys-Аsp-ValNR¹R² где NR₁R₂ выбирают из группы, включающей анилинамид, метиламид, 2-фенилгидразин, пиперидинамид, циклогексиламид и изопропиламид, в количестве 0,001-100 мг/кг массы; предпочтительной является композиция, пригодная для орального введения.

Получение пептида, соответствующего изобретению, может осуществляться способом твердофазного синтеза или стандартными способами синтеза в растворе (способ твердофазного синтеза является общеизвестным и понятным способом получения пептидов). Твердофазный способ синтеза включает поэтапное введение защищенных аминокислот в растущую пептидную цепь, которая связана ковалентными связями с твердой смоляной частицей. При осуществлении данной процедуры побочные продукты удаляются путем фильтрации, исключая таким образом необходимость в очистке промежуточных продуктов. Общепринятая концепция данного способа зависит от соединения первой аминокислоты цепи с нетвердым полимером ковалентными связями. Последующие защищенные аминокислоты вводятся поодиночке или совместно поэтапным образом до тех пор, пока не образуется желаемая последовательность. И, наконец, защищенный пептид удаляется из твердой смоляной основы и защищающие группы расщепляются. Аминокислоты могут вводиться в любой подходящий полимер в форме смолы. Эта смола должна содержать функциональную группу, с которой может быть прочно связана ковалентной связью первая защищенная аминокислота. Для данной цели пригодны различные полимеры, такие как целлюлоза, поливиниловый спирт, полиметилметакрилат, и N-алкилбензиламиновая, N-алкилбензгидриламиновая и полистирольная смолы. Подходящие защитные группы, используемые в таких процессах синтеза, включают трет-бутилоксикарбонил (ВОС), бензил (Bzl), трет-амилоксикарбонил (АОС), тозил (тоs), орто-бромфенилметоксикарбонил (BrZ) и фенилметоксикарбонил (Z или CВZ).

В общем аспекте процедура получения пептидов согласно изобретению заключает в себе первоначальное связывание защищенной С-концевой аминокислоты со смолой. После этого связывания смола фильтруется, промывается и защищающая группа (желательно ВОС) у альфа-амино-группы С-концевой аминокислоты удаляется. Удаление этой защищающей группы должно осуществляться без разрыва связи между аминокислотой и смолой. Полученный смоляной пептид затем сопряженно связывается с защищенной С-концевым пенултиматом аминокислотой. Это сопряженное связывание осуществляется с образованием амидной связи между свободной карбоксильной группой второй аминокислоты и аминогруппой первой аминокислоты, связанной со смолой. Эта последовательность процедур повторяется с последующими аминокислотами до тех пор, пока все аминокислоты не связываются со смолой. И, наконец, защищенный пептид отщепляется от смолы обычным способом, известным для специалистов, например способом аминолиза с использованием циклогексиламида, и защищающие группы удаляются с образованием желаемого пептида. Способы расщепления, используемые для отделения пептида от смолы и для удаления защищающих групп, зависят от выбора смолы и защищающих групп и уже известны для специалистов, занимающихся синтезом пептидов.

Пептиды могут быть получены также стандартными способами синтеза в растворе, включающими ступенчатое или массовое сопряженное связывание аминокислоты или пептидных фрагментов с применением химических или ферментных методов получения амидной связи. Эти способы синтеза в растворе хорошо известны для специалистов в данной области.

Пептиды, отвечающие изобретению, проявляют биологическое действие, аналогичное действию человеческого тимопентина. Эта биологическая активность определяется прежде всего путем анализа с измерением индуцирования образования циклической GMР в человеческой Т-клеточной линии в сопоставлении c человеческим тимопентином. Индуцирование образования СМР пептидом, отвечающим изобретению, в данном анализе указывает на способность этого пептида связываться с рецепторным сайтом человеческого тимопентина на клетке и индуцировать биологическую активность, аналогичную человеческому тимопентину.

Многие описываемые пептиды имеют другие очень важные преимущества. Многие пептиды, отвечающие изобретению, могут характеризоваться стойкостью к ферментному разложению как расщепляющими, так и сывороточными ферментами. Таким образом, они проявляют длительное время полужизни при вводе путем инъекции в биологический субъект. Другим преимуществом многих из этих пептидов является их способность к оральному вводу. Ввиду иммуномодуляторных характеристик заявленных пептидов они находят терапевтическое применение для лечения людей и возможно животных, поскольку они обладают способностью индуцировать дифференциацию и созревание Т-клеток, которые способны участвовать в иммунной реакции организма. В результате заявленные пептиды могут рассматриваться как пептиды многоцелевого терапевтического использования.

Предлагаемые пептиды способны сообщать общий иммунитет организму в том отношении, что они повышают или придают способность к терапевтическому стимулированию клеточного иммунитета. Заявленные пептиды или содержащие их фармацевтические композиции находят полезное применение там, где потерян клеточный иммунитет, и особенно там, где имеется иммунологическая недостаточность. Таким образом, они используются для лечения заболеваний, связанных с аллергическими реакциями и аутоиммунными реакциями. Там, где имеет место избыточное продуцирование антител, или клеточный иммунитет, вызванный разбалансированными Т-клетками, заявленные пептиды могут корректировать это состояние за счет стимулирования активности Т-клеточного супрессора. Они находят полезное терапевтическое использование для некоторых аутоиммунных заболеваний, при которых продуцируются повреждающие антитела, таких как красная волчанка, ревматоидный артрит и другие. В наиболее широком применении описываемые пептиды или содержащие их фармацевтические соединения используются для регуляции иммунной системы человека или животного, требующих такой регуляции. Под понятием "регуляция" имеется ввиду то, что описываемые соединения приводят к возврату иммунной системы от аномального состояния, т.е. состояния заболевания, к нормальному равновесному состоянию. Хотя такая регуляция может найти широкое применение в корректировании иммунологических отклонений, например синдром Дигеорга, она может использоваться также для корректирования состояний повышенной иммунологической активности, например аутоиммунные заболевания. Таким образом, изобретение охватывает способы регуляции иммунной системы человека или животного, нуждающихся в такой регуляции, которые (способы) заключают в себя ввод в организм человека или животного иммунорегуляторно-эффективное количество по меньшей мере одного из пептидов, а также охватывает фармацевтические композиции для осуществления этих способов. Изобретение охватывает способ лечения заболеваний, вызванных абсолютным или полным недостатком иммунной системы организма, особенно в функции Т-клеточного супрессора. Способ включает ввод в организм терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного из пептидов, отвечающих данному изобретению.

Понятие "терапевтически эффективное количество" означает то количество, которое эффективно для лечения указанных выше заболеваний. Изобретение охватывает также способ индуцирования дифференциации и созревания Т-клеток, который включает ввод в организм эффективного индуцирующего количества по меньшей мере одного из пептидов, отвечающих данному изобретению. Кроме того, изобретение охватывает фармацевтические композиции для осуществления этих способов. Для получения фармацевтических композиций, отвечающих изобретению, предлагаемый пептид смешивается как активный ингредиент с фармацевтическим носителем согласно принятым в фармацевтике способам компаундирования. Носитель может иметь различные формы, которые зависят от формы препарата, желаемой для ввода в организм, например для орального, подъязычного, ректального, носового или парэнтерального ввода. При приготовлении композиций в предпочтительной дозированной форме для орального ввода может использоваться любая обычно применяемая фармацевтическая среда. Для приготовления жидких препаратов для орального ввода, например суспензий, эликсиров и растворов, может использоваться среда, содержащая, например, воду, масла, спирты, ароматизирующие средства, предохраняющие средства, окрашивающие агенты и т.д. Для приготовления твердых препаратов орального ввода, например порошков, капсул, таблеток, могут использоваться такие носители, как крахмал, сахара, разбавители, гранулирующие агенты, смазочные вещества, связующие, расщепляющие агенты и т.д. Могут использоваться также формы препарата с регулируемым выделением. Ввиду легкости ввода в организм таблетки и капсулы являются наиболее предпочтительной дозированной формой орального ввода и в этом случае используются твердые фармацевтические носители. При желании таблетки могут иметь сахарное покрытие или энтеросолюбильное покрытие, наносимое стандартными способами.

Для продуктов парэнтерального ввода носитель обычно включает стерильную воду, хотя могут быть включены и другие ингредиенты, способствующие, например, растворимости или для защитных целей. Могут приготавливаться также вводимые путем инъекций суспензии, в случае чего могут использоваться подходящие жидкости, суспензирующие агенты и т.д.

Пептиды, отвечающие изобретению, обычно активны при вводе их в количествах примерно 1 г/кг веса тела, и предпочтительно в количестве примерно 0,001-10 мг/кг веса, хотя могут быть использованы и более низкие дозы. Обычно такой же диапазон дозированных количеств может использоваться для лечения заболеваний или состояний, указанных выше, связанных с иммунной недостаточностью. Для подавления избыточной иммунной активности используются более высокие дозированные количества, например около 10-100 мг/кг веса тела.

При описании примеров используются следующие аббревиатуры: ТFA трифторуксусная кислота; НОАс уксусная кислота; СH₂Cl₂ хлористый метилен; СH₃CN ацетонитрил; DMF диметилформамид; NH₄OAc ацетат аммония; n-BuOH н-бутанол; pyr пиридин; DCC дициклогексилкарбодиимид; HOBt 1-оксибензотриазол; ДМАР диметиламинопиридин; ТСА трихлоруксусная кислота; МеОН метанол; TLC тонкослойная хроматография; ТНF-тетрагидрофуран; EtOAc этилацетат; NaHCO₃ бикарбонат натрия; MgSO₄ сульфат магния; NMM N-метилморфолин; Еt₂О простой диэтиловый эфир; HPLC жидкостная хроматография высокого разрешения; Pd/C палладий на угле; DIEA диизопропилэтиламин; iBuOCOCl изобутилхлорформат; i-Pr₂O диизопропиловый простой эфир; ONp паранитрофениловый сложный эфир; RPMI среда тканевой культуры; PBS фосфатный буферный солевой раствор.

П р и м е р 1. Синтез Arg-Pro-Asp-Val-изопропиламида.

В 40 мл СН₂Сl₂ растворяют 2,25 г BOC-Pro-(Bzl)Asp-Val. Раствор охлаждают в ледяной бане и добавляют в него 0,67 г HOBt и 0,90 г DCC в 4 мл DMF. После перемешивания в течение 10 мин вводят 0,30 г изопропиламина в 5 мл CH₂Cl₂. Смесь перемешивают в ледяной бане в течение 15 мин, затем нагревают до комнатной температуры. По прошествии 3 ч осадок фильтруют. Фильтрат экстрагируют 10%-ным раствором лимонной кислоты, водой и насыщенным раствором NaHCO₃. Органический слой высушивают над MgSO₄ и растворитель отгоняют в вакууме. Полученный продукт представляет собой беловатое твердое вещество, выход 2,32 г. После кристаллизации из EtOAc-iPr₂O получается 1,64 г продукта с температурой плавления 179,5-181,5^оС.

К 0,84 г указанного продукта добавляют 50 мл 40%-ной TFA в СН₂Сl₂. Раствор перемешивают в течение 30 мин, затем растворитель отгоняют в вакууме. После ввода простого эфира в остаточный продукт отгонки образуется твердый Pro(Bzl)Asp-Val-изопропиламидтрифторацетат. В 10 мл DMF растворяют 0,93 г BOC-аргинина. Раствор быстро охлаждают до температуры -20^оС и вводят 18 мл NMM, после чего вводится 0,22 г iBu OCOCl. Смесь перемешивают при температуре -15^oC в течение 20 мин, затем вводят 0,18 мл NMM и охлажденный раствор трифторацетата в 10 мл DMF. Спустя 30 мин охлаждающую баню удаляют и перемешивание продолжается в течение 2 ч. Наибольшая часть растворителя удаляется в вакууме. В остаточный продукт вводят EtOAc и воду. Эти слои отделяют и органический слой экстрагируют раствором лимонной кислоты и двукратно насыщенным раствором NaHCO₃. После удаления растворителя остается бесцветное стекловидное вещество в количестве 1,44 г. Этот продукт очищают посредством испарительной хроматографии на силикагеле 60 с элюированием СH₂Cl₂:MeOH в соотношении 98: 2. Первым элюируемым компонентом является желаемый продукт. Чистые фракции дают 0,53 г продукта. Затем получают 0,32 г продукта, содержащего небольшое количество примесей.

0,53 г очищенного защищенного тетрапептидамида подвергают гидрогенерированию 1 мл муравьиной кислоты в 20 мл МеOH над палладиевой чернью. По прошествии одного часа смесь фильтруют через Целит и промывают водой. МеOН отгоняют в вакууме. Остаточный продукт отгонки разбавляют водой, лиофилизируют и в результате получают 280 г продукта. Этот продукт очищается путем хроматографического разделения на Р-Ceфадексе с элюированием 0,30 М NH₄OАс, рН 5. Фракции, заключающие в себе центр основного пика, объединяют и лиофилизируют и получают 190 мг аморфного твердого Arg-Pro-Asp-Val-изопропиламида.

Аминокислотный анализ: Asp 1,01; PrO 1,03; Val 097; Arg 1,00.

Содержание пептида 96%
Тонкослойная хроматография (Силикагель 60).

Rf(I) 0,44 (n-BuOH HOAc H₂O Руz 15:3:12:10)
Rf(II) 0,65 (ЕtOАс Pуr HOАc H₂O 5:5:1:3)
Rf(III) 0,16 (n-BuOH HOAc H₂O 3:1:1).

П р и м е р 2. Синтез Arg-Lys-Asp-Val-циклогексиламида.

В раствор ВОС-(Bzl)Asp-Val-ONp (1,09 г, 2,0 ммоль) и циклогексиламина (0,27 мл, 1,2 экв) в ТHF (10 мл) вводят HOBt (0,27 г). Полученный желтый раствор перемешивают в течение 24 ч и выпаривают в вакууме. Остаточное масло разбавляют EtOAc и промывают насыщенным NaHCO₃, H₂O, 10%-ной лимонной кислотой и насыщенным солевым раствором. Органическую фазу высушивают над MgSO₄, фильтруют, выпаривают и в результате получают защищенный дипептидамид.

В насыщенный раствор 4,2 М НСl диоксана (10 мл) вводят защищенный дипептид (0,71 г, 1,4 моль). Спустя 60 мин реакционную смесь выпаривают в вакууме и в результате получают бесцветный твердый продукт в виде солянокислой соли (HCl) дипептида. В перемешанный раствор HCl соли дипептида, (СВZ)₃Ary- (CBZ-Lys-ONp (1,34 г, 1,4 ммоль) и НОВt (0,19 г, 1,0 экв) в DMF (10 мл) вводят NMM (0,18 мл). Спустя 16 ч образуется студневидный осадок. Реакционная смесь смешивается с насыщенным раствором NaHCO₃, фильтруется и промывается H₂O, 10%-ной лимонной кислотой и H₂O и Еt₂O. После перекристаллизации из 4% НОАс/ЕtOAc получают (СBZ)₃-Arg-(CBZ)-Lys-(Bzl)-Asp-Val -циклогексиламид в виде бесцветного твердого вещества 1,36 г, 73%
Этот тетрапептид (1,33 г) лишается защиты в HF/анизоле (30 мл/8 мл) в течение 60 мин при температуре 0^oC. Остаточный продукт смешивают с Еt₂O и фильтруют. Соединенные твердые вещества растворяют в 10% НOAc и лиофилизируют и в результате получается Arg-Lys-Asp-Val-циклогексиламид 460 мг.

Этот пептид очищается методом жидкостной хроматографии высокого разрешения (НРLC): колонка Whatman M-20 10/50 ODS-3, скорость потока 10,0 мл/мин, 10% СН₂СN, 0,01 моль, рН 5 NH₄OAc. Осуществляется три инжекционных ввода по 150 мг в 3 мл буферного раствора и фракции, элюируемые в промежутке между 35,0 и 51,6 мин, собираются. После частичного выпаривания в вакууме и лиофилизации получается тетрапептидамид Arg-Lys-Asp-Val-циклогексиламид в виде бесцветного твердого продукта, 410 мг.

Аминокислотный анализ: Arg 1,00; Lys 1,00; Asp 100; Val 0,85.

Тонкослойная хроматография (250 мкм Силикагель G): Rf(I) 0,39 (n-BuOH: HOAc:H₂O:EtOAc 1:1:1:1) Rf (II) 0,61 (n-BuOH:HOAc:H₂O:Pyr 15:3:12:10)
Rf (III) 0,90 (ЕtOAc:HOAc:H₂O:Pyr 5:1:3:5).

П р и м е р 3. Синтез Ary-Lys-Asp-Val-пиперидинамида.

В перемешанный раствор BOC-(Bzl)-Asp-Val-ONp (2,72 г, 5,00 ммоль) и пиперидина (0,6 мл, 1,2 экв) в ТHF (10 мл) вводят HOEt (0,68 г, 1,0 экв.). Спустя 48 ч этот желтый раствор выпаривается в вакууме. Маслянистый остаточный продукт растворяется в EtOAc и промывается по одному разу насыщенным раствором NaHCO₃, холодным 2 М NaOH, два раза H₂O, один раз 10%-ной лимонной кислотой и насыщенным солевым раствором. Органическая фаза высушивается MgSO₄ и получается бесцветное масло BOC-(BZl)-Asp-Val-пиперидинамид, 2,36 г.

После очистки методом испарительной хроматографии с элюированием МеОН/СH₂Cl₂ получается защищенный дипептидамид в виде бесцветного твердого вещества, 1,65 г, 67%
В 4,2 М HCl-диоксан (10 мл) вводится защищенный дипептидамид (1,06 г, 2,17 ммоль). Спустя 1 ч раствор выпаривается в вакууме, растворяется в СН₂Сl₂ и снова выпаривается, и в результате получается HCl-соль в виде бесцветного масла.

В перемешанный раствор (CBZ₃-Arg-(CBZ)-Lys-OWp (2,08 г, 2,17 ммоль), бесцветного масла, описанного выше, и HOBt (0,29 г) в DMF (10 мл) вводится NММ (0,29 мл). Спустя 1 ч начинает образовываться осадок. Спустя 16 ч реакционная смесь смешивается с водой. Продукт экстрагируется ЕtOAc и промывается насыщенным раствором NaHCO₃, H₂O, 10% лимонной кислотой, Н₂O и Еt₂О. После перекристаллизации из HOAc/EtOAc/Et₂O получается (СBZ)₃-Arg-(CBZ)-Lys-(Bzl)-Asp-Val-пиперидинамид в виде бесцветного твердого вещества, 2,40 г, 91%
Защищенный тетрапептид (1,87 г, 1,55 ммоль) смешивается в продуваемом азотом 10% -ном НОAc (100 мл), к которому добавляется 10%-ный PdC (0,8 г). Смесь перемешивается в гидрогенизаторе Парра (500-миллилитровый сосуд, давление 43,5 psi-3 атм). Спустя 48 ч реакционная смесь фильтруется через нейлоновый фильтр 0,45, частично выпаривается, разбавляется H₂O и лиофилизируется, и в результате получается сырой тетрапептид в виде бесцветного твердого вещества, 890 мг. Этот пептид очищается методом НРLC (хроматографии) колонка Ватман-М 10/50 ОDS-3, скорость потока 10,0 мл/мин, 10% СН₃СN, 0,01 моль, рН 5 NH₄OAc. Осуществляется три инжекционных ввода 300 мг в 3 мл буферного раствора, и фракции, элюированные в промежуток времени между 23,0 мин и 44,0 мин, собираются. После частичного выпаривания в вакууме и лиофилизации получается желаемый тетрапептидамид Arg-Lys-Asp-Val-пиперидинамид в виде бесцветного твердого вещества, 510 мг.

Аминокислотный анализ: Arg 0,95; Lys 1,00; Asp 1,02; Val 1,00. Содержание пептида 54,2%
Тонкослойная хроматография (25 мк, Силикагель G). Rf (I) 0,31 (n-ВuOH: HOAc: H₂O: EtOAc 1: 1:1:1) Rf (II) 0,53 (n-BuOH:НOAc:H₂O:Pуr 15:3:12:10) Rf (III) 0,61 (ЕtOAc:HOAc:H₂O:Pyr 5:1:3:5).

П р и м е р 4. Синтез Arg-Pro-Asp-Val-N-метиламида.

В перемешанный раствор BOC-Val (10,86 г, 50,0 ммоль) и DIFA (8,70 мл, 1,0 экв), метиламина HCl (3,38 г, 1,0 экв) и НОВТ (7,66 г, 1,0 экв) в СН₂Сl₂ и DMF при соотношении 12:5 (85 мл) вводят DCC (10,32 г, 50,0 ммоль). Образуется осадок. Спустя 2 ч реакционная смесь фильтруется и фильтрат выпаривается досуха. Маслянистый остаток растворяется в ЕОАс и трижды промывается насыщенным раствором NaHCO₃, H₂O, 10%-ной лимонной кислотой и насыщенным солевым раствором. После сушки на Na₂SO₄органическая фаза фильтруется и выпаривается, и в результате получается бесцветный твердый продукт. Измельчение его в горячем гексане дает желаемый амид, BOC-Val-метиламид, 7,98 г, 69% температура плавления 120-122^оС.

К этому амиду (4,60 г, 20,0 ммоль) добавляется (50) ТFA/CH₂Cl₂ (20 мл). После перемешивания в течение 30 мин раствор выпаривается при температуре менее чем 30^оС, маслянистый остаток выпаривания растворяется в СН₂Сl₂, промывается двукратно насыщенным раствором NaHCO₃. Органическая фаза высушивается над Na₂SO₄, фильтруется и выпаривается, и в результате получается Val-метиламид, 1,90 г, 73%
К перемешиваемому раствору BOC-Bzl-Asp (4,72 г, 14,6 ммоль), Val-метиламида (1,90 г, 14,6 ммоль), HOBt (2,24 г, 1,0 экв) в DMF (20 мл) вводится DCC (3,01 г, 14,6 ммоль). Через 5 мин образуется осадок. Спустя 16 ч реакционная смесь фильтруется и фильтрат смешивается с полунасыщенным раствором NaHCO₃.

Полученные твердые вещества соединяются, промываются H₂O, 10%-ной лимонной кислотой, H₂O и Et₂O, высушиваются воздухом и получается бесцветное твердое вещество. После перекристаллизации из EtOAc получается желаемый дипептидамид, 5,85 г, 90% BOC-(Bzl)-Asp-Val-метил- амид.

К этому дипептидамиду (3,94 г, 9,05 ммоль) добавляется 50% TFA/CH₂Cl₂ (20 мл). После перемешивания в течение 30 мин раствор выпаривается при температуре менее чем 30^оС и перемешивается с Et₂О, в результате получается TFA дипептид, 4,10 г, 100% в виде бесцветного стекловидного вещества.

К перемешанному раствору BOC-Pro (1,95 г, 0,95 ммоль), ТFA дипептида (4,10 г, 9,05 ммоль), DIEA (1,73 мл, 1,1 экв), DMA (0,12 г, 0,1 экв) добавляется DCC (1,87 г, 9,05 ммоль). Через 5 мин образуется осадок. Спустя 16 ч реакционная смесь фильтруется и фильтрат смешивается с полунасыщенным раствором NaHCO₃. Полученный твердый продукт извлекается, промывается H₂О, 10% -ной лимонной кислотой, H₂О и Еt₂О, высушивается воздухом и в результате получается желаемый трипептидамид, 4,15 г, 86% Этот продукт используется без очистки.

К этому амиду (4,15 г, 7,78 ммоль) добавляется 50% TFa/CH₂Cl₂ (15 мл). После перемешивания в течение 30 мин раствор выпаривается при температуре ниже чем 30^oC, перемешивается с Et₂О и в результате получается TFA трипептид, 4,26 г, 100% в виде бесцветного твердого вещества.

В перемешанный раствор 86,9 АОС-TOS-Arg (39,7 г, 7,78 ммоль), трипептидамида (4,25 г, 7,78 ммоль), NMM (0,86 мл, 1,1 экв) и HOBt (1,19 г, 1,0 экв) в DMF (15 мл) вводят DCC (1,61 г, 7,78 ммоль). Через 10 мин образуется осадок. Спустя 16 ч реакционная смесь фильтруется и фильтрат смешивается с полунасыщенным раствором NaHCO₃. Полученный твердый продукт извлекается, промывается H₂O, 10% -ной лимонной кислотой, Н₂О простым эфиром, высушивается воздухом и в результате получается защищенный тетрапептидамид, 4,82 г, 72% Половина этого твердого продукта лишается защиты в 50% TFA/CH₂Cl₂ (10 мл) в течение 30 мин, выпаривается в вакууме и перемешивается с Et₂O. Полученный твердый продукт расщепляется HF /анизолом (30 мл/8 мл) в течение 60 мин при температуре 0^оС. Остаточный продукт перемешивается в EtOAc и экстрагируется двукратно 10% HOАc (50 мл). Водные экстракты лиофилизируются и в результате получается сырой Arg-Pro-Asp-Val-метиламид.

Этот сырой продукт очищается на SPC-25 Sephadeх (колонка размерами 2,6 х 83 см, 0,04-0,3 М NH₄OAc, рН 6,5; градиент: 100 мл/ч (скорость потока), 9,5 мл/фракция, 206 нм (детектор). Фракции 113-128 собираются и лиофилизируются, и в результате получается 925 мг тетрапептидамида, Arg-Pro-Asp-Val-метиламид.

Аминокислотный анализ: Arg 1,06; Pro 0,99; Asp 0,95; Val 1,00.

Содержание пептида 54%
Тонкослойная хроматография (250 мк, Силикагель G). Rf (I) 0,20 (n-BuOH: HOAc: H₂O: Верхняя фаза 4:1:5) Rf (II) 0,26 (n-BuOH:HOAc:H₂O:Pуr 15:3:12:10) Rf (III) 0,26 (ЕtOAc:HOAC:H₂O:Pyr 5:1:3:5).

П р и м е р 5. Синтез N-формил-Arg-Pro-Asp-Val-метиламида.

В AOC-(TOS)-Arg-Pro-(Bzl)-Asp-Val-метиламид (1,00 г, 1,17 ммоль) вводится 4,5 М HCl Диоксан (10 мл). Спустя 60 мин реакционная масса испаряется, разбавляется H₂O и лиофилизируется, и в результате получается HCl Тетрапептид в виде бесцветного твердого порошкообразного вещества, 0,92 г, 100%
Этот твердый продукт растворяется в DMF (10 мл) и вводится DIFA (0,93 мл, 4,0 экв), DMAP (0,08 г) и пара-нитрофенилформат (200 мг, 1,02 экв). Через 2 ч реакционная смесь обрабатывается 10%-ной лимонной кислотой. Полученный твердый продукт фильтруется, промывается Н₂О, высушивается воздухом и в результате получается формилированный пептидамид, 0,41 г.

Этот твердый продукт расщепляется HF/анизолом (30 мл/8 мл) в течение 60 мин при 0^оС. Остаточный продукт перемешивается в ЕtOAc и экстрагируется двукратно 1% NH₄OH (50 мл). Водные экстракты лиофилизируются, и в результате получается сырой пептид, N-формил-Arg-Pro-Asp-Val-метиламид. Этот сырой продукт очищается на DEAE Сефадексе (колонка 2,6 х 90 см, 0,1 М H₄HCO₃, небуферный раствор; скорость потока 100 мл/ч, 10 мл/фракция, 206 нм детектор). Фракции 38-43 собираются, лиофилизируются и в результате получается амидированный пептид, 80 мг.

Аминокислотный анализ: Arg 1,00; Pro 1,00; Asp 1,00; Val 1,00.

Содержание пептида 50%
Тонкослойная хроматография 250 мк Силикагель G). Rf (I) 0,32 (n-ВuOH:HOAc:H₂O:Верхняя фаза 4:1:5)
Rf (II) 0,38 (ЕtOAc:НOAc:H₂O:Pyr 5:1:3:5) Rf (III) 0,34 (трифторэтанол: NH₄OH 1:1).

П р и м е р 6. Синтез Arg-Lys-Asp-Val-2-фенилгидразина.

В перемешанный раствор BOC-Val (4,34 г, 20,0 ммоль) в THF (40 мл) при температуре -15^оС вводится NMM (2,30 мл), а затем вводится i-BuOCOCl (2,64 мл). Полученная суспензия перемешивается в течение 15 мин и затем по каплям вводится фенилгидразин (1,98 мл). Суспензия перемешивается при температуре от -10 до 0^оС в течение 1 ч и затем нагревается до комнатной температуры. Реакционная смесь фильтруется и фильтрат выпаривается при пониженном давлении. Остаточный продукт растворяется в EtOAc и промывается насыщенным раствором NaHCO₃, H₂О и насыщенным солевым раствором.

Органическая фаза высушивается над Na₂SO₄, фильтруется, выпаривается и в результате получается твердое оранжевое вещество. После перекристаллизации из СH₂Cl₂/петролейного эфира получается BOC-Val-2-фенилгидразин в виде бесцветного твердого вещества, температура плавления 140-141^оС, 4,96 г, 74%
В перемешанный раствор 4,2 М HCl диоксана (10 мл) вводится BOC-Val-2-фенилгидразин (1,13 г, 3,68 ммоль). Спустя 1 ч реакционная смесь выпаривается в вакууме, перемешивается в Et₂O и фильтруется, и в результате получается Val-2-фенилгидразин в форме ди-HCl соли, в виде бесцветного твердого продукта, 1,03 г.

В перемешанный раствор этой ди-HCl cоли (1,03 г, 3,68 ммоль). BOC-(Bzl)-Asp (0,88 г) и HOBt (0,37 г) в THF (10 мл) вводится NMM (0,60 мл) и затем DCC (0,56 г). Почти сразу же образуется осадок. По прошествии 16 ч реакционная смесь фильтруется и фильтрат выпаривается в вакууме. Этот остаточный продукт выпаривания растворяется в ЕtOAc, промывается насыщенным раствором NaHCO₃ и солевым раствором. Органическая фаза высушивается над Na₂SO₄, фильтруется и выпаривается в вакууме. После перекристаллизации из EtOAc/гексана получается BOC-(Bzl)-Asp-Val-2-фенилгидразин в виде бесцветного твердого вещества, 1,07 г, 64%
В перемешанный раствор 4,2 М HCl диоксана (10 мл) вводится BOC дипептид фенилгидразид (1,07 г, 1,75 ммоль). Спустя 60 мин раствор выпаривается в вакууме и получается бесцветное масло, (Bzl)-Asp-Val-2-фенилгидразидхлоргидрат.

В перемешанный раствор (CBZ)₃-Arg-(CBZ)Lys-0 Np (1,68 г) масла и HOBt (0,24 г) в DMF (6 мл) вводится NMM (0,6 мл). Спустя 16 ч образуется студневидный осадок. Реакционная смесь смешивается с насыщенным раствором NaHCO₃ и твердые вещества извлекаются, промываются H₂O, 10%-ной лимонной кислотой, H₂O и Et₂O. После перекристаллизации из 2% HOAc/EtOAc получается (CBZ)₃ Ary-(CBZ)-Lys-(Bzl)-Asp-Val-2-фенилгидразид в виде бесцветного твердого вещества, 2,15 г, 92% Этот защищенный пептид (1,88 г) расщепляется в HF/анизоле (30 мл/8 мл) в течение 60 мин при 0^оС. Остаточный продукт расщепления смешивается с Et₂O и фильтруется. Твердые продукты экстрагируются 10% HOAc (100 мл) в течение 1 ч, фильтруются, экстракт лиофилизируется и в результате получается Arg-Lys-Asp-Val-2-фенилгидразид в виде бесцветного твердого вещества, 890 мг. Этот сырой пептид очищается на СМ Сефадексе (колонка 2,6 х 83 см) 0,3 М NН₄ОАс, небуферный раствор; скорость потока 10 мл/ч, 12,5 мл/фракция, 225 нм детектор).

Фракции 270-310 собираются, лиофилизируются и в результате получается 390 мг конечного продукта, Arg-Lys-Asp-Val-2-фенилгидразида.

Аминокислотный анализ: Arg 0,98; Lys 1,03; Аsp 1,00; Val 0,99. Содержание пептида 83%
Тонкослойная хроматография: (250 мк Силикагель G) Rf (I) 0,39 (n-BuOH: HOAc: H₂O: ЕtOAc 1: 1:1:1) Rf (II) 0,51 (n-BuOH:HOAc:H₂O:Pyr 15:3:12:10) Rf (III) 0,59 (ЕtOAc:HOAc:H₂O:Pyr 5:1:3:5).

П р и м е р 7. Синтез Arg-Lys-Asp-Val-анилинамида.

В перемешанный раствор BOC-Val (4,35 г, 20,0 ммоль), анилин (3,0 мл, 1,05 экв) и HOBt (3,09 г, 1,0 экв) в DMF (20 мл) при комнатной температуре вводится DCC (4,12 г, 20,0 ммоль). В течение 5 мин образуется густой осадок. Спустя 4 ч реакционная смесь фильтруется и фильтрат вливается в полунасыщенный NaHCO₃ (50 мл). Образующийся осадок извлекается. Твердые вещества промываются H₂O (1: 1) и высушиваются в воздухе. После перекристаллизации из гексана-изопропанола получается бесцветный твердый продукт анилид BOC-Val-анилинамид, 3,76 г, 64%
Этот BOC-Val-анилинамид (2,50 г, 8,55 ммоль) растворяется в 50% ТFA/CH₂Cl₂ (10 мл) и перемешивается в течение 30 мин. Реакционная смесь выпаривается в вакууме при комнатной температуре, и остаточный продукт выпаривания растворяется в СН₂Сl₂. Этот раствор промывается двукратно насыщенным раствором NaHCO₃, высушивается над MgSO₄, фильтруется и выпаривается, и в результате получается Val-анилинамид в виде бледно-желтого масла, 1,42 г, 88%
В раствор BOC-(Bzl)-Asp (2,38 г, 1,0 экв), Val-анилинамид и HOBt (1,13 г) в DMF (7,5 мл) вводят DCC (1,52 г, 1,0 экв). Образуется осадок, и реакционная смесь перемешивается в течение 3 ч. Смесь фильтруется, фильтрат смешивается с насыщенным раствором NaHCO₃. Полученные твердые вещества извлекаются, промываются H₂O и высушиваются воздухом. После перекристаллизации из EtOAc/петролейного эфира получается бесцветный BOC-дипептидамид, температура плавления 121-122^оС, 1,74 г, 46% BOC-(Bzl)-Asp-Val-анилинамид.

BOC дипептид (1,71 г, 3,44 ммоль) растворяется в 50 TFA/CH₂Cl₂ (10 мл) и перемешивается в течение 30 мин. Реакционная смесь выпаривается в вакууме при комнатной температуре и остаточный продукт перемешивается в простом эфире, фильтруется и высушивается воздухом.

В перемешанный раствор BOC-(Cbz)-Lys (1,33 г, 3,50 ммоль) в DMF (10 мл) при температуре -20^оС вводится NMM (0,46 мл, 1,2 экв) и затем i-BuOCOCI (0,46 мл, 1,01 экв). Полученная суспензия перемешивается в течение 30 мин и затем вводится TFA соль дипептида, а затем NMM (0,46 мл). Реакционная смесь перемешивается и нагревается до комнатной температуры. Спустя 1 ч реакционная смесь вливается в полунасыщенный раствор NaHCO₃ (20 мл). Образуется бесцветное твердое вещество. Это вещество извлекается и высушивается воздухом. После перекристаллизации из EtOAc/i-Pr₂O получается BOC трипептидамид, 2,05 г, 78% температура плавления 164-167^оС.

BOC трипептидамид (2,00 г, 2,63 ммоль) растворяется в 50% ТFA/CH₂Cl₂ (6 мл) и перемешивается в течение 30 мин. Реакционная смесь выпаривается при комнатной температуре в вакууме, и остаток выпаривания измельчают в простом эфире, фильтруют и высушивают воздухом, и в результате получают соль ТFA.

В перемешанный раствор (СBZ)₃ Arg (1,52 г, 2,63 ммоль) в DMF при температуре -20^оС вводят NMM (0,35 мл, 1,2 экв) и затем i-BuOCOCl (0,35 мл, 1,01 экв). Полученную суспензию перемешивают в течение 30 мин. Затем вводят NMM (0,35 мл), а затем соль ТFA. Реакционную смесь нагревают до комнатной температуры в течение 1 ч. Смесь вливают в насыщенный раствор NaHCO₃ и полученные твердые вещества фильтруют, промывают Н₂О и высушивают воздухом. После перемешивания в ЕtOH получают защищенный тетрапептид, BOC-(CBZ)-Lys-(BZl)-Asp-Val-анилинамид, 2,55 г, 78%
В переменную суспензию тетрапептида (2,30 г, 1,89 ммоль) в трифторэтаноле (50 мл) и муравьиной кислоте (97% 5 мл) вводят палладиевую чернь (0,95 г). Реакционную смесь интенсивно перемешивают. Спустя 1 ч раствор фильтруют через Целит и промывают H₂O. Фильтрат частично выпаривают в вакууме, остаточный продукт лиофилизируют, в результате получают бесцветное твердое вещество, 0,89 г.

Сырой пептид очищают на SPC-25 Cефадексе (колонка 2,6 x 89 см, 0,1-0,3 моль NH₄OAc; рН 5 градиент; скорость потока 100 мл/ч, 15 мл/фракция, 206 нм детектор). Фракцию 253-285 собирают, лиофилизируют и в результате получают 680 мг Arg-Leu-Asp-Val-анилинамид.

Аминокислотный анализ: Arg 1,00; Lys 0,98; Asp 1,00; Val 1,01.

Содержание пептида 100%
Тонкослойная хроматография (250 мк Силикагель G) Rf (I) 0,42 (EtOAc: HOAc: H₂O: Pyr) (5: 1:3:5) Rf (II) 0,32 (nBuOH:HOAc:H₂O:Et0Ac) (1:1:1:1) Rf (III) 0,54 (nBuOH:HOAc:H₂O:Pyr) (15:3:12:1)
П р и м е р 8. Синтез Arg-Lys-Asp-Val-метиламида.

А. Na-трет.-бутилоксикарбонил-(N-бензилоксикарбонил)-лизил-(β-бензил)-аспар- тил-валин-метиламид.

В 50 мл 85%-ной уксусной кислоты растворяют 3,21 г Na-трет. бутилоксикарбонил-(N-бензилоксикарбонил(лизил-(β- бензил)аспартил)-валил-пенацилового сложного эфира. Вводят цинковый порошок (5,2 г) и смесь перемешивается интенсивно в течение одного часа. Реакционная смесь фильтруется, фильтрат разбавляется водой и экстрагируется трехкратно этилацетатом. Соединенные органические слои экстрагируются водой и насыщенным водным раствором хлорида натрия, затем высушиваются над безводным сульфатом магния. После удаления растворителя остается масло. Вводится простой эфир, затем гексан и образуется смолистый осадок. Этот продукт перемешивается с растиранием с гексаном до тех пор, пока не получается сухое белое твердое вещество в количестве 1,75 г. Этот продукт растворяется в 14 мл этилацетата и 1 мл диметилформамида. После охлаждения раствора до -20^оС вводится 0,30 мл N-метилморфолина, затем вводится по каплям 0,36 г изобутилхлорформата. Реакционная смесь перемешивается при -15^оС в течение 20 мин, затем вводится 0,29 мл N-метилморфолина и охлажденный раствор 0,18 г хлоргидрата метиламина в 10 мл 95%-ного этанола. Образуется густой осадок. Для ускорения перемешивания вводится 5 мл диметилформамида и смесь перемешивается при 0^оС в течение 90 мин, затем при комнатной температуре в течение 30 мин. Реакционная смесь вводится в 75 мл воды. Органическая фаза при перемешивании смеси превращается в глобулы воскообразного твердого вещества. Это твердое вещество фильтруется и фильтрат экстрагируется этилацетатом. Остаточный продукт испарения органической фазы соединяется с данным твердым продуктом и кристаллизуется из смеси этилацетат-изопропиловый эфир. Выход продукта составляет 1,53 г, точка плавления 183,5-184,5^оС.

Данные элементарного анализа: C 61,67 (61,96); Н 7,21 (7,37); N 9,81 (10,04).

В. Три-бензилоксикарбонил-аргинил-(N-бензилоксикарбонил)-лизил-(β-бензил) Asp-артил-валин-метиламид
В 1,46 г продукта из раздела А вводят 50 мл 50%-ной трифторуксусной кислоты в метиленхлориде. После перемешивания в течение 25 мин растворитель выпаривается, в остаточный продукт выпаривания вводится простой эфир и получается белый твердый продукт. Этот продукт фильтруется и промывается простым эфиром.

Трибензилоксикарбонил-аргинин (1,33 г) растворяется в 10 мл DMF. Раствор охлаждается до -20^оС и вводится 0,25 мл N-метил-морфолина с последующим вводом 0,31 г изобутилхлорформата в 2 мл DMF. Смесь перемешивается при температуре -20^оС в течение 20 мин, затем вводится 0,26 мл N-метилморфолина и охлажденный раствор трипептидтрифторацетата в 10 мл DMF. Реакционная смесь перемешивается при температуре (-20)-(-10)^оС в течение 30 мин, затем при комнатной температуре в течение ночи. По прошествии 16 ч смесь вводится в 125 мл воды. Осадок извлекается путем фильтрации и промывается теплым метанолом и этилацетатом. Выход продукта составляет 1,74 г, точка плавления 118-120^оС.

Аминокислотный анализ: Аsp 0,99; Val 1,03; Lys 0,98; Arg 1,00; cодержание пептида 67,7%
С. Арнинил-лизил-аспартил-валин-метиламид
1,72 г продукта из раздела В подвергается восстановлению 2 мл муравьиной кислоты над 1 г палладиевой черни в 40 мл трифторэтанола с целью удаления защиты. Смесь быстро перемешивается в течение полутора часов в узкогорлой колбе. Палладий удаляется путем фильтрации через Целит с промывкой в воде. Наибольшая часть трифторэтанола удаляется из фильтрата во вращающемся испарителе. Остаточный продукт разбавляют 5%-ной уксусной кислотой и лиофилизируют. Выход продукта 676 мг.

Пептид очищают путем хроматографического разделения в колонке с SP-Сефадексом размерами 2,6 x 85 см с элюированием градиентом 0,20-0,50 н. NH₄OAc, рН 5,5, 3 л. Фракции по 10 мл собирают, осуществляют контроль при 206 нм. Основной пик обнаруживают в фракциях 185-220. Отбирают три фракции: 185-190, 191-205, 206-220. В результате лиофилизации получают выходы соответственно 21 мг, 497 мг и 235 мг. Первая фракция содержит примесь, две другие фракции имеют степень чистоты более чем 99,5%
Анализ методом жидкостной хроматографии высокого разрешения, M. Bondapak C₁₂:rt 8,5 мин с 0,01 М NH₄OAc, рН 5 при 2,0 мл/мин.

Аминокислотный анализ: Asp 1,01; Val 0,95; Lys 1,01; Arg 1,02; содержание пептида 56%
Тонкослойная хроматография (Силикагель 60) Rf (I) 0,19 (n-BuOH:HOAc:H₂O: пиридин 15: 3: 12:10). Rf (II) 0,15 (EtOAc: Pyr, H₂O 5:5:1:3) Rf (III) 0,45 (TFA:NH₄OH 2:1).

П р и м е р 9. Синтез Arg-Lys-Asp-Val-2-пропиламида.

А. α-BOC-(CBZ)-Lys-(β-Bzl)-Asp-Val
В быстро перемешанный раствор α-BOC-(CBZ)-Lys-(β-Bzl)-Asp-Val-фенаци- лового сложного эфира (8,02 г, 10,0 ммоль) в 85% НOAc (100 мл) при комнатной температуре вводят подвергнутую травлению кислотой цинковую пыль (12,4 г). По прошествии 1 ч реакционную смесь фильтруют и фильтрат выпаривают в вакууме. Маслянистый остаточный продукт перемешивают с растиранием в Еt₂O. Образующийся твердый продукт извлекают, промывают в Et₂O и высушивают в вакууме при 40^оС, в результате получают 4,95 г, 72%
В. α-ВОС-(Cbz)Lys-(β-Bzl)-Asp-Val-NHCH(CH₃)₂.

В перемешанный раствор BOC трипептида (1,00 г, 1,46 ммоль) в THF (5 мл) при температуре -15^оС вводят NMM (170 мкл, 1,06 экв) и ОСОСl (195 мкл, 1,03 экв). Образующийся слабо мутный раствор перемешивают в течение 15 мин и затем вводят 2-пропиламин (150 мкл, 1,1 экв). Реакционную смесь нагревают до -5^оС. Образуется студневидное твердое вещество и реакционную смесь нагревают до комнатной температуры. Спустя 16 ч реакционную смесь выпаривают в вакууме при 30^оС и твердый остаточный продукт промывают 10%-ной лимонной кислотой, H₂O, насыщенным раствором NaHCO₃ и H₂O. После сушки воздухом получают бесцветный BOC трипептидамид, 2,58 г, 55%
С. (Сbz)₃Arg-(Cbz)-Lys-(β -Bzl)-Val-NHCH(CH₃)₂.

BOC трипептидамид (0,55 г, 0,76 ммоль) растворяют в 4,4 HCl диоксана (5 мл) и перемешивают в течение 45 мин. Раствор выпаривают в вакууме, и твердый остаток растирают в Et₂O. После фильтрации получают бесцветный HCl трипептидамид 0,51 г, 100% В перемешанный раствор НСl трипептидамида, (Сbz)₃-Arg-пара-нитрофенилового сложного эфира (0,53 г, 1,0 экв) и HOBT (0,12 н, 1,0 экв) в DMF (5 мл) при комнатной температуре вводят NMM (92 мкл, 1,1 экв). Происходит медленное образование осадка в течение 16 ч. Студневидную реакционную смесь перемешивают с насыщенным раствором NaHCO₃ и фильтруют. Твердый осадок промывают H₂O, 10%-ной лимонной кислотой, H₂O и Еt₂O. Полученный защищенный тетрапептидамид перекристаллизовывают из HOAc/ЕtOAc, в результате получают бесцветное твердое вещество, 743 мг, 83%
Д. Arg-Lys-Asp-Val-NHCH(CH₃)₂
Защищенный тетрапептид (0,70 г, 0,59 ммоль) суспендируют в 90% НОАс (50 мл). Смесь продувают N₂ и обрабатывают 10% Pd/C (0,4 г). После гидрогенизации во встряхиваемой аппаратуре Парра (сосуд емкостью 250 мл, P_o 52,0 psi 3,64 атм) в течение 64 ч, фильтрации через найлоновый фильтр 0,45 мкм, частичного выпаривания и лиофилизации получают сырой тетрапептид, 385 мг.

Сырой пептид очищают на СМ Сефадексе (колонка 2,6 x 93 см, 1,7 л, 0,2 моль, затем 0,3 моль, NH₄OAc, небуферный раствор; скорость потока 100 мл/ч, 10 мл/фракция, 225 нм детектор). Фракции 335-370 сливаются и лиофилизируются и получается 231 мг продукта.

Аминокислотный анализ: Arg 1,00; Lys 1,02; Аsp 0,98; Val 1,00; содержание пептида 80,3%
Тонкослойная хроматография (250 мк, Силикагель G) Rf (I) 0,24 (n-BuOH: HOAc:H₂O:EtOAc 1:1:1:1) Rf (II) 0,52 (n-BuOH:HOAc:H₂O:пиридин 15:3:12:10)
Rf (III) 0,61 (ЕtOAc:HOAc:H₂O:пиридин 5:1:3:5).

Биологическая активность анализ циклической GMP.

В данном анализе определяется способность пептида, отвечающего изобретению, связываться с клеточным мембранным рецептором СЕМ клетки и избирательно стимулировать образование циклической СМР, как человеческого тимопентина.

Клеточная линия СЕМ была получена из Коллекции культур Американского типа, Роквил, Md, Клетки СЕМ высевались, выращивались в течение 3 дней и собирались.

Клетки три раза промывались в PBS и повторно суспензировались в РРMI 1640 с концентрацией 1,0х10⁷ клеток/мл, и уравновешивались при 37^оС в течение 30 мин, после чего вводились испытываемые пептиды (25 мкл) и контрольные пептиды. Осуществлялось инкубирование во встряхиваемой водяной бане в течение 4-5 мин и затем процесс прекращался вводом 1 мл охлажденной льдом ТСА (10%).

Клетки в ТСА гомогенизировались и подвергались воздействию ультразвука для выделения циклического нуклеотида. Эта суспензия центрифугировалась с ускорением 3000 х g в течение 20 мин при 4^оС. Полученный осадок растворялся в 0,1 н. NaOH с целью определения содержания белка. ТСА удалялась из поверхностной фракции путем 4-кратной экстракции 5 мл насыщенного водой Et₂O. После окончательной экстракции оставшиеся следы эфира удалялись путем нагревания в течение 10 мин в водяной бане с температурой 50^оС. После лиофилизации образец вводили в 50 мМ ацетатный буферный раствор (рН 6,2) для радиоиммуноанализа циклической СМР.

Например, для каждого соединения была определена кривая "доза реакция" с использованием 1000 мкг/мл пептида. Для каждого испытываемого пептида была определена пороговая активность. Она определена как наименьшая концентрация испытываемого пептида, которая индуцировала внутриклеточный уровень циклической GMP более чем на два стандартных отклонения выше контрольного. Контрольные образцы имели значения внутриклеточной циклической GMP менее чем 0,9 пкмоль/мл (среднее значение ± стандартное отклонение). Результаты испытаний считались положительными, если уровень циклической GMP более чем в 2 раза превышал уровень, который был определен для параллельного отрицательного контрольного образца. Активные пептиды имели пороги активности в пределах от 1 до 10 г/л.

Таблица иллюстрирует результаты анализа циклической GMP. Положительные (+) результаты показывают, что уровень действия циклических GMP более чем в 2 раза превышает уровень, определенный для параллельного отрицательного контроля.

П р и м е р 9. Ферментная стойкость.

Для иллюстрации стойкости пептида к разложению кишечным и сывороточным ферментами, пептид Arg-Pro-Asp-Val-изопропиламид может инкубироваться при температуре 37^оС в кишечном соке и человеческой сыворотке в течение времени вплоть до 120 мин. Для сравнения аналогичным образом обрабатываются такие пептиды, как Arg-Lys-Asp-Val-диметиламид и тимопентин. Анализ методом жидкостной хроматографии высокого разрешения показал, что Arg-Lys-Asp-Val-диметиламид полностью вываривается лишь через несколько секунд. При этих условиях тимопентил разлагается на 50% в течение примерно 20 с. Предлагаемые пептиды сохраняются практически неразложенными как в сыворотке, так и в кишечном соке в течение более длительного времени, чем тимопентин или контрольный пептид.

Использование: в биологии и медицине для регулирования иммунной функции млекопитающих. Сущность изобретения: пептиды ф-лы (I): NR₁R₂, где NR₁R₂ - метиламид, 2-фенилгидразин, пиперидинамид, циклогексиламид и изопропиламид, и композиция, содержащая соединения ф-лы I и фармацевтически приемлемый носитель, причем соединения ф-лы I - в количестве 0,001 - 100 мг/кг массы. 2 с. и 2 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Пептиды общей формулы I
Arg Lys Asp Val NR₁R₂,
где -NR₁R₂ выбирают из группы, включающей анилинамид, метиламид, 2-фенилгидразин, пиперидинамид, циклогексиламид и изопропиламид. 2. Пептиды по п.1, отличающиеся тем, что они обладают способностью регулировать недостаточную или избыточную Т-клеточную функцию организма. 3. Композиция, способная регулировать иммунную функцию млекопитающих, содержащая пептид и фармацевтически приемлемый носитель, отличающаяся тем, что, пептид представлен соединением общей формулы
Arg Lys Asp Val NR₁R₂
где -NR₁R₂ выбирают из группы, включающей анилинамид, метиламид, 2-фенилгидразин, пиперидинамид, циклогексиламид и изопропиламид,
в количестве 0,001 100 мг/кг массы. 4. Композиция по п.3, отличающаяся тем, что она пригодна для орального введения.