ШТАММ БАКТЕРИЙ RHODOCOCCUS RHODOCHROUS - ПРОДУЦЕНТ НИТРИЛГИДРАТАЗЫ Российский патент 1996 года по МПК C12N9/78 C12P13/02 

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения нового штамма бактерий с высокой нитрилгидратазной активностью, используемого в процессах получения амидов из нитрилов.

Фермент нитрилгидратаза, катализирующий превращение нитрилов в амиды, обнаружен у многих видов бактерий. Для образования нитрилгидратазы при выращивании бактерий необходимо добавлять в питательную среду индуктор, в качестве которого могут использоваться нитрилы и амиды органических кислот [1-3] мочевина или ее производные [7] Известны штаммы Corynebacteriuv N 774 [4] и Rhodococcus sp. S-6 [5] для которых не требуется индуктор. Недостатками штамма N 774 являются низкая нитрилгидратационная активность (50-60 ед/мг), узкий круг трансформируемых нитрилов (только алифатические нитрилы), низкая термостабильность ферментов (температурный оптиум действия для N 774-35 С). Недостатком штамма S-6 является способность гидратировать образующиеся амиды до кислот, что приводит к резкому снижению качества амидов. Кроме того, штамм S-6 обладает низкой термостабильностью нитрилгидратазы (не выше 30^оС) и низкой продуктивностью (способен накапливать не более 20% акриламида в растворе). Для выращивания обоих штаммов N774 и S-6 используются дорогие компоненты питательных сред (пептон, дрожжевой экстракт, мясной экстракт).

Наиболее близким по технической сущности и достигнутому результату к заявляемому изобретению является штамм Rhodococcus rhodochrous J1 [7] обладающий нитрилгидратазной активностью в отношении алифатических и ароматических нитрилов. Недостатком этого штамма является необходимость использования для выращивания штамма питательной среды с витаминами, дрожжевым экстрактом и пептоном. Недостатком также является то, что для образования нитрилгидратазы штамму J1 требуется индуктор-мочевина в высоких концентрациях (7,5-12 г/л). Так, удельная активность нитрилгидратазы при выращивании штамма на среде без мочевины достигает только 3,5 ед/мг (общая активность 17,7 ед.мл). В тоже время при 7,5 г/л мочевины в среде удельная активность достигает 497 ед/мл, а общая активность 2480 ед/мл. Следует отметить, что мочевина выполняет двоякую роль, она используется как источник азота и как индуктор нитрилгидратазы. Для роста штамма достаточно не более 2 г/л мочевины (при этом удельная нитрилгидратазная активность штамма J1 достигает 36,5 ед/мг, общая активность 189 ед/мл), высокие концентрации мочевины необходимы только для индукции. Поэтому значительные количества мочевины остаются в среде после культивирования штамма J1.

Задачей настоящего изобретения является получение штамма, обладающего высокой нитрилгидратазной активностью при росте на простых синтетических средах, не содержащих витаминов, аминокислот, а также соединений, служащих индуктором синтеза нитрилгидратазы (нитрилы, амиды или мочевина).

Поставленная задача достигается созданием штамма Rhodococcus rhodochrous М33, способного в отсутствии индукторов конструктивно образовывать нитрилгидратазу, катализирующую гидролиз алифатических нитрилов, например, акрилонитрила, и ароматических нитрилов, например 3-цианопиридина, в соответствующие амиды, например в акриламид и никотинамид. Предлагаемый штамм продуцирует в отсутствии мочевины нитрилнидратазу с удельной активностью 200 ед/мг и общей активностью 360 ед/мл, а в присутствии в среде 2 г/л мочевины соответственно 180 и 1368 ед/мл.

Новый штамм растет на простых синтетических средах, содержащих источник углерода в виде пирувата, ацетата или глюкозы в концентрациях 0,1-4% и источник азота в виде аммонийных, нитратных солей или мочевины в концентрациях 0,4-2% Причем для роста штамма М33 не требуются витамины, аминокислоты, дрожжевой экстракт.

Штамм Rhodococcus rhodochrous М33 получен из штамма Rhodococcus rhodochrous М8 [6] путем направленной селекции в два этапа с использованием селективных сред, содержащих на первом этапе хлорацетамид, а на втором этапе ацетонитрил.

Предлагаемый новый штамм способен образовывать нитрилгидратазу конструктивно в отсутствии в среде индукторов, таких как нитрилы, амиды или мочевина (табл. 1).

Как видно из табл. 1, удельная активность нитрилгидратазы достигает 457 ед. при росте штамма М33 на питательной среде в отсутствии мочевины. В этих условиях нитрилгидратазная активность исходного штамма М8 составляет 8 ед. Известно, что удельная активность нитрилгидратазы штамма J1 при выращивании на средах, не содержащих мочевины, достигает 3,4 ед. [7] Еще одной отличительной особенностью штамма М33 является практически полное отсутствие амидазной активности. Амидаза представляет собой фермент, катализирующий гидролиз образующихся амидов в соответствующие кислоты, например акриламида в акриловую кислоту, что приводит к резкому ухудшению качества образующихся амидов. Таким образом, штамм М33 в отличие от исходного штамма М8 и штамма J1 способен конструктивно образовывать нитрилгидратазу даже в отсутствии в среде индуктора и обладает в 20 раз меньшей активностью амидазы.

Штамм М33 депонирован под номером ВКМ Ас-1515Д во Всероссийской коллекции микроорганизмов и характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими характеристиками.

Морфологические свойства. Клетки штамма М33 неподвижны и окрашиваются по Граму. Спор не образуют, некислотоустойчивы. В возрасте 18-20 ч клетки образуют длинные (до 20 мкм) слабо ветвящиеся нити, которые через 48-72 ч распадаются на палочковидные и кокковидные элементы. В старых культурах наблюдаются плеоморфные клетки в виде колб, груш, булав. Деление клеток происходит по раскалывающемуся и cгибающему типам.

Культуральные свойства. На плотных питательных средах (МПА, Хоттингер,) через 48 ч роста штамм М33 образует круглые гладкие колонии диаметром 1 мм, окрашенные от палево-розового до розово-оранжевого цвета. При росте на мясо-пептонном бульоне образуются пленка и осадок. Лакмусовое молоко не изменяется.

Физиологические свойства. Облигатный аэроб. Редуцирует нитраты. Тест с метиловым красным, реакция Фогес-Проскауэра отрицательные. Образует сероводород. Штамм оксидазоотрицательный, каталазои фосфатазаположительный. Крахмал и целлюлозу не гидролизует, трин 60 и 80 гидролизует. Аденин не утилизирует. Клетки не выдерживают нагревания в снятом молоке при 72^оС в течение 15 мин. Штамм растет при pH 6-9, температуре 5-45^оС. Кислоту образует из следующих сахаров и спиртов: глюкозы, фруктозы, мальтозы, сахарозы, сорбита, манита и глицерина. Газообразования ни на одном сахаре не обнаружено. В качестве единственного источника азота используют соединения аммония, нитраты и мочевину. В качестве единственного источника углерода использует мальтозу, манит, сорбит, глюкозу, глицерин, лактат, пируват, бензоат, n- и m-гидроксибензоат, тирозин; не использует рамнозу, галактозу, инозит, а-кетоглутарат.

Биохимический анализ показал, что в клеточной стенке штамма М33 содержатся мезо-диаминопимелиновая кислота, арабиноза и галактоза, что характерно для коринеподобных бактерий с IV типом клеточной стенки. Клетки также содержат липид A(LCN), характерный для родококков.

Таким образом, штамм М33 обладает характеристиками, типичными для коринеподобных бактерий. На основании перечисленных выше свойств в соответствии с руководствами Берджи и Нестеренко штамм М33 был отнесен к роду Rhodococcus и виду rhodochrous.

Для получения клеток М33 с высокой активностью нитрилгидратазы, культур М33 вносят в питательные среды и инкубируют при 25-30^оС в течение 24-72 ч.

Для трансформации нитрилов в амиды используются клеточные суспензии, полученные с помощью центрифугирования культур и последующего ресуспендирования клеток в 10 мМ фосфатном буфере.

Полученные таким образом клетки обладают высокой активностью нитрилгидратазы и способны катализировать гидролиз алифатических и ароматических нитрилов в соответствующие амиды в широком интервале температур 4-50^оС и значениях pH 3-10.

Стандартный тест для измерения активности нитрилгидратазы проводят следующим образом. 1 мл 2%-ного раствора нитрила в 10 мМ фосфатном буфере pH 7,6 смешивают с 1 мл клеточной суспензии, содержащей 0,04 мг клеток по сухой массе. Реакцию проводят при 20^оС в течение 5 мин, затем реакцию останавливают добавлением 20 мкл концентрированной HCl. Концентрацию образующихся амидов определяют с помощью газовой хроматографии.

Активность нитрилгидратазы выражают в следующих единицах:
Удельную активность в мкМ амида/мин/мг клеток по сухой массе.

Общую активность в мкМ амида/мин/мл культуры.

П р и м е р 1.

Клетки штамма М33 выращивают в отсутствии мочевины на питательной среде, содержащей в качестве источника азота нитрат натрия. В колбу Эрленмейера (объемом 750 мл), содержащую 150 мл питательной среды следующего состава, г/л: K₂HPO₄ 0,5; KH₂HPO₄ 0,6; MgSO₄ 0,5; FeSO₄0,005; CoCl₂ 0,01; глюкоза 5; NaNHO₃ 1, вносят 5 мл культуры штамма М33, предварительно выращенной на среде того же состава в течение 2 сут, при этом 30^оС. Колбы инкубируют на качалке при 30^оС в течение 48 ч. Используя акрилонитрил в качестве субстрата, определяют нитрилгидратазную активность клеток. Удельная активность нитрилгидратазы в штамме М33 достигает 200 кд/мг, общая активность 360 ед/мл.

Таким образом, удельная активность штамма М33, выращенного в среде, не содержащей мочевины, более чем в 60 раз выше активности штамма J1. При этом для выращивания штамма М33 используются коммерческие доступные компоненты среды глюкоза и нитрат натрия.

П р и м е р 2. В колбу Эрленмейера (объемом 750 мл), содержащую 150 мл питательной среды как в примере 1, за исключением того, что глюкозу вносят в количестве 20 г/л, а вместо нитрата натрия-мочевину в количестве 2 г/л. В колбу добавляют 5 мл культуры штамма М33, предварительно выращенной на среде того же состава в течение 2 сут. при 30^оС. Колбу инкубируют на качалке при 30^оС в течение 48 ч. Определяют урожай клеток и нитрилгидратазную активность с использованием акрилонитрила в качестве субстрата. Результаты представлены в табл. 2.

П р и м е р 3. Штамм М33 выращивают так, как это описано в примере 1. Клетки отделяют с помощью центрифугирования, промывают 10 мМ фосфатным буфером и ресуспендируют в 10 мМ фосфатном буфере. Используя различные нитрилы в качестве субстратов, проводят реакцию в стандартных условиях. Результаты представлены в табл. 3.

Реакцию останавливают добавлением концентрированной HCl, концентрацию образующихся амидов определяют с помощью газовой хроматографии.

Как следует из табл. 3, штамм М33 способен катализировать гидролиз как алифатических так и ароматических нитрилов.

П р и м е р 4. Штамм М33 выращивают как в примере 1. В колбу, объемом 100 мл, содержащую 40 мл дистиллированной воды (pH 7,6), вносят биомассу клеток М33 до концентрации 0,5 мг/мл и 3-цианопиридин до концентрации 8% Колбу инкубируют при 30^оС с перемешиванием. Через 60 мин по- лучают 10%-ный раствор никотинамида. 3-Цианопиридин и никотиновая кислота в реакционной смеси отсутствуют.

П р и м е р 6. В стальной реактор объемом 1,5 л, снабженный механической мешалкой, термостатируемый в интервале температур 12-20^оС, вносят 627 мл дистиллированной воды (pH 7,6) и ресуспендируют в ней 426 мг биомассы (по сухой массе) штамма P. rhodochrous М33, выращенной как описано в примере 1. Затем в реакционную смесь добавляют 12 г чистого акрилонитрила. Качественный и количественный состав раствора определяют по данным газо-жидкостной хроматографии. По мере трансформации акрилонитрил добавляют так, чтобы его концентрация в растворе не превышала 2% Всего вносят в реактор 282 г акрилонитрила. За 8 ч получают 42%-ный раствор акриламида. Выход акриламида близок к 99% Акрилонитрил и акриловая кислота в качестве побочных продуктов не обнаружены.

Таким образом, заявляемый штамм М33 обладает высокой нитрилгидратазной активностью и способен гидратировать как алифатические так и ароматические нитрилы в соответствующие амиды. В отличие от известных аналогов, мутантный штамм М33 способен конструктивно образовывать нитрилгидратазу при культивировании в средах, не содержащих индукторов синтеза нитрилгидратазы. Это позволяет использовать для выращивания клеток среды, не содержащие специальных соединений индукторов нитрилгидратазы (амидов, нитрилов или мочевины в высоких концентрациях), в том числе синтетические среды без витаминов с глюкозой в качестве источника углерода и нитратом натрия (или калия) в качестве источника азота. Еще одним достоинством штамма М33 является практически полное отсутствие амидазной активности, что блокирует образование кислот из амидов в ходе каталитического превращения нитрилов.

Штамм Rhodоcоccus rhodochrous М33 может быть рекомендован как продуцент фермента нитрилгидратазы и использован в процессах получения алифатических и ароматических амидов из нитрилов.

Путем направленной селекции с использованием селективных сред, содержащих хлорацетамид и ацетонитрил, создан новый продуцент нитрилгидратазы, способный гидратировать как алифатические, так и ароматические нитрилы в соответствующие амиды, например: акрилонитрил в акриламид (до 42% в растворе) и 3-цианопиридин в никотинамид (10-40%-ные растворы). Новый штамм Rhodococcus rhodochrous МЗЗ в отсутствии индукторов на простых синтетических средах, содержащих в виде источника углерода глюкозу или ацетат, а в виде источника азота аммонийные, нитратные соли или мочевину продуцирует нитрилгидратазу с удельной активностью 200 ед/мг клеток и общей активностью 360 - 1368 ед/мл культуры. Описание изобретения содержит данные о получении штамма Rhodococcus rhodochrous МЗЗ, характеристику его свойств и примеры его использования для получения алифатических и ароматических нитрилов. 3 табл.

Штамм бактерий Rhodococcus rhodochrous ВКМ Ас-1515Д - продуцент нитрилгидратазы.