СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-СЕРИНА Российский патент 1994 года по МПК C12P13/06 C12P13/06 C12R1/13 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается способа получения l-серина с помощью штаммов-продуцентов.

L-серин используется в медицине для приготовления аминокислотных смесей, а также в химической и косметической промышленности.

Известны способы получения L-серина с использованием штаммов, способных к конверсии глицина в серин, лучший из которых продуцирует 14 г/л на среде с 30 г/л глицина (конверсия 46% ).

Среди штаммов, способных к прямому синтезу серина и не требующих добавления в среду его предшественника, лучшими являются штаммы Brevibacterium flabum ВКПМ В-3559 и его стрептомицин, устойчивый мутант ВКПМ В-4405. Последний продуцирует в лабораторных условиях на средах с сахаром, гидролизатом БВК с трептомицином 18-20 г/л серина.

Наиболее близким техническим решением (прототипом) к изобретению является способ с использованием штамма Brevi- bacterium flavum ВКПМ В-4405.

Недостатком этого штамма является низкий уровень накопления l-серина, а также присутствие в составе ферментационной среды гидролизата белково-витаминного концентрата (ВВК) и антибиотика стрептомицина, что увеличивает стоимость конечного продукта и повышает экологическую опасность технологии получения серина.

Целью изобретения является повышение уровня образования серина и применение простой и дешевой среды культиви- рования.

Это достигается использованием в качестве продуцентов l-серина штаммов Brevibacterium flavun ВНИИгенетика-276 и Brevibacterium flavum ВНИИгенетика-W17, синтезирующих 22,8-25 г/л серина и способных расти на средах, не содержащих дорогих и экологически вредных компонентов БВК и стрептомицина.

Новые штаммы-продуценты l-серина Brevibacterium flavum ВНИИгенетика-276 и ВНИИгенетика-W17 получены как гибриды следующих известных штаммов:
B. flavum ВКПМ В-2403 (ауксотрофный по треонину и изолейцину, устойчивый к этионину продуцент гомосерина;
B. flavum ВКПМ В-3559 (продуцент серина, устойчивый к аналогам серина и к антибиотику рифампицину;
B. flavum АТСС 14067 (дикий тип).

Указанные штаммы скрещивались путем слияния протопластов по схеме, приведенной на чертеже. В скрещиваниях использовали маркированные аналогорезистентностью и антибиотикорезистентностью штаммы. В результате слияния протопластов отбирали гибридные штаммы, унаследовавшие маркеры обоих родительских штаммов, и среди таких гибридов отбирали штаммы с повышенным по сравнению с родительским уровнем продукции l-серина и сниженным образованием побочных аминокислот. Гибридизация-продуцентов серина с маркированным антибиотикорезистентностью штаммом дикого типа АТСС 14067 проводилась с целью отбора более жизнеспособных продуцентов серина.

В результате нескольких скрещиваний (чертеж) отобраны два наиболее активных продуцента серина - Brevibacterium flavum ВНИИгенетика-276 и ВНИИгенетика-W17.

Штаммы хранятся в столбиках полужидкого (0,7% ) агара под слоем вазелинового масла при температуре 2-4^оС или в лиофильно-высушенном состоянии в запаянных ампулах при комнатной температуре.

Штаммы B. flavum ВНИИгенетика-276 и ВНИИгенетика-W17 депонированы во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов под номерами ВКПМ В-5506 и ВКПМ В-5702 соответственно.

Новые штаммы Brevibacterium flavum имеют следующие культурально-морфологические и биохимические признаки.

Культурально-морфологические признаки. Клетки овальные, размеры 1,0-1,5 х 0,6-0,8 мкм, неподвижные, грамположительные, спор не образуют.

Через 3-5 сут роста при 30^оС на МПА и на агаре Хоттингера образуются колонии диаметром 2-4 мм, желтовато-кремовые, поверхность гладкая, форма выпуклая, край ровный, структура однородная тестообразная. При посеве штрихом через 2 сут рост умеренный, край гладкий, поверхность матовая. При посеве уколом рост в глубине агара слабый, на поверхности умеренный.

Через 3-5 сут роста при 30^оС на глюкозоминеральной среде Гловера, содержащей лейцин, блотин и тиамин, колонии 1-2 мм, край ровный, структура однородная, консистенция тестообразная, поверхность гладкая, цвет колоний светло-кремовый. Рост штриха на этой среде через 2 сут. умеренный.

Физиолого-биохимические признаки.

Аэробы. Желатину не разжижают.

Хорошо растут на глюкозе, сахарозе, мальтозе, фруктозе, маннозе, этаноле, уксусной кислоте. Не растут на ксилозе, арабинозе, лактозе, рафинозе.

Усваивают азот в форме солей аммония и мочевины. Не усваивают нитратный азот.

Растут при температуре 24-42^оС. Оптимальная температура 32^оС.

Растут на средах с рН от 6 до 8,5. Оптимальное значение рН 6,8-7,2.

Для роста в минимальной среде нуждаются в биотине и тиамине.

Штамм ВНИИгенетика-276 устойчив к рифампицину, стрептомицину, азааденину, О-метилсерину, альфа-метилсерину, этионину, канамицину.

Штамм ВНИИгенетика-W17 устойчив к рифампицину, стрептомицину, азааденину, альфа-метилсерину, О-метилсерину, этионину, а также в отличие от штамма ВНИИгенетика-276 устойчив к сульфагуанидину.

Способ получения 1-серина с использованием новых штаммов осуществляется следующим образом. Культуру штаммов B. fkabum ВНИИгенетика-276 или W17 выращивают в течение 1 сут. при 28-30^оС на агаре Хоттингера, затем высевают в предварительно простерилизованные вместе с посевной средой колбы для выращивания посевного материала. Колбы устанавливают на круговую качалку и культивируют при 220-250 об/мин при 28-30^оС в течение 1 сут.

Выращенный таким образом посевной материал вносят в предварительно простериализованные колбы с ферментационной средой, содержащей источники углерода (сахарозу), азота, ростовые факторы, минеральные соли и витамины (биотин или дестиобитин, тиамин). Все компоненты среды стерилизуют под давлением, рН среды доводят до 6,8-7,2.

Ферментацию проводят на круговой качалке (220-240 об/мин) при 28-32^оС.

Содержание l-серина в культуральной жидкости определяют методом тонкослойной хроматографии на пластинках в системе растворителей ацетон-изопропанол-25% -ный аммиак-вода (5: 5: 1, 2: 0,8) или методом бумажной хроматографии в системе бутанол-уксусная кислота-вода (4: 1: 1).

Выделение l-серина из ферментационной жидкости проводят после отделения биомассы известным способом с помощью ионно-обменных смол с последующей перекристаллизацией.

На чертеже приведена схема селекции продуцентов серина.

Х-скрещивание путем слияния протопластов: rif^r, str^r, ad^r, ms^r, Oms^r, et^r, km^r, sg^r - устойчивость клеток штаммов к ингибированию соответственно рифампицином, стрептомицином, 8-азааденином, альфа-метил- серином, О-метилсерином, этионином, канамицином, сульфагуанидином.

П р и м е р 1. Культуру штамма B. flavum ВНИИгенетика-276 выращивают 1 сут. на агаризованной среде Хоттингера, затем петлей высевают в колбы емкостью 250 мл, з содержащие 15-20 мл посевной среды следующего состава, г/л: Сахароза 30,0 (NH₄)₂SO 7,0 MgSO₄˙7H₂O 0,3 KH₂PO₄ 0,3 Кукурузный экстракт 20,0 Тиамин, мкг/л 50,0 Биотин, мкг/л 50,0 Мел 5,0 Водопроводная вода, л До 1 рН среды 7,0-7,2
Все компоненты среды стерилизуют совместно в автоклаве при избыточном давлении 0,5 ат в течение 30 мин.

После засева культуры колбы устанавливают на круговую качалку (220-240 об/мин) и выращивают посевной материал в течение 1 сут при 28-30^оС. Выращенный посевной материал в количестве 0,5 мл вносят в колбы на 250 мл, содержащие 15 мл ферментационной среды следующего состава, г/л: Сахароза 180,0 NaH₂PO₄ 0,6 (NH₄)₂SO₄ 30,0 MgSO₄˙7H₂O 1,0 KCL 0,2 Кукурузный экстракт 5,0 Дестиобиотин, мкг/л 200,0 Тиамин, мкг/мл 300,0 Мел 45,0 Водопроводная вода, л До 1 рН среды 7,0-7,2.

Все компоненты среды (кроме мела) стерилизуют совместно при избыточном давлении 0,5 ат. Мел стерилизуют отдельно в таких же условиях. Ферментацию проводят на указанной выше качалке при 28-30^оС. После 96 ч культивирования в культуральной жидкости накапливается l-серин в концентрации 25,0 г/л.

П р и м е р 2. Процесс проводят по примеру 1, но используют штамм B. flavum ВНИИгенетика-W17. Концентрация l-серина в культуральной жидкости 22,8 г/л.

Таким образом, штаммы B. flavum ВНИИгенетика-276 и ВНИИгенетика-W17 по сравнению с известными штаммами обладают большей серинсинтезирующей активностью. Преимуществом штаммов является также то, что в составе посевной и ферментационной сред не содержится дорогостоящего и экологически вредного компонента гидролизата БВК, а также антибиотика - стрептомицина. (56) 1. Kubota K. Agr. Biol. xhtm 49,7-12, 1985.

2. Авторское свидетельство СССР N 1412288, кл. C 12 P 13/06, 1986.

3. Буриков Э. А. , Ивановская Л. В. , Жданова Н. И. Биологические науки. 1984, с. 82-88.

4. Штанников А. В. , Лившиц В. А. , Жданова Н. И. Генетика, ХУП, 1981, с. 1419-1428.

Область использования: биотехнология, получение аминокислот. Сущность изобретения: получение L-серина с использованием двух новых гибридных штаммов Brevibacterium flavum. Штаммы получены методом слияния протопластов из известных штаммов Brevibacterium flavum ВКПМ В2403, В3559 и АТСС 14067 с дальнейшей селекцией на способность к сверхсинтезу L-серина. Штамм Brevibacterium flavum ВКПМ В5506 устойчив к рифампицину, стрептомицину, азааденину, О-метилсерину, альфа-метилсерину, этионину. Штамм Brevibacterium flavum ВКПМ В5702 устойчив к рифампицину, стрептомицину, азааденину, альфа-метилсерину, о-метилсерину, этионину, канамицину, а также к сульфагуанидину. Способ позволяет получать 22,8 - 25 г/л L-серина на простых и дешевых средах. 1 ил.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-СЕРИНА путем культивирования штамма бактерий Brevibacterium flavum на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, при аэрации с последующим выделением целевого продукта в кристаллическом виде, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, из штаммов Brevibacterium flavum используют Brevibacterium flavum ВКПМ В-5506 или Brevibacterium flavum ВКПМ В-5706.