ПРЕПАРАТ ДЛЯ ОТКРЕПЛЕНИЯ КОНТАКТЗАВИСИМЫХ КЛЕТОК ОТ СУБСТРАТА И ДЕЗАГРЕГАЦИИ ИХ В КУЛЬТУРЕ Российский патент 1995 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к технике культивирования клеток млекопитающих. Изобретение может быть использовано в биологии, биотехнологии и медицине.

Известно использование протеолитических ферментов и (или) хелатрующих агентов (ЭДТА) для отделения клеток от подложки с целью их дезагрегации.

Недостатком этих препаратов является то, что они сильно повреждают клетки, особенно плазматическую мембрану, удаляя с ее поверхности важные компоненты или повреждая их. Согласно известным исследованиям обработка клеток при пересевах этими препаратами приводит к частичному разрушению клеточной мембраны, ядерной оболочки, деформации ядра, вакуолизации цитоплазмы и перераспределению гетерохроматина.

Известно применение раствора трипсина в качестве препарата для дезагрегации клеток в культуре.

Сфера действия трипсина распространяется практически на все белки, с которыми он контактирует, в том числе на поверхностные белки клеточной мембраны. Это приводит к значительным структурным и функциональным изменениям в клетках, регистрируемым в течение суток после пересева клеток с использованием трипсина. Периодическое повторение этих повреждений в процессе дальнейшего пассирования клеток приводит либо к их дегенерации, либо к трансформации. Это исключает возможность использования таких клеток как для исследовательских целей, так и для практического применения (например, для введения в организм реципиента в составе искусственного органа, поскольку это может вызвать у пациента онкологическое заболевание).

Целью изобретения является повышение жизнеспособности и сохранение нормальных функций культивируемых клеток в процессе их пассирования.

Это достигается применением плазминогена млекопитающих для дезагрегации клеток в культуре (на примере плазминогена собаки, быка и человека).

Изобретение основано на впервые установленной способности плазминогена млекопитающих в концентрациях, близких к физиологическим, влиять на адгезионные взаимодействия между клеткой и подложкой, и между клетками. Плазминоген является предшественником специфического протеолитического фермента плазмина. Плазмин может образовываться в культуре из плазминогена вследствие активации последнего активаторами, экспрессируемыми культивируемыми клетками.

Анализ патентной у научно-технической литературы показал, что неизвестно какое-либо использование плазминогена млекопитающих (также и плазмина) для дезагрегации клеток, в том числе и в культуре. Поэтому можно сделать вывод, что предлагаемое техническое решение может быть квалифицировано как применение известного вещества по новому назначению.

Предлагаемый препарат обеспечивает следующие преимущества по сравнению с результатами, получаемыми при использовании протеолитических ферментов трипсина и коллагеназы для дезагрегации клеток:
увеличение процента жизнеспособных клеток;
увеличение скорости их распластывания;
увеличение пролиферативного периода жизни клеток в культуре.

Указанные преимущества подтверждаются данными, приведенными в таблице.

Ниже приведены примеры конкретного выполнения. Во всех примерах использовали плазминоген, выделенный из сыворотки крови соответствующих млекопитающих по известному методу. Плазминоген представлял собой электрофоретически чистый препарат. Белок идентифицировали определением N-концевой аминокислотной последовательности автоматическим методом Эдмана.

П р и м е р 1. Клетки ВНК-21 выращивали до образования монослоя в пластиковых флаконах (50 мл, фирма "Greiner") в среде DMEM (фирма "Sigma"), содержащей 10% бычьей сыворотки (Минский завод). В опытных культурах отделение клеток проводили при помощи плазминогена собаки, в контрольных культурах при помощи коммерческого 0,25%-ного раствора трипсина. В опытные культуры после удаления из флаконов старой среды вносили по 6 мл свежей среды DMEM без сыворотки, затем добавляли по 0,3 мл раствора плазминогена (1 мг/мл) в солевом буфере. Далее культуры инкубировали в термостате (СО₂-инкубатор) при 37^оС в течение 4,5 ч. После этого флаконы встряхивали, что приводило к откреплению монослоя клеток. Содержимое флакона пипетировали до образования суспензии единичных клеток. Проба трипановым синим показала, что 98% клеток являются жизнеспособными. 1 мл клеточной суспензии переносили в новый флакон, содержащий 6,2 мл среды DMEM и 0,8 мл бычьей сыворотки, помещали в термостат при 37^оС для дальнейшего культивирования. Время распластывания клеток составляло 70 мин.

В контрольные культуры после удаления старой среды вносили по 6 мл предварительно нагретого до 37^оС, 0,25%-ного раствора трипсина и инкубировали 2 мин. Затем раствор трипсина сливали, клетки инубировали при 37^оС в течение нескольких минут до открепления монослоя клеток после встряхивания. Во флаконы вносили по 8 мл среды DMEM, содержащей 10% бычьей сыворотки. Содержимое флаконов пипетировали до получения суспензии единичных клеток. Проба трипановым синим показала, что 84% клеток являются жизнеспособными. Далее по 1 мл клеточной суспензии вносили во флаконы, содержащие по 7 мл среды DMEM с 10% бычьей сыворотки для дальнейшего культивирования. Время распластывания клеток составляло 150 мин.

В случае использования плазминогена собаки клетки ВНК-21 прошли 19 пассажей и сохранили при этом типичную морфологию, соответствующую исходной культуре. Для наблюдения за морфологией клеток использовали световой микроскоп. Не зарегистрированы изменения скорости распластывания клеток и времени образования слитого монослоя (то есть скорости роста) на протяжении всех пересевов.

При использовании при пересевах клеток трипсина после 10 пассажа клетки не образовывали слитого монослоя и после 12 пересева дегенерировали.

П р и м е р 2. Эндотелиальные клетки аорты собаки (2 пассаж) культивировали в двух пластиковых флаконах (50 мл, фирма "Greiner") в среде DMEM (фирма "Sigma"), содержащей 20% эмбриональной сыворотки коровы, с добавкой инсулина и гепарина. После удаления старой среды в опытный флакон вносили 4 мл среды DMEM без сыворотки и добавляли 0,5 мл раствора плазминогена собаки (1 мг/мл) в солевом буфере. Клетки инкубировали 5 ч при 37^оС. После этого флаконы встряхивали и отделившийся монослой пипетировали для получения суспензии единичных клеток. Проба трипановым синим показала, что жизнеспособными являются 94% клеток. Для дальнейшего культивирования 2 мл клеточной суспензии переносили во флакон с 4 мл среды DMEM и 1,5 мл эмбриональной сыворотки коровы. Время распластывания клеток составляло 5 ч.

В контрольном флаконе отделение эндотелиальных клеток от подложки при пересевах проводили трипсином по методике, описанной в примере 1. После отделения монослоя клетки суспендировали в 4 мл среды DMEM, содержащей 20% эмбриональной сыворотки коровы. Проба трипановым синим показала, что 74% клеток являются жизнеспособными. Для дальнейшего культивирования 1,8 мл клеточной суспензии помещали во флакон, содержащий 5,7 мл среды DMEM с 20% эмбриональной сыворотки коровы. (Как и в случае использования плазминогена при пересевах конечный объем культуральной среды равен 7,5 мл при содержании в ней 20% сыворотки). Затем клетки помещали в термостат при 37^оС для дальнейшего культивирования. Время распластывания клеток составляло 14 ч.

П р и м е р 3. Для открепления клеток ВНК-21 от подложки и их дезагрегации использовали плазминоген из сыворотки крови быка. Концентрация плазминогена в исходном растворе была равна 4 мг/мл, а не 1 мг/мл, как в случае использования плазминогена из сыворотки крови собаки, что обусловлено более низкой антиадгезионной активностью плазминогена быка. Все остальные условия соответствуют условиям, описанным в примере 1. Время распластывания открепленных клеток при повторном культивировании составляло 70 мин.

П р и м е р 4. Для открепления клеток ВНК-21 от подложки и получения их суспензии использовали плазминоген из сыворотки крови человека. Концентрация плазминогена в исходном растворе была равна 8 мг/мл. Все остальные условия соответствуют условиям, описанным в примере 1. После получения клеточной суспензии проба трипановым синим показала, что 97% клеток являются жизнеспособными. Время распластывания открепленных клеток при повторном культивировании составляло 80 мин.

Использование плазминогена в сравнении с трипсином обеспечивает следующие преимущества:
возможность получения урожая клеток с интактными цитоплазматическими мембранами, о чем свидетельствует высокая скорость распластывания клеток, а также близкое к 100% количество жизнеспособных клеток после пересева;
увеличение пролиферативного периода жизни клеток, что делает возможным получение их в необходимом количестве из ограниченного источника. Это преимущество может быть использовано в биотехнологии для получения максимального урожая клеток из тканей экзотических животных с целью получения вакцин, а также в медицине для создания искусственных органов, включающих аутологичные клетки реципиента; снижение вероятности трансформации клеток при наращивании их биомассы с целью последующего введения их в том или ином виде в организм человека, например при обращивании аутогенными эндотелиальными клетками протезов сердечно-сосудистой системы. На примере клеток ВНК-21 показано, что при использовании трипсина заметная морфологическая трансформация клеток наблюдается уже к 10 пересеву, а при использовании плазминогена не наблюдается и после 19 пересевов.

Использование: цитология, вирусология. Сущность изобретения: изобретение заключается в использовании плазминогена млекопитающих в качестве препарата для открепления контактзависимых клеток человека и животных от субстрата и дезагрегации клеток в культуре. Использование плазминогена млекопитающих позволяет получать урожай клеток с интактными цитоплазматическими мембранами, о чем свидетельствует близкая к 100% жизнеспособность клеток, высокая скорость распластывания пересеянных клеток (в 2 2,5 раза выше, чем после трипсинизации). По сравнению с традиционными методами с использованием трипсина, коллагеназы и (или) версена, пассирование с применением плазминогена значительно увеличивает пролиферативный период жизни культуры (число пассажей) и позволяет получать большую биомассу клеток из исходного ограниченного источника. 1 табл.

Применение плазминогена млекопитающих в качестве препарата для открепления контактзависимых клеток от субстрата и дезагрегации их в культуре.