Способ получения пептидов Советский патент 1990 года по МПК C07K14/61 A61K38/25 

Изобретение относится к способу получения пептидов - новых биологически активных соединений, которые могут найти применение в медицине и ветеринарии.

Цель изобретения - получение химическим путем новых пептидов, способствующих вьщелению гормона роста гипофизом, более активных, малотоксичных и более доступных соединений.

Синтез пептидов осуп1естш1яют с помощью твердофазного способа.

В тексте описания использованы следуюгцие сокращения: МБГА - п-метил бензгидриламиновая смола OBzl - бензил; Хап - ксантил; Tos - тозил; 2-хлорбензилоксикарбонил;. лев - 2,6-дихпорбензил, Z - бензил- оксикарбонил; Вое - тре-. .бутилокси- карбонил- НОВ Т - 1-оксибензтриазол, DMF - диметилформамид/ TFA - три- фторуксусная кислота,

Пример 1. Синтез пептида ( Туг ,Asp« ,Ala , hGRF(1-29)-NH2 Формулы: N MeTyr-Ala- -Asp-Ala-Ile-Phe-Tyr-Asp-Ser-Tyr- -Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser- -Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile- -Nle-Asn-Arg-NH2 осуществляют стадийно в пептидном синтезаторе Beck- man 990 на смоле МБГН. Связывание (Tos) с указанной смолой приводит к замещению примерно 0,35 ммоль Arg на 1 г смолы, исходная смола взята в количестве 2 г.

После деблокирования и нейтрализации пептидную цепь ступенчато наращивают на указанной смоле. Все используемые растворители тщательнр дегазируют путем барботирования инертным газом, например гелием или азотом, для гарантии отсутствия кислорода, который может привести к не- желательному окислению серы Met-остатка.

Деблокирование в предпочтительном варианте осуществляют по графику А: График А

Реагент Время смешивания, мин 60% TFA/2%

этандитиол10 60% TFA/2%

этандитиол15 IPA/П. этандитиол0,5 EtjN (10%). в CHjCl 0,5 МеОН0,5 EtaN (10%)

в ,0,5

МеОН (дважды)0,5 .

CH-iCli (дважды)0,5

Связьшания предпочтительно осуществлять согласно графику В.

.График ВВремя смеши1598881

Вос-амино- кислота МеОН -(дважды) 5 CHjCl2 (дважРеагентDCC1

вания, мин

Ды)

ACgO (ЗМ) в

, 10 МеОН

CHjCl (дважды) От 1 до 2 ммол аминокислоты в хл .15 используют на 1 г 1 экв. 1,0 молярн в хлористом метил При связывании Boc пользуют смесь из 20 того метилена. Бен пользуют в качеств защитной группы бо Ser и Туг. Аминогр I блокируют Хап (кса 25 используют DCC-свя почтительное. Слож ловый эфир (ONp) м зовать для активац компонента Asn или 3Q Boc-Asn (ONp) можн чение ночи, исполь бензотриазола в 50 формамида и метиле случае .Н,Н -дицикл . (DCC) не прибавляю сикарбонил/ЗС1-г/; честве защитной гр цепи. Tos использую гуанидиновой функц ного азота His, а O ковую гидроксильную Arg. Фенольный гидр ет 2,6-дихлорбензил це.- синтеза получают 45 следующего состава -Ala-Asp(X3)-Ala-Il -Asp(X3)-Ser(X,)-Ty -Lys (X p -Val-Leu-Al -Ser(X)-Ala-Arg(X

-Leu-Gln(X )-Asp(X -Arg(X)-Xj,

где X j означает DCB Xan; Xf - Tos-, X ситель или NH-МБГАможно частично или 55 под действием TFA, деблокирования альф группы. Получено 6, смолы.

50-90 0,5

Вос-амино- кислота МеОН -(дважды) 5 CHjCl2 (дваж0,5

15,0 0,5 0,5

Ды)

ACgO (ЗМ) в

, 10 МеОН

CHjCl (дважды)0,5 . От 1 до 2 ммоль Вос-защищенной аминокислоты в хлористом метилене .15 используют на 1 г смолы вместе с 1 экв. 1,0 молярного раств.ора DCC1 в хлористом метилене в .течение 2 ч. При связывании Boc-Arg (Tos). используют смесь из 50% DMF -и хлорис- 20 того метилена. Бензиловый эфир используют в качестве гидроксильной защитной группы боковой цепи для Ser и Туг. Аминогруппу Asn или Gin I блокируют Хап (ксантином), когда 25 используют DCC-связывание как предпочтительное. Сложный пара-нитрофени- ловый эфир (ONp) можно также использовать для активации карбоксильного компонента Asn или Gin и, например, 3Q Boc-Asn (ONp) можно связывать в течение ночи, используя 1 экв. 1-окси- бензотриазола в 50% смеси из диметил- формамида и метиленхлорида, в этом случае .Н,Н -дициклогексилкарбодиимид (DCC) не прибавляют. 2-хлорбензилок- сикарбонил/ЗС1-г/; используют в качестве защитной группы Lys боковой цепи. Tos используют для блокирования гуанидиновой функции Arg и имидазоль- ного азота His, а OBzl защищает боковую гидроксильную группу Gin или Arg. Фенольный гидроксил Туг защища-, ет 2,6-дихлорбензилом (DCB). В конце.- синтеза получают пептидил-полймер 45 следующего состава: Boc-N MeTyr(X,,)- -Ala-Asp(X3)-Ala-Ile-Phe-Thr(X.)- -Asp(X3)-Ser(X,)-Tyr(X,,)-Arg(X.)- -Lys (X p -Val-Leu-Ala-Gln (X ,) -Leu- -Ser(X)-Ala-Arg(X)-Lys(X)-Leu-Leu-Gln(X )-Asp(X )-Ile-Nle-Asn(X)- -Arg(X)-Xj,

где X j означает DCB; X 3 - OBzl j X ,-- Xan; Xf - Tos-, X 2C1-Z и X g - HO- - ситель или NH-МБГАсмола. Ксантин можно частично или полностью удалить 5 под действием TFA, используемого для деблокирования альфа-аминозащитной группы. Получено 6,2 г пептидной смолы.

Для отщепления и деблокирования комплекса заи и1ценный пептидил-поли- мер производят обработку смесью, содержащей 1,5 мл анизола, 0,5 л метиленсульфида и 15 мл фтрроводоро- да (HF) на 1 г пептид-смолы при (-20) С в течение 0,5 ч и 0°С еще 0,5 ч. После удаления HF под высоким давлением оставшийся на смоле пептид поочередно промывают сухим диэтило- вым эфиром и хлороформом, а затем пептид экстрагируют дегазированным 2 к.водным раствором уксусной кислоты и отделяют от смолы фильтрованием.

Отщепленный и деблокированный пептид (3,1 г) затем растворяют в 0, растворе уксусной кислоты и подвергают очистке, которая может включать гель-фильтрацию на сефадек- се С-50.

Полученный пептид затем дополнительно очищают препаративной и полупрепаративной ВЭЖХ на хроматографе HPLG прел.500 с использованием патрона 15-20f C-18 в ТЕАР-2-25 - системе. . Собственные фракции отстаи- вают и затем чистят на том же самом патроне в ТЕАР-6,5 /СНзСН-системе. .Пригодные фракции отстаивают и чистят от соли на том же патроне в летучей системе 1% TFA/CH CN

Чистота на HPLC - 99,9% для 15 фракций.

Чистота на HPLC 9157 -,99,6% для 16 фракций.

Основную фракцию отб.ирают, лиофи- лизуют, получают целевой продукт с выходо м 0,95 г (22,6%), 54,83° (С 1,1%-ная уксусная кислота) . i

Аминокислотный состав полученного пептида: Asp 4,14 Thr 0,98,- Ser 1,78; Gin 2,00; Ala 4,00,- Val 0 93- 0,78; lie 1,77,- Leu 3,96; Nle 0,96i Tyr 0,96 Phe 0,86; Lys 1,80; Arg 2,96. .

Пример 2. Синтез пептида: Г МеТуг ,Lys 8, Asn «7- hG12F(1-20)NH2 ,формулы:

N MeTyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Tyr- -Lys-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln- -Leu-Se r-Ala-Arg-Ly s-Leu-Leu-Gln-Asp- -Ile-Nle-Asn-ArgNHj.

Указанный пептид синтезируют в условиях примера 1 с использованием тех же защитных групп, растворителей- и активирующих агентов через образования пептидшт-полимера.

598881 6

Пептидил-полимер (4,6 г) обрабатывают с помощью HF в присутствии п-крезола, во время отщепления темпе

ратуру поддерживают при О с в течение 1 ч. Отщепленный пептид подвергают лиофилизации, получают 2,6 г пептида. Полученный продукт чистят на хроматографе HPL С преп. 500, пат- 0 Рон 15-20 /С-18 в системе ТЕАР-2,25 /CHjCN. Фракции, содержащие пептид, собирают на том же патроне в системе TEAP-6,5/CH3CN. Обессоливание проводят на том же патроне в системе ле- 15 тучее 1% TFA/CH CN.

Чистота на HPLC 99,9% для 15фракций.

Чистота на HPLC 99,4% для И6 фракций.

20 Выход 0,86 г пептида (33%) -60,55.

(С 1,1%-ная уксусная кислота). Аминокислотный состав: Asp 3,07; Thr 0,94; Ser 1,80; Glu 2,01; Ala 4,0; 25 Val 0,97, 0,82, He 1,76; Leu 3,93-, Nle 0,97; Tyr 0,93; Phe 0,85; Lys 2,78; Arg 3,15.

Пример 3. Синтез пептида:

,N1 (1-29)NH ,j 30 формулы:

. N MeTyr-Ala-Asp-Alarlle-Phe-Thr- -Asp-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln- ,-Leu-Ser-Ala-Arg-DLys-Leu-Leu-Gln-Asp- .-Ile-Nle-Ser-ArgNHcz.

Указанный пептид синтезируют в условиях примера 1. Образующийся промежуточньй продукт - пептидил-по- лимер (1,5 г). Обрабатывают HF в присутствий п-крезола, во время от40 Щепления температуру поддерживают на О С в течение 1 ч.

Получают пептид в количестве 0,9 г, его чистят на хроматографе HPLC при 500 с использованием набив45 ки 15-20 С-18 Vydac в системе

TEAP/CHjCN. Фракции, содержащие целевой продукт, отстаивают и обессоливают на той же набивке в системе 1% TFA/CH jCN.

50 Чистота на HPLC ,7% для 15 фракций, вькод 0,061 г (6,1%), WUi)- -53,31 (С 1, 1%-ная уксусная-, кислота). .

A fflнoкиcлoтный состав: Asp 2,98; 5 Thr 0,89; Ser 2,84, Gin 2,09-, Gly 1,00,; Ala 2,89; Val 0,88- CH,Tyr 0,98; He 1,76, Leu 4,10; Nle 1,22; Tyr 0,97; Phe 0,85-, Lys 1,91; Arg 3,01.

7

Проведены биологические испытан полученных предлагаемым способом пептидов.

Сравнение проведено с синфети- ческим производным фактора высвобождения инсулина человека pGRF /1-40 в опытах in vitro. При проведении испьп аний использованы культуры, содержащие клетки гипофиза крысы, вьщеленные предварительно за 3-4 ч до проведения испытаний. Такие клеточные культуры являются оптимальными для определения секреции гормона роста и их используют в сравнительном .испытании по общей методике Val

Инкубацию с испытуемым веществом проводят в течение 3-4 ч, после чего аликвотнЬ1е количества культу- ральной среды выделяют и очищают для определения их содержания в им нореактивном гормоне роста (irGH), используя традиционный радиоиммунн анализ.

В таблице приведены полученные данные сопоставительного испытания эквимолярных концентраций.

В дополнение к опытам in vitro, проводимым для определения секреции гормона роста, в экспериментах in vivo указанные синтетические пептиды вводят внутривенно в наркозиро- ванные уретаном мужские особи крыс. Установлено, что они подавляют спон- гтанную секрецию гормона роста, не препятствуя реакции на экзогенный GRF. Пробы крови берут непосредственно перед введением и через 10, 30 и 60 мин после указанных пептидов, и измеряют содержание гормона роста в крови радиоиммуноанали- зом. Полученные данные испытания

to

указанных синтетических пептидов in vivo -показывают, что каждое из них проявляет более высокую биологическую активность по сравнению с синтетическим пептидом pRRF (1-40)-ОН, Предлагаемые аналоги фактора выделения ростового гормона роста (GRF) имеют гораздо большую продолжительность действия, что подтверждается уровнями в крови гипофизарного гормо- на роста при измерении их как через 30, так и 60 мин после IV инъекций. Счи5

0

5

5

мерно 500 нг - 50 мкг указанных пептидов на 1 кг массы тела является эффективной для стимуляции секции гормона роста.

Проведенные испытания показали, что полученные предлагаемым способом пептиды, относясь, как и аналог - hGRF (1-40)ОН, к соединениям малоток- сичнь1м, обладают более высокой (в 1,7-5,5 раз) способностью ускорять высвобождения ростового гормона под действием гипофиза в опытах in vitro. Испытания в условиях in vivo показали, что зти соединения проявляют более высокую биологическую ак- 0 тивность по сравнению с синтетическим пептидом hGRF(1-40)OH. Кроме то го, они имеют большую продолжительность действия и более доступны, так как имеют цепь на 11 аминокислотных остатков короче.

Формула изобретения

Способ получения пептидов общей формулы

N MeTyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr- -R j-Ser-Tjrr-Arg-Lys-Val-Leu-R j-Gln- -Leu-Ser-Ala-Arg-Rj-Leu-Leu-Gln-Asp- -Ile-Nle-R,g-ArgNHj., где Rg - Lys, Asps R,- Gly, Ala

Rj,- Lys, DLys R .- Asn-Ser, отличающийся тем, что- соответствующую С-конечную защищенную аминокислоту Boc-Arg-Tos связывают с полимером-носителем МБГА, аминоза- 0 . щитную группу отщепляют и проводят . постепенное наращивание пептидной це- : пи в соответствии с целевым пептидом до образования пептидил-полимера общей формулы

5 X, - М МеТугСХ)-Ala-Asp(Хз)-

-А1а-11е-РЬе-ТЬг-(Х4)-Я8(Хз т) j-Ser(X4)-Tyr(X2)-Arg(X{)-Lys(X7)-Val- -Leu-R-,j-Gln(Xj)-Leu-Ser(X)-Ala-..

0

5

-Arg (X t).)-Leu-Leu-Gln(X,) -A9p(xp-Ile-Nle-Rj (X, или X,)- -Arg(X:)-X,.

где X - водород или Bocj Xj - водород или DCB; Xg - водород или OBzlj 4 водород или Bzl Xj - водород или Хап Xt - водород или Tos; Х - водород или 2-Cl-Z; - Xj смола-носитель,

1598881

10

с последующим отщеплением защитных групп и пептида от смолы-носителя с помощью трифторуксусной кислоты в дихлорметане и/или путем применения HF поглотителя, предпочтительно анизола, или метилэтилсульфида, или их смеси при 0...(-20)°С, реакционную смесь растворяют в подходящем растворителе, предпочтительно уксусной кислоте, и целевой продукт чис-. тят и выделяют в виде основания.

Изобретение касается пептидов, в частности получения пептидов общей формулы N^{@ CH₃-TYR-ALA-ASP-ALA-ILE-PHE-THR-R₈-SER-TYR-ARG-LYS-VAL-LEU-R₁₅-GLN-LEU-SER-ALA-ARG-R₂₁-LEU-LEU-GLN-ASP-ILE-NLE-R₂₈-ARGNH₂, где R₈ - LYS, ASP}

R₁₅ - GLY, ALA

R₂₁ - LYS, D-LYS

R₂₈ - ASN, SER, способствующих выделению гипофизом гормона роста, что может быть использовано в медицине и ветеринарии. Цель - создание новых более активных и менее токсичных веществ указанного класса. Синтез пептидов ведут связыванием С-конечной защищенной аминокислоты BOC-ARG-TOS с полимером-носителем : МБГА. Затем отщепляют аминозащитную группу и проводят постепенное наращивание пептидной цепи в соответствии с целевым пептидом до образования пептидилполимера формулы X₁-N^{@ -CH₃-TYR(X₂)-ALA-ASP(X₃)-ALA-ILE-PHE-THR(X₄)-R₈(X₃ или X₇)-SER(X₄)-TYR(X₂)-ARG(X₆)-LYS(X₇)-VAL-LEU-R₁₅-GLN(X₅)-LEU-SER(X₄)-ALA-ARG(X₆)-R₂₁(X₇)-LEU-LEU-GLN(X₅)-ASP(X₃)-ILE-NLE-R₂₈(X₄ или X₅)-ARG(X₆)-X₈, где X₁ - H, BOC - трет-бутилоксикарбонил}

X₂ - H, ДСВ - 2,6-дихлорбензил

X₃ - H, OBRL - бензиловый эфир

X₄ - H, BZL - бензил

X₅ - H, XAN - ксантил

X₆ - H, TOS - тозил

X₇ - H, 2-CL-Z - 2-хлорбензилоксикарбонил и X₈ - смола-носитель (МБГА - N-метилбензгидриламиновая смола). Затем отщепляют защитные группы и пептид от смолы-носителя с помощью трифторуксусной кислоты в дихлорметане и/или с помощью HF и поглотителя, предпочтительно анизола или метилэтилсульфида или их смеси, при 0 - (-20)°С и реакционную смесь растворяют в подходящем растворителе, предпочтительно в уксусной кислоте. Целевой продукт чистят и выделяют в виде основания. Испытания показывают более высокую активность новых пептидов, чем синтетического пептида HGRF(1-40)OH, и большее время действия. 1 табл.