СПОСОБ ОЧИСТКИ ВОДЫ И ПОЧВЫ ОТ НЕФТЯНЫХ ЗАГРЯЗНЕНИЙ Российский патент 1995 года по МПК C02F3/34 C12N1/20 C12R1/00 C12N1/20 

Изобретение относится к способам очистки воды и почвы от нефтяных загрязнений с использованием нефтеокисляющих микроорганизмов.

Известен способ очистки воды и почвы от нефтяных загрязнений, основанный на внесении на загрязненные участки различных штаммов и микроорганизмов [1]
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к заявляемому изобретению является способ очистки воды и почвы от нефтяных загрязнений, включающий внесение на загрязненные участки биомассы нефтеокисляющих бактерий и удобрений источников азота и фосфора [2]
Общим недостатком известных способов очистки является то, что используемые нефтеокисляющие микроорганизмы не способны эффективно разрушать нефть и нефтепродукты при пониженных температурах (5-18^оС) в северных регионах страны.

Цель изобретения повышение эффективности очистки воды и почвы от нефтяных загрязнений при низких температурах.

Поставленная цель достигается тем, что в способе очистки воды и почвы от нефтяных загрязнений, включающем внесение на загрязненные участки биомассы нефтеокисляющих бактерий и удобрений, в качестве нефтеокисляющих бактерий используют штамм Rhodococcus sp.НХ7 в количестве 1 г по сухой массе на 1 м² обрабатываемой поверхности.

Анализ заявляемого и известных технических решений показывает, что не имеется сведений об использовании штамма Rhodococcus sp.НХ7 в качестве нефтеокисляющих бактерий в количестве 1 г по сухой массе на 1 м² обрабатываемой поверхности. Следовательно, заявляемое изобретение соответствует условию патентоспособности "новизна".

В литературе и практике отсутствуют сведения о способе очистки воды и почвы от нефтяных загрязнений, идентичных заявляемому, и они не следуют явным образом из уровня техники. Это позволяет сделать вывод о том, что заявляемое изобретение соответствует условию патентоспособности "изобретательский уровень".

Изобретение обеспечивает достижение технического результата, может быть реализовано в промышленности, а также обеспечивает возможность его многократного воспроизведения, что позволяет сделать вывод об удовлетворении заявляемого изобретения условию патентоспособности "промышленная применимость".

Штамм Rhodococcus sp.НХ7, используемый в данном процессе, изолирован из образцов почвы, отобранных в тундре на севере Архангельской области вблизи нефтяных скважин, и депонирован под номером ВКПМ S-1267 в Российской коллекции промышленных микроорганизмов.

Для очистки почвы или воды, в загрязненные участки вносят штамм НХ7 в виде водной суспензии, содержащей 10⁷-10⁸ жизнеспособных клеток в 1 мл, в количестве 1 л суспензии на 1 м² загрязненной площади.

Для создания оптимальных условий размножения и роста клеток НХ7 в загрязненные участки вносятся минеральные удобрения источники азота и фосфора, такие как: калиевая или натриевая селитра, нитроаммофоска, аммиачная вода, суперфосфат в количествах, зависящих от уровня загрязненности, но с таким расчетом, чтобы начальное соотношение между элементами углерод:азот:фосфор поддерживалось на уровне 100:10:1, что является оптимальным для роста бактериальных клеток.

Содержание нефти в воде и почве определяли весовым методом, используя хлороформ для экстракции.

В результате внесения в загрязненные участки биомассы штамма НХ7 и комплекса удобрений источников азота и фосфора, происходит снижение содержания нефти в 10 раз через 1,5 мес.

Биомассу клеток штамма НХ7 выращивают в жидких питательных средах следующего состава:
Среда А, г/л: Калий азотнокислый 1
Калий фосфорно-
кислый однозаме- щенный 0,6
Натрий фосфорнокис- лый двузамещенный 1,4 Магний сернокислый 0,3
Водопроводная
вода до 1 л, рН 7,0-7,2
Культивирование проводят при 30^оС в течение 48 ч при активной аэрации. Биомассу отделяют от культуральной жидкости любым подходящим способом сепарацией или центрифугированием.

Для получения биомассы в сухом виде, клетки высушивают с помощью лиофилизации. Получаемая биомасса содержит 10¹¹ жизнеспособных клеток в 1 г сухих клеток.

Штамм Phodococcus sp.НХ7 обладает следующими характеристиками. Морфологические и культуральные свойства. Клетки штамма НХ7 неподвижные, граммположительные, некислотоустойчивые, спор не образуют. При росте бактерии имеют выраженный цикл развития (палочки кокки). Деление осуществляется в основном по раскалывающемуся типу, в растущих культурах доминируют V-формы.

При росте на среде МПА, сусло-агаре образуют кремовые или телесные с розовым оттенком колонии, на среде Гаузе II розовые колонии.

Физиологические свойства: аэроб, растет при 3-30^оС и рН 4,5-11. Штамм катализа положительный и оксидаза отрицательный. Желатин не разжижает, молоко не пентонизирует.

В качестве источников азота используют соединения аммония и нитраты. Образует кислоту из следующих углеводов: глюкозы, арабинозы, салицина, лактозы, галактозы. В качестве единственного источника углерода используют глюкозу, сахарозу. Штамм способен использовать для роста сырую нефть и различные фракции нефти: н-алканов, ароматических углеводородов, а также различные продукты переработки нефти дизельное, реактивное моторные топлива, мазуты. Штамм НХ7 способен расти в средах, содержащих до 90% нефти.

Химический состав клеточной стенки: в клеточной стенке содержится мезо-диаминопимелиновая кислота, арабиноза и галактоза (IV тип клеточной стенки).

На основании культурально-морфологических, физиологических и биохимических свойств, а также их сравнения с коллекционными культурами штамм НХ7 классифицирован как Phodococcus sp.

Заявляемый штамм не относится к патогенным микроорганизмам. Штамм не обладает вирулентными и токсигенными свойствами, не дессеминирует во внутренних органах лабораторных животных, не обладает иммуногенным и аллергенным действием.

Клетки штамма НХ7 хорошо сохраняют жизнеспособность и нефтеокисляющую активность при -20^оС в 30%-ном растворе глицерина в течение года. Клетки также хорошо сохраняются в лиофилизованном состоянии в течение 3 лет.

П р и м е р 1. В колбы Эрленмейера (объемом 750 мл), содержащие 100 мл питательной среды А с 0,5% нефти, вносят 1 мл культуры штамма НХ7, предварительно выращенной на среде того же состава в течение 2 сут при 30^оС. Колбы инкубируют на качалке (100 об/мин) при 5^оС, 18 и 30^оС в течение 4 сут. В другую серию колб вносится штамм P.putida 36 и инкубируют при тех же условиях,
Через каждые сутки в колбах определяют титр клеток и содержание нефти. Оказалось, что штамм НХ7 способен расти на нефти при всех температурах культивирования (титр клеток возрастает в 50-100 раз). При всех температурах убыль нефти составляет не менее 98% В то же время штамм 36 (прототип) в этих условиях способен активно расти на нефти только при 30^оС (убыль нефти не менее 98% ). При 18^оС наблюдался незначительный рост клеток (убыль нефти не превышала 20%). При 5^оС рост штамма 36 плотностью отсутствовал, изменений в нефтяной пленке не наблюдали. Таким образом, в отличие от прототипа, штамм НХ7 способен расти и утилизировать нефть в широком интервале температур. Результаты представлены в табл. 1.

П р и м е р 2. В 10 колб Эрленмейера вносят по 100 мл питательной среды А с начальным значением рН 4-12. В каждую колбу добавляют 3% нефти и вносят по 1 мл культуры штамма НХ7, предварительно выращенной на среде того же состава (рН 7,0) в течение 2 сут при 30^оС. Колбы инкубируют на качалке (120 об/мин) при 18-20^оС. Через 4 сут в каждой колбе определяют содержание нефти. Результаты представлены в табл. 2.

Как видно из табл. 2, штамм НХ7 способен утилизировать нефть в широком интервале значений рН, что позволяет использовать данный штамм для очистки почв и воды различной кислотности без их предварительной нейтрализации.

П р и м е р 3. Участок тундровой почвы загрязнен сырой нефтью с начальным содержанием нефти 60 г на 1 кг почвы. Для очистки почвы на 1 м² обрабатываемой площади вносится 1 л озерной воды, содержащей 1 г лиофилизированных клеток и 6 г нитроаммофоски. Средняя температура в период обработки составляла 13^оС. Через 1,5 мес содержание нефти в почве составляло 5,8-6 г на 1 кг почвы, т.е. около 90% нефти было разрушено.

П р и м е р 4. Амбар отстойника на нефтяной скважине объем 100 т, площадь 100 м² (Север России, тундра). Исходное содержание нефти в воде амбара составляло 14,5 мг/л. Над поверхностью амбара разбрызгивали клеточную суспензию (1 г/л), содержащую нитроаммофоску в концентрации 1,4 г/л с таким расчетом, чтобы на 1 м² обрабатываемой поверхности расходовалось 1 л суспензии. Через 20 дней после однократной обработки содержание нефтепродуктов в воде снизилось до 0,07 мг/л.

Таким образом, использование штамма Phodococcus sp. НХ7 в качестве нефтеокисляющих бактерий позволяет эффективно очищать воду и почву от нефти и нефтепродуктов при пониженных температурах в северных регионах страны.

Использование: для очистки воды и почвы от нефтяных загрязнений с использованием нефтеокисляющих микроорганизмов. Сущность изобретения: способ включает внесение на загрязненные участки биомассы нефтеокисляющих бактерий и удобрений - источников азота и фосфора. В качестве нефтеокисляющих бактерий используют штамм Rhodococcus sp ВКПМ S-1267 в количестве 1 г по сухой массе на 1 м² обрабатываемой поверхности. 2 табл.

СПОСОБ ОЧИСТКИ ВОДЫ И ПОЧВЫ ОТ НЕФТЯНЫХ ЗАГРЯЗНЕНИЙ, включающий внесение на загрязненные участки биомассы нефтеокисляющих бактерий и удобрений, отличающийся тем, что в качестве нефтеокисляющих бактерий используют штамм Phodococcuc sp. ВКПМ S-1267 в количестве 1 г по сухой массе на 1 м² обрабатываемой поверхности.