КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ НОСИТЕЛЯ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ, РАСЩЕПЛЯЮЩИХ УГЛЕВОДОРОДЫ, И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НОСИТЕЛЯ Российский патент 2007 года по МПК C12N11/12 B09C1/10 C12N1/26 

Изобретение относится к химии, а также к биотехнологии и экологии, конкретно к системам на основе микроорганизмов, осуществляющих расщепление углеводородов, причем микроорганизмы иммобилизованы на целлюлозосодержащем носителе.

Изобретение может быть использовано для биологической рекультивации земель, очистки инженерных сооружений и технологических установок, подвергнутых загрязнению нефтью и нефтепродуктами в результате аварий и эксплуатационных потерь при добыче, транспортировке и другой хозяйственной деятельности человека.

Восстановление естественного плодородия загрязненных нефтью почв, а также очистка инженерных сооружений и технологических установок требуют значительно большего времени и усилий по сравнению с другими техногенными загрязнениями. Одним из наиболее действенных способов считается использование специально подобранных микроорганизмов, способных окислять сырую нефть и продукты ее переработки - дизельное топливо, керосины и т.д. [Atlas, R.M., Microbial hydrocarbon degradation - bioremediation of oil spills. // J. Chem. Technol. Biotechnol. V.52, P.149-156 (1991)]. Главным фактором заселения природных сред микроорганизмами является скорость их размножения. Существенным недостатком простого внесения микроорганизмов в почву является неэкономичность, т.к. для получения в промышленных объемах биомассы, необходимой для очистки реальных разливов нефти на воде и почве, необходимо сложное технологическое оборудование. Кроме того, бактерии-деструкторы развиваются главным образом в аэробных условиях и могут эффективно очищать лишь поверхность почвы, где достаточно кислорода для их жизнедеятельности, не затрагивая глубинные слои.

Одним из эффективных приемов повышения активности микроорганизмов и интенсификации процесса биодеструкции нефтепродуктов является использование клеток, иммобилизованных на подходящих носителях. Основными требованиями к таким носителям являются пористая структура и высокоразвитая поверхность носителя, способного хорошо аккумулировать питательные вещества, влагу, кислород, что улучшает аэрацию почвы и создает благоприятные условия для деструктивной деятельности микроорганизмов, разлагающих углеводороды. Кроме того, важными параметрами являются доступность, низкая стоимость и биоразлагаемость носителя.

Известен состав для очистки почвы и воды от нефти и нефтепродуктов, содержащий нефтеокисляющие микроорганизмы, удобрение и адсорбент (носитель клеток), которым является торф, причем в качестве удобрения используют азотнофосфорсодержащие минеральные удобрения [Патент РФ №2238807. Состав для очистки почвы от нефтяных загрязнений. 2004.10.27]. Состав для очистки сильнозагрязненных поверхностей почвы нефтью и нефтепродуктами содержит в 100 г а.с.в.: 12-15% азота и 1,8-2,3% фосфора (при соотношении N:P=1:0,15) при следующем соотношении компонентов, мас.%: азотное удобрение 24,25-44,10; фосфорное удобрение 6,50-8,8; торф остальное.

Присутствующие в торфе углеводородокисляющие микроорганизмы начинают интенсивно развиваться при попадании в среду, содержащую нефть, используя для питания ее углеводороды, а также минеральные соли, содержащиеся в составе композиции.

Для приготовления состава используют торф влажностью от 55 до 70%. Состав получают следующим способом: торф смешивают с минеральными удобрениями, затем в течение 3-7 суток приготовленную смесь инкубируют в мезофильном режиме для обеспечения необходимого уровня численности углеводородокисляющих микроорганизмов. Сорбционная емкость по отношению к нефти 3,5-8 г нефти/г а.с.в., общая численность углеводородокисляющих микроорганизмов (100-400)×10⁸ клеток/г а.с.в. Внесение состава осуществляется в весенне-летний период с помощью разбрасывателя минеральных удобрений с последующим перемешиванием с поверхностным слоем почвы на глубину 20 см.

Основным недостатком данного технического решения является то, что предлагаемый состав может иметь случайный набор микроорганизмов, что определяется природными факторами местности, где был взят торф, также как и содержание бактерий в нем может очень сильно различаться. Это сказывается на недостаточной эффективности способа и ограничивает область его применения.

Известна композиция в виде бактериального препарата [Патент РФ №2191753. Препарат для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. 2002.10.27], содержащего аэробные нефтеокисляющие бактерии, воду и органический субстрат (т.е. носитель), причем в качестве органического субстрата используется сорбент «Фежел», представляющий собой целлюлозный материал, покрытый слоем сорбирующего вещества (феррицианид железа), а также дополнительно препарат содержит тиомочевину и сахарозу при следующем соотношении компонентов, мас.%: сорбент «Фежел» 98,0-85,0; тиомочевина 0,2-0,5; сахароза 3,0-5,0; вода (разбавитель) остальное.

В состав препарата входят аэробные нефтеокисляющие бактерии Acinetobacter sp.HB-1, Mycobacterium flavescens ВКПМ В-6000, Mycobacterium sp.ИЖ 4, Rhodococcus sp.56д, подобранные к условиям очищаемой территории, а необходимое содержание живых бактерий рассчитывается в зависимости от степени загрязнения.

Сорбент-носитель «Фежел» представляет собой гранулы древесной целлюлозы, покрытые слоями сорбирующего вещества. Препарат «Фежел-био» получают путем нанесения клеток нефтеокисляющих бактерий на сухой сорбент-носитель «Фежел», который перед использованием высушивают при температуре 105-110°С в течение 3-4 часов до влажности 5,5%. Микробную массу выращивают отдельно. Концентрированную клеточную суспензию (10¹¹ клеток/мл) смешивают с сорбентом в весовом соотношении 7:1. В качестве стабилизатора в концентрированную биомассу вносят 0,5% тиомочевины, для сохранения жизнедеятельности бактерий вносят 5% сахарозы. Полученный влажный препарат раскладывают на лотки и высушивают при комнатной температуре в течение 2 суток и продувкой воздуха (40°С) над лотками в течение 2 часов до влажности 2-5%. Готовый препарат при использовании для очистки почвы запахивают на глубину 20-25 см. Периодически почву рыхлят культиватором (3-4 раза за сезон), вносят минеральные удобрения. Процесс очистки рассчитан на 4-5 месяцев.

Недостатком данного технического решения является необходимость использования сорбирующего слоя из феррицианида железа - вещества дорогого и токсичного для теплокровных организмов.

Наиболее близким к заявляемому изобретению является техническое решение [Патент РФ №2112610. Состав для очистки почвы от нефтяных загрязнений и способ очистки почвы от нефтяных загрязнений. 1998.10.6], представляющее собой композицию для очистки почвы от нефтяных загрязнений с помощью нефтеокисляющих микроорганизмов (1,0-2,0 мас.%), нанесенных на адсорбент (носитель) вместе с удобрением, где в качестве удобрения используют комплексное удобрение (9,0-16,0 мас.%). В качестве нефтеокисляющих микроорганизмов используют бактериальный препарат «Путидойл», представляющий собой ассоциацию микроорганизмов: Pseudomonas stutzeri 361-1; Rhodococcus erythropolis 367-2 и 367-6; Dietzia maris 367-4 и 367-5; Candida sp.367-3, а качестве адсорбента используют древесную стружку.

Композицию готовят простым смешением компонентов. Обработку загрязненной почвы проводят в весенне-летний период при температуре воздуха не ниже 10°С. При сильном загрязнении почвы, когда на поверхности грунта имеются участки со скоплением невпитавшейся нефти, вначале производят сбор нефти мешками с адсорбентом. Далее в почву, пропитанную загрязнениями, методом вспашки или распылением вводят предлагаемый состав в количестве 1 ч. состава на 4-5 ч. нефтяного загрязнения. Через 2-3 месяца после обработки делают анализ почвы.

Данное техническое решение, как наиболее близкое к заявляемому по типу используемого носителя микроорганизмов и области применения, выбрано за прототип.

Прототип характеризуется простотой приготовления состава, дешевизной и нетоксичностью состава композиции, возможностью очистки любых видов почв при температуре от 10 до 50°С.

Однако данное техническое решение имеет существенный недостаток - малую емкость используемого носителя в отношении иммобилизуемых клеток, поскольку в водном микроокружении достаточно гидрофильные древесные стружки очень слабо удерживают нефтеокисляющие микроорганизмы, имеющие повышенную гидрофобность клеточной поверхности [Самсонова А.С., Алещенкова З.М., Ли Е., Лим Б.-Р., Хван С.В., Семочкина Н.Ф., Пинчук Л.С., Макаревич А.Б., Кравцов А.Г. Очистка сточных вод от дизельного топлива с помощью иммобилизованных микроорганизмов-деструкторов // Биотехнология, №4, С.83-87 (2003)]. Кроме того, при внесении бактериальной массы непосредственно в почву даже в присутствии предварительно введенного адсорбента не обеспечиваются максимально благоприятные условия для жизнедеятельности и роста микроорганизмов.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка композиции для получения носителя иммобилизованных клеток углеводородокисляющих микроорганизмов и способа получения указанного носителя.

Поставленная задача решается тем, что композиция для получения носителя иммобилизованных углеводородокисляющих микроорганизмов состоит из целлюлозосодержащей основы, олифы, эмульгатора и разбавителя, причем в качестве целлюлозосодержащей основы используют отходы деревообработки или сельского хозяйства, выбранные из группы: опилки, стружки, щепа, солома, кукурузные кочерыжки; эмульгатор выбран из группы: поливиниловый спирт, карбоксиметилцеллюлоза, оксиэтилцеллюлоза, метилцеллюлоза, пектин, желатина, биосурфактант, изопропиловый спирт, бутиловый спирт; а разбавитель выбран из группы: уайт-спирит, петролейный эфир, серный эфир, 5-20%-ный водный диметилсульфоксид, вода, при соотношении компонентов, мас.ч.:

Целлюлозосодержащая основа100;Олифа10-20;Эмульгатор0-30;Разбавитель10-100

Получение заявляемого носителя осуществляют сначала смешиванием олифы, эмульгатора (выбранного из группы: поливиниловый спирт, карбоксиметилцеллюлоза, оксиэтилцеллюлоза, метилцеллюлоза, пектин, желатина, биосурфактант, изопропиловый спирт, бутиловый спирт) и разбавителя (выбранного из группы: уайт-спирит, петролейный эфир, серный эфир, 5-20%-ный водный диметилсульфоксид, вода), а затем полученной смесью обрабатывают целлюлозосодержащую основу (выбранную из группы: опилки, стружки, щепа, солома, кукурузные кочерыжки) в течение 0,1-0,5 часа при 10-30°С с последующей сушкой в течение 6-48 часов при 20-30°С и далее в течение 0,5-2 часов при 75-120°С.

Носитель иммобилизованных клеток микроорганизмов, получаемый согласно указанной последовательности операций, обладает сорбционной емкостью в отношении углеводородокисляющих микроорганизмов, составляющей 10-50 мг биомассы на г носителя.

В качестве таких микроорганизмов используют известные штаммы или консорциумы, например, Rhodococcus ruber ИЭГМ 231; ассоциацию Rhodococcus ruber ИЭГМ 231 и Rhodococcus erythropolis ИЭГМ 200; естественную микробную ассоциацию, выделенную из нефтезагрязненной почвы. Иммобилизацию клеток осуществляют известными приемами, в частности, путем внесения носителя в суспензию микроорганизмов, содержащую 10⁶-10⁹ клеток в 1 мл натрий-фосфатного буфера (рН 7,0), и последующего инкубирования смеси при 18-22°С и постоянном перемешивании (130 об/мин) в течение 1-3 сут. При этом массовое соотношение носителя к клеточной суспензии составляет 1:10-1:50.

Заявляемые композиция и совокупность операций при получении носителя не известны из уровня техники, поэтому заявляемое техническое решение отвечает критерию новизна.

Предлагаемое техническое решение предусматривает использование биоразлагаемых и дешевых отходов деревопереработки и сельского хозяйства в качестве целлюлозосодержащей основы при получении заявляемого носителя, что позволяет легко адаптировать данную систему к практически любому доступному в конкретной местности сырью.

В состав носителя входит олифа на основе растительного масла; олифа, используемая как гидрофобизатор поверхности носителя, обеспечивает повышение степени сродства как микроорганизмов, расщепляющих углеводороды, к адсорбирующим поверхностям носителя, так и самого носителя к нефти. Кроме того, олифа придает дополнительные водоотталкивающие свойства носителю, а именно улучшает его флотацию, повышает устойчивость к биоповреждениям. Эти факторы повышают эффективность носителя для иммобилизации и роста на нем клеток, а также увеличивают время использования носителя в качестве подложки для функционирования клеток. При содержании олифы в композиции более 20 мас.ч. увеличивается стоимость носителя и затрудняется процесс приготовления смеси олифы, эмульгатора и разбавителя, используемой для обработки целлюлозосодержащей основы, а также сокращается полезная площадь для контакта с клетками вследствие закрытия каналов и пор целлюлозосодержащей основы. Содержание олифы менее 10 мас.ч. приводит к недостаточной эффективности (низкой емкости) носителя для иммобилизации клеток.

В состав заявляемой композиции также входит эмульгатор из группы ряда биоразлагаемых экологически безопасных соединений; в случае же летучих эмульгаторов (изопропиловый или бутиловый спирты) они удаляются из массы носителя во время его сушки. Эмульгатор необходим для равномерного распределения гидрофобизатора по доступной поверхности целлюлозосодержащей основы. Предусматриваемое изобретением количество эмульгатора составляет до 30 мас.ч., поскольку большее его содержание уже не дает существенного положительного эффекта, а только удорожает композицию. Химическая природа эмульгатора, используемого в заявляемом техническом решении, не препятствует процессу иммобилизации микроорганизмов на носителе и их росту.

Наконец, заявляемая композиция содержит разбавитель; его концентрация обусловлена тем, что при содержании разбавителя менее чем 10 мас.ч. не удается полностью обработать (смочить) олифой доступную поверхность целлюлозосодержащей основы, при содержании разбавителя более 100 мас.ч. неоправданно возрастают энергозатраты на сушку конечного продукта - носителя для иммобилизации микроорганизмов, расщепляющих углеводороды.

При осуществлении заявляемого способа получения носителя сначала готовят смесь олифы, эмульгатора и разбавителя, а затем обрабатывают целлюлозосодержащую основу полученной смесью путем смачивания с последующим перемешиванием в течение 0,1-0,5 часа при 10-30°С, после чего композицию сушат в течение 6-48 часов при 20-30°С и далее в течение 0,5-2 часов при 75-120°С. Режимы обработки и сушки подобраны экспериментально таким образом, чтобы обеспечить равномерное распределение олифы на доступной поверхности целлюлозосодержащей основы и достичь хорошего закрепления олифы на ней.

Предлагаемый носитель может применяться для адсорбционной иммобилизации микроорганизмов (грамположительных и грамотрицательных бактерий, дрожжевых и мицеллярных грибов), ведущих окисление углеводородных соединений и имеющих относительно гидрофобную клеточную поверхность. При этом можно проводить иммобилизацию как чистых культур микроорганизмов, так и смешанных микробных популяций. Биокатализаторы на основе адсорбированных на предлагаемом носителе клеток углеводородокисляющих микроорганизмов могут найти применение в таких процессах, как биологическая очистка воды, воздуха, почвы и других сред от углеводородных загрязнений; производство биомассы и биосинтез ценных метаболитов из углеводородного сырья; направленные реакции биотрансформации сложных органических соединений, например стероидов; биодеструкция высокотоксичных ксенобиотиков [Козляк Е.И., Якимов М.М., Уткин И.Б., Рогожин И.С., Соломон З.Г., Безбородов A.M. Физико-химические основы иммобилизации клеток методом сорбции // Прикладная биохимия и микробиология. Т. 27, вып.6, с.788-803 (1991). Obuekwe C.O., Al-Muttawa E.M. Selfimmobilized bacterial cultures with potential for application as ready-to-use seeds for petroleum bioremediation // Biotechnology Letters, v.23, p.1025-1032 (2001). Kostov O., Lynch J.M. Composted sawdust as a carrier for Bradyrhizobium, Rhizobium and Azospirillum in crop inoculation // World Journal of Microbiology & Biotechnology, v.14, p.389-397 (1998)]. Повышенная устойчивость иммобилизованных микробных клеток к физико-химическим воздействиям позволяет проводить процессы в широком диапазоне внешних условий (при повышенных и низких температурах и рН, высоком содержании ионов) [Синицын А.П., Райнина Е.И., Лозинский В.И., Спасов С.Д. Иммобилизованные клетки микроорганизмов. М.: Изд-во МГУ, 288 с. (1994)]. Нетоксичность и биоразлагаемость целлюлозных материалов предлагаемого носителя гарантирует экологическую безопасность использования иммобилизованных биокатализаторов на его основе в различных областях промышленности и защиты окружающей среды.

Ниже приводятся типичные примеры реализации заявляемого изобретения, остальные примеры, подтверждающие его заявляемые параметры, сведены в таблицу (номера типичных примеров соответствуют их номерам в таблице).

Пример 2.

Получение носителя. Олифу (15 мас.ч.) смешивают с уайт-спиритом (40 мас.ч.). Этой композицией обрабатывают древесные опилки в расчете 15 мас.ч. олифы на 100 мас.ч. опилок. Массу тщательно перемешивают в течение 0,1 часа при 20°С, далее распределяют тонким слоем на поддоне для удаления растворителя при вентилировании в течение 12 часов при 20°С, а затем прогревают при 105°С в течение одного часа. Относительную степень гидрофобизации оценивают по адсорбции паров воды за 7 сут при 100%-ной влажности. Найденная величина составляет 0,330 г воды/г сух. носителя, что примерно на 15% меньше таковой исходных негидрофобизованных опилок (№1 в таблице примеров).

Иммобилизация клеток микроорганизмов и деградация углеводородов. В суспензию (50 мас.ч.) клеток Rhodococcus ruber ИЭГМ 231, выращенных в мясопептонном бульоне и дважды отмытых натрийфосфатным буфером (рН 7,0), содержащую 10⁶ клеток в 1 мл буфера, вносят полученный носитель (1 мас.ч.), предварительно стерилизованный автоклавированием (105°С, 15 мин), и инкубируют смесь при 18-22°С на орбитальном шейкере (130 об/мин) в течение 3 сут. Процесс адсорбции бактериальных клеток на носитель контролируют нефелометрически (при 600 нм). Количество иммобилизованных клеток рассчитывают по разности концентрации клеточной суспензии до и после иммобилизации. Данная величина составляет 41 мг сухого веса клеток/г носителя. Носитель с иммобилизованными бактериальными клетками (1 мас.ч.) вносят в минеральную среду (20 мас.ч.) следующего состава, г/л: КН₂РО₄ - 1,0; К₂НРО₄ - 1,0; NaCl -1,0; KNO₃ - 1,0; MgSO₄×7H₂O - 0,2; CaCl₂ - 0,02; FeCl₃ - 0,001. В среду добавляют н-гексадекан в концентрации 3,0 об.%. Культивирование проводят при 28°С, 150 об/мин в течение 7 сут. Степень биодеградации н-гексадекана определяют по количеству остаточного углеводорода в среде культивирования после его двукратной экстракции н-гексаном (10 мас.ч.). К объединенному экстракту добавляют Na₂SO₄ для удаления остаточной воды. Экстракт отфильтровывают в предварительно взвешенную круглодонную колбу, и растворитель выпаривают на роторном испарителе при 50°С в течение 30 мин. После удаления растворителя колбу взвешивают и определяют количество остаточного н-гексадекана. Степень биодеградации углеводорода иммобилизованными на предлагаемом носителе клетками составляет 65,5%, что в 4 раза превышает данный показатель для свободных бактериальных клеток (16,4%).

Пример 12.

Получение носителя. В предварительно приготовленный 1%-ный водный раствор карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) при интенсивном перемешивании постепенно прибавляют олифу из расчета 10 мас.ч. на 100 мас.ч. стружек. Процесс смешения продолжают до получения композиции в виде стабильной эмульсии. Готовую эмульсию равномерно распределяют по поверхности древесных стружек и затем перемешивают в течение 0,2 часа при 22°С. Влажную массу помещают на поддон и сушат 6 часов под струей воздуха при 25°С, а далее прогревают при 120°С в течение 0,5 часа. Найденная величина относительной гидрофобности полученного носителя составляет 0,310 г воды/г сух. носителя, что примерно на 7,5% меньше таковой исходных негидрофобизованных стружек (№10 в таблице примеров).

Иммобилизация клеток микроорганизмов и деградация углеводородов. В суспензию (50 мас.ч.) углеводородокисляющих микроорганизмов, выделенных из нефтезагрязненной почвы с помощью накопительной культуры [Ившина И.Б., Оборин А.А., Нестеренко А.А., Касумова С.А. Бактерии рода Rhodococcus грунтовых вод района нефтяных месторождений Пермского Предуралья // Микробиология, т.50, вып.4, с.709-717 (1981)], содержащую 10⁶ клеток/мл, вносят полученный носитель (1 мас.ч.), предварительно стерилизованный автоклавированием (105°С, 15 мин), и инкубируют смесь при 18-22°С на орбитальном шейкере (130 об/мин) в течение 3 сут. Процесс адсорбции микробных клеток на носитель контролируют нефелометрически (при 600 нм). Количество иммобилизованных клеток рассчитывают по разности концентрации клеточной суспензии до и после иммобилизации. Данная величина составляет 22,7 мг сухого веса клеток/г носителя. Носитель с иммобилизованными микробными клетками (1 мас.ч.) вносят в минеральную среду (20 мас.ч.) следующего состава, г/л: КН₂РО₄ - 1,0; К₂НРО₄ - 1,0; NaCl - 1,0; KNO₃ - 1,0; MgSO₄×7H₂O - 0,2; CaCl₂ - 0,02; FeCl₃ - 0,001. В среду добавляют сырую нефть (ρ₂₀°=0,89 г/см³) в количестве 0,4 об.%. Культивирование проводят при 28°С, 150 об/мин в течение 10 сут. Степень биодеградации нефти определяют по количеству деградированных предельных нефтяных углеводородов (С₁₂-С₂₂). Для этого остаточную нефть трехкратно экстрагируют хлороформом (10 мас.ч.). Углеводороды нефти в хлороформенных экстрактах анализируют с помощью ГЖХ после разделения образца на хроматографической колонке (Силохром С120, 0,1-0,2 мм) и последующего элюирования непредельной фракции н-гексаном (10 мас.ч.). Степень биодеградации нефтяных углеводородов иммобилизованной на предлагаемом носителе смешанной природной популяцией углеводородокисляющих микроорганизмов составляет 61,6%, что в 2,8 раза превышает данный показатель для свободных клеток (22,0%).

Пример 14.

Получение носителя. В предварительно приготовленный 3%-ный водный раствор поливинилового спирта (ПВС) при интенсивном перемешивании прибавляют олифу из расчета 15 мас.ч. на 100 мас.ч. древесной щепы, затем полученной эмульсией обрабатывают щепу 0,2 часа при 22°С, а далее сушат сначала 48 часов при 28°С и потом один час при 100°С. Найденная величина относительной гидрофобности полученного носителя составляет 0,278 г воды/г сух. носителя, что примерно на 11% меньше таковой исходной негидрофобизованной щепы (№13 в таблице примеров).

Иммобилизация клеток микроорганизмов и деградация углеводородов. К суспензии (1 мас.ч.) клеток Rhodococcus ruber ИЭГМ 231, выращенных в минеральной среде с н-гексадеканом, добавляют суспензию (1 мас.ч.) углеводородокисляющих микроорганизмов, выделенных из нефтезагрязненной почвы с помощью накопительной культуры [Ившина И.Б., Оборин А.А., Нестеренко А.А., Касумова С.А. Бактерии рода Rhodococcus грунтовых вод района нефтяных месторождений Пермского Предуралья // Микробиология, т.50, вып.4, с.709-717 (1981)]. При этом обе исходные суспензии содержат 10⁶ клеток/мл. В полученную смешанную суспензию (50 мас.ч.) микроорганизмов вносят полученный носитель (1 мас.ч.), предварительно стерилизованный автоклавированием (105°С, 15 мин), и инкубируют смесь при 18-22°С на орбитальном шейкере (130 об/мин) в течение 3 сут. Процесс адсорбции микробных клеток на носитель контролируют нефелометрически (при 600 нм). Количество иммобилизованных клеток рассчитывают по разности концентрации клеточной суспензии до и после иммобилизации. Данная величина составляет 34,1 мг сухого веса клеток/г носителя. Носитель с иммобилизованными микробными клетками (1 мас.ч.) вносят в почву (6 мас.ч.), загрязненную сырой нефтью (ρ₂₀°=0,89 г/см³) в концентрации 10 об.%. Смесь тщательно перемешивают для равномерного распределения носителя и микроорганизмов. Инкубирование проводят при 18-22°С в течение 28 сут. Почву ежедневно рыхлят и увлажняют до достижения уровня относительной влажности 20%. Степень биодеградации нефти в почве определяют по количеству деградированных предельных нефтяных углеводородов (С₁₂-С₂₂). Для этого остаточную нефть в почвенном образце (1 мас.ч.) трехкратно экстрагируют хлороформом (10 мас.ч.). Углеводороды нефти в объединенном хлороформенном экстракте анализируют с помощью ГЖХ после разделения образца на хроматографической колонке (Силохром С120, 0,1-0,2 мм) и последующего элюирования непредельной фракции н-гексаном (10 мас.ч.). Степень биодеградации нефтяных углеводородов в почве иммобилизованной на предлагаемом носителе смешанной популяцией углеводородокисляющих микроорганизмов составляет 67,6%, что в 2,1 раза превышает данный показатель для свободных клеток (32,9%).

Пример 16.

Получение носителя. В предварительно приготовленный 2%-ный водный раствор пектина (ПК) при интенсивном перемешивании постепенно прибавляют олифу из расчета 10 мас.ч. на 100 мас.ч. кукурузных кочерыжек. Полученную композицию в виде эмульсии равномерно распределяют по поверхности частиц измельченных кукурузных кочерыжек и затем перемешивают в течение 0,3 часа при 30°С. Распределяют влажную массу на поддоне и сушат при 30°С, периодически перемешивая, в течение 48 часов, а затем при 95°С в течение 2 часов. Найденная величина относительной гидрофобности полученного носителя составляет 0,201 г воды/г сух. носителя, что примерно на 6,5% меньше таковой исходных негидрофобизованных частиц измельченных кукурузных кочерыжек (№15 в таблице примеров).

Иммобилизация клеток микроорганизмов и деградация углеводородов. В суспензию (50 мас.ч.) клеток Rhodococcus ruber ИЭГМ 231 и Rhodococcus erythropolis ИЭГМ 200, выращенных в минеральной среде с н-гексадеканом, содержащую 10⁶ клеток/мл, вносят полученный носитель (1 мас.ч.), предварительно стерилизованный автоклавированием (105°С, 15 мин), и инкубируют смесь при 18-22°С на орбитальном шейкере (130 об/мин) в течение 3 суток. Процесс адсорбции бактериальных клеток на носитель контролируют нефелометрически (при 600 нм). Количество иммобилизованных клеток рассчитывают по разности концентрации клеточной суспензии до и после иммобилизации. Данная величина составляет 12,0 мг сухого веса клеток/г носителя. Носитель с иммобилизованными бактериальными клетками (1 мас.ч.) вносят в минеральную среду (20 мас.ч.) следующего состава, г/л: КН₂РО₄ - 1,0; К₂НРО₄ - 1,0; NaCl - 1,0; KNO₃ - 1,0; MgSO₄×7H₂O - 0,2; CaCl₂ - 0,02; FeCl₃ - 0,001. В среду добавляют н-гексадекан в концентрации 3,0 об.%. Культивирование проводят при 28°С, 150 об/мин в течение 7 сут. Степень биодеградации н-гексадекана определяют по количеству остаточного углеводорода в среде культивирования после его двукратной экстракции н-гексаном (10 мас.ч.). К объединенному экстракту добавляют Na₂SO₄ для удаления остаточной воды. Экстракт отфильтровывают в предварительно взвешенную круглодонную колбу, и растворитель выпаривают на роторном испарителе при 50°С в течение 30 мин. После удаления растворителя колбу взвешивают и определяют количество остаточного н-гексадекана. Степень биодеградации углеводорода иммобилизованными на предлагаемом носителе клетками составляет 52,6%, что в 1,2 раза превышает данный показатель для свободных бактериальных клеток (43,1 %).

Пример 20.

Получение носителя. К 5 мас.ч. биосурфактанта [Philp J.C., Kuyukina M.S., Ivshina I.B., Dunbar S.A., Christofi N., Lang S., Wray V. Alkanotropic Rhodococcus rubber as a biosurfactant producer // Appl. Microbiol. Biotechnol. V.59, №3, p.318-324 (2002)] прибавляют 90 мас.ч. 20%-ного водного диметилсульфоксида и перемешивают до образования прозрачного раствора. Далее при интенсивном перемешивании вводят олифу из расчета 15 мас.ч. на 100 мас.ч. соломы, которую обрабатывают полученной смесью в течение 0,1 часа при 25°С и далее сушат 36 часов при 21°С, а затем 1,5 часа при 90°С. Найденная величина относительной гидрофобности полученного носителя составляет 0,236 г воды/г сух. носителя.

Иммобилизация клеток микроорганизмов и деградация углеводородов. В суспензию (50 мас.ч.) клеток Rhodococcus ruber ИЭГМ 231, выращенных в минеральной среде с н-гексадеканом, содержащую 10⁶ клеток/мл, вносят полученный носитель (1 мас.ч.), предварительно стерилизованный автоклавированием (105°С, 15 мин), и инкубируют смесь при 18-22°С на орбитальном шейкере (130 об/мин) в течение 3 сут. Процесс адсорбции бактериальных клеток на носитель контролируют нефелометрически (при 600 нм). Количество иммобилизованных клеток родококков рассчитывают по разности концентрации клеточной суспензии до и после иммобилизации. Данная величина составляет 23,8 мг сухого веса клеток/г носителя. Носитель с иммобилизованными микробными клетками (1 мас.ч.) вносят в минеральную среду (20 мас.ч.) следующего состава, г/л: КН₂РО₄ - 1,0; К₂НРО₄ - 1,0; NaCl - 1,0; KNO₃ - 1,0; MgSO₄×7H₂O - 0,2; СаС1₂ -0,02; FeCl₃ - 0,001. В среду добавляют сырую нефть (ρ₂₀°=0,89 г/см³) в количестве 0,4 об.%. Культивирование проводят при 28°С, 150 об/мин в течение 10 сут. Степень биодеградации нефти определяют по количеству деградированных предельных нефтяных углеводородов (C₁₂-C₂₂). Для этого остаточную нефть трехкратно экстрагируют хлороформом (10 мас.ч.). Углеводороды нефти в хлороформных экстрактах анализируют с помощью ГЖХ и последующего элюирования непредельной фракции н-гексаном (10 мас.ч.). Степень биодеградации нефтяных углеводородов иммобилизованными на предлагаемом носителе клетками составляет 64,9%, что в 2,0 раза превышает данный показатель для свободных клеток (32,5%).

Предлагаемое изобретение имеет следующие преимущества по сравнению с аналогом и прототипом.

1. Поскольку в заявляемом техническом решении предусматривается гидрофобизация целлюлозосодержащей основы, то, по сравнению с аналогами, предлагаемое изобретение характеризуется:

- повышением эффективности адгезии и роста расщепляющих углеводороды микроорганизмов на носителе (сравн. исходную цел люлозосодержащую основу (№1, 6, 10, 13, 15, 17 в таблице примеров) и гидрофобизованный носитель (№2-5, 7-9, 11-12, 14, 16, 18-20) соответственно);

- увеличением степени сорбции гидрофобных углеводородов на носителе;

- повышением устойчивости целлюлозосодержащей основы к биоповреждениям, отсюда увеличением продолжительности эксплуатации носителя в почве.

2. Масштабное использование широкого круга экологически без вредных, биоразлагаемых и дешевых отходов деревообработки и сельского хозяйства в качестве целлюлозосодержащей основы носителя иммобилизованных углеводородокисляющих микроорганизмов создает хорошие предпосылки рациональной утилизации подобных отходов, которые в больших количествах накапливаются на различных производствах и зачастую либо используются с низкой эффективностью, либо просто сжигаются, либо захораниваются без использования.

3. Используемые олифа и эмульгаторы также относятся к группе экологически безопасных биоразлагаемых веществ (летучие эмульгаторы удаляются во время сушки), поэтому внесение, например в почву, заявляемого носителя с адсорбированными клетками микроорганизмов не наносит ущерба окружающей среде и, кроме того, способствует дополнительной аэрации очищаемых площадей.

4. Проведение гидрофобной модификации целлюлозосодержащей основы, осуществляемое с помощью заявляемой композиции в заявляемых режимах, приводит к увеличению емкости носителя в отношении иммобилизуемых микроорганизмов, расщепляющих углеводороды, что существенно повышает технологичность процесса очистки загрязненных объектов в целом.

Изобретение относится к биотехнологии и экологии, конкретно к системам на основе микроорганизмов, осуществляющих расщепление углеводородов, причем микроорганизмы иммобилизованы на целлюлозосодержащем носителе. Композиция для получения носителя микроорганизмов, расщепляющих углеводороды, состоит из целлюлозосодержащей основы, гидрофобизатора, эмульгатора и разбавителя, при соотношении компонентов (мас.ч.): целлюлозосодержащая основа 100; гидрофобизатор 10-20; эмульгатор 0-30; разбавитель 10-100. Получение носителя осуществляют приготовлением смеси гидрофобизатора, эмульгатора и разбавителя, а затем полученной смесью обрабатывают целлюлозосодержащую основу в течение 0,1-0,5 часа при 10-30°С с последующей сушкой в течение 6-48 часов при 20-30°С и далее в течение 0,5-2 часов при 75-120°С. Носитель иммобилизованных клеток микроорганизмов, получаемый согласно указанной последовательности операций, обладает сорбционной емкостью в отношении утлеводородразрушающих микроорганизмов, составляющей 10-50 мг биомассы на г носителя. 2 н.п. ф-лы, 1 табл.

1. Композиция для получения носителя иммобилизованных углеводородокисляющих микроорганизмов, включающая целлюлозосодержащую основу и разбавитель, отличающаяся тем, что дополнительно композиция содержит олифу и эмульгатор, причем в качестве целлюлозосодержащей основы используют отходы деревообработки или сельского хозяйства, выбранные из группы опилки, стружки, щепа, солома, кукурузные кочерыжки; эмульгатор выбран из группы поливиниловый спирт, карбоксиметилцеллюлоза, оксиэтилцеллюлоза, метилцеллюлоза, пектин, желатина, биосурфактант, изопропиловый спирт, бутиловый спирт, а разбавитель выбран из группы уайт-спирит, петролейный эфир, серный эфир, 5-20%-ный водный диметилсульфоксид, вода, при соотношении компонентов, мас.ч.:

Целлюлозосодержащая основа100Олифа10-20Эмульгатор0-30Разбавитель10-100