СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РАСТЕНИЙ - РЕГЕНЕРАНТОВ МАЛИНЫ IN VITRO Российский патент 1997 года по МПК A01H4/00 

Изобретение относится к биотехнологии в частности к культуре тканей и органов, и может быть использовано в питомниководстве для микроклонального размножения новых перспективных сортов, а также в генной инженерии для генетической трансформации растений малины посредством бактериальных векторов.

В культуре тканей и органов все шире используются в качестве эксплантатов листья полевых, тепличных или культуральных растений. Разработана эффективная методика культивирования кусочков листьев тепличных растений земляники [1] при котором 94% листовых эксплантатов образуют придаточные побеги. Недостатком этого метода является трудоемкость процесса стерилизации листьев. Поэтому более предпочтительным считается использование в качестве эксплантатов листьев пробирочных растений, при котором отпадает необходимость стерилизации исходного эксплантата.

Наиболее близким техническим решением из известных является способ размножения малины методом культивирования изолированных листьев культуральных побегов [2] предлагающий инкубировать кусочки листьев диаметром 6 мм, т.е. листовые диски, на агаризованной питательной среде Мурасиге и Скуга /1962/ при фотопериоде 16/8 ч и постоянном освещении. В среду добавляются регуляторы роста БАП (2,0 мг/л) и ИМК (0,1 мг/л), сахароза (30 г/л). Рекомендуется брать в качестве эксплантатов листья только 4-6 недельных побегов.

Однако этот способ имеет следующие недостатки. Процесс вырезания дисков из листьев пробирочных растений является трудоемкой операцией, занимает много времени и требует большого объема исходного материала, так как листьев, из которых можно вырезать диски необходимого размера, имеется достаточно ограниченное количество. Вместе с тем длительное пребывание листьев в боксе в сильном потоке воздуха вызывает ухудшение качества эксплантов вследствие потери воды тканями листа. Ограничение возраста доноров эксплантов снижает эффективность методики из-за увеличения объемов работ на предыдущем этапе (микроклональное размножение), в то же время у малины возраст культуральных побегов не оказывает влияния на количество регенерирующих побеги изолированных листьев. К тому же наблюдается сложность в использовании листьев и молодых пробирочных растений, так как часто такие листья имеют очень нежные ткани и быстро повреждаются в боксе под током воздуха. Намного удобнее манипулировать более зрелыми листьями, которые хорошо переносят пересадку и вместе с тем обладают высокой регенерационной способностью.

Задачей изобретения является повышение эффективности процесса регенерации побегов из листьев малины путем уменьшения лимитирующих факторов при отборе эксплантов и исключения наиболее трудоемких этапов их подготовки.

Поставленная задача достигается тем, что в известном способе получения растений-регенерантов малины, включающем культивирование листовых эксплантов на искусственной питательной среде, содержащей регуляторы роста, в качестве эксплантов используют листовые пластинки пробирочных растений размеров более 4 мм в возрасте 3-5 мес, на адаксиальной поверхности которых наносят надрезы перед помещением их на питательную среду, после чего осуществляется культивирование при интенсивности света 80-150 люкс в течение 5-8 дн, затем освещенность повышают в 20 раз и продолжают культивирование до получения побегов необходимой для укоренения длины.

Вследствие меньшей чувствительности тканей зрелых листьев к сухости воздуха по сравнению с 4-6 недельными листьями, значительно облегчается проведение срезания листовой пластинки, поранение ее адаксиальной поверхности и высадка готового экспланта на питательную среду. Кроме того, отпадает необходимость в субкультивировании побегов в системах микроразмножения каждые 4-6 нед, что приводит к значительной экономии рабочего времени и ингредиентов культуральных сред. В качестве эксплантов используются целые листовые пластинки размером более 4 мм, вместо дисков диаметром 6 мм. Необходимость в наличии поврежденных тканей компенсируются легкими надрезами пластинки листа скальпелем. Так как место поранения не имеет принципиального значения, процесс подготовки эксплантов занимает меньше времени. Это приводит к уменьшению потери воды листьями и получению эксплантов высокого качества. Кроме того, увеличивается количество листьев на побеге, которые можно использовать в качестве эксплантов, соответственно, уменьшается объем исходного материала и сокращаются затраты на его производство.

Предлагаемое техническое решение отличается от прототипа тем, что в качестве эксплантов используются листовые пластинки пробирочных растений в возрасте 3-5 мес, на адаксиальной поверхности которых перед высадкой на питательную среду наносят надрезы, а процесс культивирования осуществляется в течение первых 5-8 дн. при освещении 80-150 люкс, а затем освещенность увеличивают в 20 раз и продолжают культивирование до получения побегов необходимой для укоренения длины.

Способ осуществляется следующим образом.

Листовые пластинки малины размером более 4 мм 2-4-месячных пробирочных растений срезают с побегов. На адаксиальной поверхности делают несколько надрезов скальпелем. Подготовленные таким образом экспланты высаживают на питательную агаризованную среду. Питательную среду обогащают витаминами B5, сахарозой (30 г/л), регуляторами роста БАП (2,0 мл/г), и ИМК (2,0 мг/л), агаром (8 г/л), мионозитом (100 мг/л). рН среды перед автоклавированием доводят до 5,8-5,9.

В течение первой недели экспланты инкубируют в условиях пониженного освещения (80-150 люкс), для чего свет пропускают через картон. Уменьшение интенсивности света увеличивает существенно частоту регенерации. Через неделю картон снимают и интенсивность света повышают в 20 раз. Хорошее освещение в дальнейшем способствует быстрому росту регенератов. Инкубирование осуществляют до получения побегов необходимой для укоренения длины.

Использование предлагаемого способа регенерации побегов на листовых эксплантах малины обеспечивает по сравнению с существующими методами следующие преимущества:
повышается до 100% количество листовых эксплантов, регенерирующих побеги;
упрощается процесс подготовки эксплантов;
уменьшается объем работ в системах микроклонального размножения малины для получения необходимого количества доноров эксплантов;
достигается экономия питательных сред и физиологически активных веществ.

Использование: сельское хозяйство и биотехнология. Сущность изобретения: получение растений-регенерантов малины in vitro осуществляют путем культивирования листовых эксплантов на питательной среде, причем в качестве эксплантов используют листовые пластинки пробирочных растений размером более 4 мм в возрасте 3-5 мес, на адаксиальной поверхности которых наносят надрезы перед помещением их на питательную среду, после чего осуществляют культивирование при интенсивности света 80-150 лк в течение 5-8 дн, затем освещенность повышают в 20 раз и культивируют до получения побегов необходимой для укоренения длины. 4 табл.

Способ получения растений-регенерантов малины in vitro, включающий культивирование листовых эксплантов на искусственной питательной среде, содержащей регуляторы роста, отличающийся тем, что в качестве эксплантов используют листовые пластинки пробирочных растений размером более 4 мм в возрасте 3 5 месяцев, на адаксиальной поверхности которых наносят надрезы перед помещением их на питательную среду, после чего осуществляют культивирование при интенсивности света 80 150 лк в течение 5 8 дней, затем культивирование ведут при освещенности, в 20 раз большей первоначальной, до получения побегов необходимой для укоренения длины.