Способ получения субкультуры клеток человека и животных Советский патент 1989 года по МПК C12N5/00 

Изобретемте относится к технике культивирования клеток вне организма и. может найти применение в биологии и медицине.

Целью изобретения является повышение ж.изнеспособности и сохранение нормальных функций клеток.

Пример. Эндотелиальные клет- ; ки аорты взрослой собаки выделяют механическим соскабливанием их скальпе- - лем со стороны интимы. Клеточные агрегаты размельчают пипетированием в среде Игла MEM и центрифуг-ируют, Клетки ресуспендируют в 10 мл питательной ;Среды Игла MEM и разливают по 5 мл в два фпакона Фалкон. Причем в один :из них вносят 20% эмбриональной сыво- ротки коровы (контрольная культура Ь другой - 20% собачей сыворотки (опытная культура). Смену питатель- ных сред на соответствующие производят через 2-3 суток. Через 12 суток культивирования при в обоих флаконах образовался монослой эндотедиальных клеток с типичной морфало гией - булыжной мостовой. Затем куаьтуры помещают в термостат Ц-1241М с температурой 6°С. Через 24 ч культуры вы- нимают из термостата-холодильника и . просматривают под шткроскопом. В кон- трольной культуре моноспой IOICTOK остается прочно прикрепленным к подпож- -ке, тогда как в культуре с 20% собачьей сыворотки монослой полностью от- :деляется от подложки и плавает в среде В виде пленки размером 547 см. После энергичной тряски флакона с: клeтoч |ной пле1жой и последующего ггапетирова- ция образовываются небольшие агрега- ты, содержащие в среднем по 5-15 клеток, которые пересеваются в свежую среду Игла с 20% собачьей сыворотки в соотношении 1:6.

Часть клеток при этом используют для оценки их жизнеспособности посредством окраски трипановым синим.Количество ясизнеспособных (т.е. непоглотивших краситель) клеток в исходной

сд

успензии составляет 95%. Через 4-5 ч осле помещедая культуры в термостат ри 37°С практически все клетки прикепляются к подложке и распластывают- j

я.

Для отделения клеток от подложки в.контрольной культуре используют ,1%-ный раствор трипсина в солевом уфере. В результате получают суспен- ю зию единичных клеток, которая также пересевается в соотношении 1:6 в среду Игла +20% эмбриональной сыворотки коровы. Окрашивание пробы этих клеток трипановым синим показывает, что коли-15 чество жизнеспособных клеток не превышает 80%, а время прикрепления их к подложке и распластывания более 12 ч. Дальнейшее пассирование контрольной и опытной субкультур известным и 20 предлагаемым способом (т.е. без использования ферментов) показывает, что после четвертого пересева эндоте- лиапьные клетки в контрольной культуре резко снижают скорость роста и сре-25 ди них появляются аномальные гигантские клети, тогда как в опытной культуре изменений клеток по этим характеристикам не происходит. После пятого пересева клетки в контрольной культу-: зо ре полностью дегенерируют, тогда как опытная культура пересевается восемь раз без каких-либо заметных изменений в скорости роста и морфологии.

П р и м е р 2. Перевиваемые фибро- j бласты мьшш линии ШН выращивают в , среде 199 + 10% .бычьей сыворотки до образования монослоя. Обработкой монослоя этих клеток раствором 0,25% трип- сина получают суспензию фибробластов 40 в среде 199. Полученную суспензию клеток NIH. плотностью 35 тыс/мл помещают в шесть флаконов Карреля по 7 мл в

каждый.

В три из них добавляют 10% бычьей 45 сыворотки (контрольньш культуры), в три других - 5% бычьей сыворотки плюс 5% собачьей сыворотки (опытные культуры) и их помещают в термостат при . Периодически культуры просматри- р вают под микроскопом. В опытных культурах образование монослоя происхо- дат через 3,5-4 суток, в контрольных - на 4,5-5 сутки..После образования монослоя опытные культуры помещают в термостат . Через 12 ч нахождения при в опытных культурах отмечают значительные участки отслоившегося от

подложки монослоя и после встряхивания флаконов происходит его полное открепление. Посредством пипётирования клеточные пленки разбивают до образования суспензии агрегатов в среднем по 3- 10 клеток в каждом. Окрашивание этой суспензии показывает, что 98% клеток жизнеспособны. Время их распластывания на подложке после посева в свежую среду составляет 1,0-1,5 ч в обоих типах сред.

В контрольных культурах отделение клеток проводят обработкой их моно- слоя смесью трипсин-версена в соотношении 1:4. Количество жизнеспособных клеток по трипановой пробе составляет 82%. Время распластывания фибробластов после пересева составляет от 1,5 до 2,5 ч.

П р и м е р 3. Фибропласты линии ВНК-21 культивируют до образования монослоя и затем обрабатывают раствором 0,25% трипсина с целью получения суспензии единичных клеток. Полученные клетки высевались в среду Игла MEM в два флакона Карреля. В один из них добавляют 10% бычьей сыворотки в другой -5% бычьей сыворотки +5% сыворотки собаки. Через 3 суток в обоих культурах фибробласты образовывают монослой.. Флакон с культурой, содержащей сыворотку собаки, помещают в термостат при 5°С. Через 15 ч такой инкубации происходит полное от-- крепление клеток от стекла. После пипётирования И окраски трипановым синим устанавливают подсчетом, что 99% клеток являются жизнеспособными.

Контрольная культура обрабатывается 0,25%-ным раствором трипсина. Три- пановая проба показывает, что жизне-, способными являются 82% клеток.

Формула изобретения

Способ пассирования клеток человека и животных, включаощий их выращивание в среде, содержащей сыворотку крови собаки, и последующее отделение образовавшегося монослоя от подложки, отлич ающий ся тем, что, с целью повышения жизнеспособности и сохранения нормальных функций клеток, отделение монослоя осуществляют инкубацией культуры клеток на холоду при температуре 4-6°С в iечение 12-24 ч.

Изобретение относится к технике культивирования клеток для организма и может найти применение в биологии и медицине. Целью изобретения является повышение жизнеспособности субкультуры. Для этого в состав культуральной питательной среды вводят сыворотку крови собаки и после образования монослоя культуру помещают в холодильник при 4-6°С НА 12-24 Ч. В РЕЗУЛЬТАТЕ ЭТОГО МОНОСЛОЙ ПОЛНОСТЬЮ ОТДЕЛЯЕТСЯ ОТ ПОДЛОЖКИ, И ПОСЛЕ ПИПЕТИРОВАНИЯ ОБРАЗУЮТСЯ МЕЛКИЕ КЛЕТОЧНЫЕ АГРЕГАТЫ, ПРОЦЕНТ ЖИВЫХ КЛЕТОК В КОТОРЫХ ПО ТРИПАНОВОЙ ПРОБЕ СОСТАВЛЯЕТ 95-99%.