СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДЕДИФФЕРЕНЦИРОВАННЫХ КЛЕТОК РЕТИНАЛЬНОГО ПИГМЕНТНОГО ЭПИТЕЛИЯ ГЛАЗА ВЗРОСЛОГО ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2011 года по МПК C12N5/71 

Изобретение относится к области нейробиологии и офтальмологии.

Ретинальный пигментный эпителий (РПЭ) располагается в глазе между нейральной сетчаткой и сосудистой оболочкой глаза. Клетки РПЭ эволюционно адаптированы для защиты нервных клеток сетчатки от чрезвычайно травматичного повреждения светом и оксидативного стресса. А так как клетки РПЭ имеют общее нейроэпителиальное происхождение с клетками мозга, они являются иммунологически привилегированными при их трансплантации не только в глаз, но и в ЦНС. Разработка клеточных технологий для получения специализированных клеточных культур с заданными свойствами на основе РПЭ позволит иметь источник клеток для трансплантации с целью стимуляции регенераторных процессов при широком спектре нейродегенеративных заболеваний. Нативный РПЭ представляет собой монослой сильно пигментированных клеток, имеющих гексогональную форму, что является проявлением эпителиальной дифференцировки клеток. Выделенные из глаза клетки РПЭ в зависимости от подобранных условий культивирования могут обладать либо эпителиальным фенотипом, либо фенотипом фибробласто подобных клеток.

В норме клетки РПЭ формируют неподвижный монослой, но при этом клетки сохраняют способность делиться, когда их помещают в культуру или когда они участвуют в раневом заживлении.

Известно, что в новых условиях микроокружения (in vivo при различных стимулах, таких как фотокоагуляция или криотерапия сетчатки, или in vitro) клетки РПЭ дедифференцируются и показывают псевдометапластическую трансформацию в фибробластоподобные, веретенообразной формы клетки, которые активно делятся и мигрируют, а также депигментируются.

Клетки РПЭ взрослого человека в культуре быстро пролиферируют и дедифференцируются на молекулярном уровне, теряют маркеры дифференцировки РПЭ, такие как RPE65, RET-PE10, CRALBP, CRBP. Дедифференцированные клетки начинают экспрессировать маркеры плюрипотентных клеток (Рах6). Обнаружение в культуре маркеров нейральных стволовых клеток (нестина, β-тубулина-III и др.) свидетельствует уже о трансдифференцировке клеток в нейральном направлении.

Дедифференцированные клетки РПЭ по сравнению с дифференцированными клетками обладают большими потенциями, а именно они активно пролиферируют и мигрируют, они пластичны, т.е. в зависимости от условий микроокружения эти клетки могут приобретать свойства других клеток, что очень важно учитывать при лечении нейродегенеративных заболеваний мозга.

Клетки РПЭ имеют нейроэпителиальное происхождение. При помещении дедифференцированных клеток РПЭ в определенные условия они могут дифференцироваться в двух направлениях: эпителиальном или нейральном. Дифференцированные клетки этого сделать не могут. Поэтому культуры дедиффенцированных клеток РПЭ могут быть использованы в офтальмологической практике (при лечении возрастной макулярной дегенерации, пигментного ретинита и др.) с целью восстановления целостности сетчатки и в неврологической практике с целью стимуляции регенераторных процессов при широком спектре нейродегенеративных заболеваний мозга (болезни Паркинсона, Альцгеймера, Гентингтона и др.).

Кроме того, важно учитывать тот факт, что для трансплантации в головной мозг и субретинальное пространство для лечения нейродегенеративных заболеваний требуется не менее 3-5 млн клеток. Для получения достаточного количества клеток с заданными свойствами подходят только дедифференцированные клетки, поскольку только они обладают пролиферативным потенциалом и при этом сохраняют способность экспрессировать ряд специфических факторов, позволяющих клеткам осуществлять нейропротекторные действия.

Известно изобретение [патент US №6045791, МПК C12N 5/06], заключающееся в следующем. Проводят подготовку популяции зрелых (не плодовых) аутологичных или неаутологичных клеток РПЭ в виде монослойного пласта в поддерживающей конструкции («сендвидж» конструкции) для трансплантации в субретинальную область при реконструкции дистрофически измененного РПЭ. Подготовка клеток РПЭ заключается в сборе клеток из глаз при биопсии в виде интактного монослоя или в сборе клеток из глаз, энуклеированных для забора роговицы, с предварительным культивированием диссоциированных клеток до монослоя в поддерживающей конструкции, помещенной на агарозу или фибрин. Трансплантат толщиной 100-500 микрон с предпочтительной толщиной 150-250 микрон и площадью 1-4 мм и более состоит из слоя коллагена толщиной менее чем 100 микрон с предпочтительной толщиной 1-10 микрон, монослоя клеток РПЭ и слоя желатина толщиной 150-250 мкм. Данное изобретение подразумевает использование клеток РПЭ в виде интактных пластов, точнее слоев сильнопигментированных, гексагональных, поляризованных, непролиферирущих высокодифференцированных клеток. В тех случаях, когда прибегают к культивированию, клетки РПЭ выращивают в ограниченном количестве без пассирования, так как целью является нарастить трансплантат до определенной площади (1-4 мм²), и получают монослой пигментированных клеток. В этих случаях используют следующий метод изоляции клеток РПЭ: свежеэнуклеированные глаза транспортируют в ростовой среде с 5% сыворотки, после удаления переднего сегмента глаза со стекловидным телом надрезают задний сегмент глаза радиально по направлению к зрительному диску 4 длинными разрезами, придавая ему форму цветка с 4 лепестками, далее удаляют нейральную сетчатку, инкубируют задний сегмент в растворе 0,25% трипсина 30 минут при 37°С, клетки отделяют от мембраны Бруха пипетированием пастеровской пипеткой. Клетки культивируют на культуральных слайдах в ростовой среде DMEM/F12 (1:1) с 20% FBS.

Недостатком данного изобретения является возможная контаминация культуры клеток РПЭ клетками нейральной сетчатки и элементами стекловидного тела, которое интимно связано с нейральной сетчаткой и не всегда при выделении отделяется полностью, а также форменными элементами крови в результате разрезания глазной чаши через все слои (конъюнктиву, сосудистую оболочку, РПЭ и нейральную сетчатку). При использовании трипсина возможно повреждение на клетках РПЭ поверхностных молекул, например таких, как рецепторы ростовых факторов, что приводит к замедлению роста клеток и пролиферации культуры из-за блокирования воздействия ростовых факторов среды на клетки. Кроме того, по этому методу получают дифференцированные клетки, и выход клеток небольшой.

Известно изобретение [патент US №6183735, МПК А61К 35/00], заключающееся в следующем. Получали иммортализованные клеточные линии ретинального происхождения (IO/JG2/1 из ретинальных эндотелиальных и IO/LD7/4 из РПЭ клеток) млекопитающих, в частности крыс, путем трансфекции ретровирусного вектора, содержащего SV40 Т-ген, для транспортировки интересующих терапевтических субстанций в глаз и ЦНС при трансплантации. РПЭ клетки изолировали из 6-8 дневных крыс. Интактные глазные яблоки обрабатывали 2% диспазой 30 минут, роговицу и стекловидное тело удаляли, сетчатку изолировали и инкубировали 15 мин в культуральной среде. После инкубации слой клеток РПЭ отделяли от нейральной сетчатки и обрабатывали трипсином для получения клеточной суспензии. Клетки культивировали во флаконах до субконфлюэнта в среде, состоящей из F-10 с 20% FCS, 2 mM L-glutamine, пенициллином и стрептомицином. Культура росла в виде пигментированного монослоя и была положительна на цитокератины и эпитоп РПЭ, названный RET-PE-2.

Однако данным методом получают культуры дифференцированных клеток. Кроме того, при данном методе выделения культура клеток РПЭ контаминируется другими типами клеток, а также повреждается действием трипсина на поверхностные молекулы клеток.

Известно изобретение [патент US №6117675, МПК C12N 5/06], заключающееся в изоляции стволовых клеток из эмбриональной и взрослой сетчатки мышей и человека (из целого слоя РПЭ, включающего пигментированные клетки из цилиарной краевой области), получении суспензионной культуры (свободноплавающих клеточных агрегатов шарообразной формы, т.е. ретиносфер) и дифференцировке клеток в направлении ретинальных клеток. Диссекцию взрослых и эмбриональных слоев нейральной сетчатки и РПЭ выполняли в артифициальной цереброспиналыгой жидкости (aCSF) при комнатной температуре. При выделении слоя РПЭ из взрослых тканей в глазную чашу дополнительно заливали растворы ферментов и инкубировали по 10 минут в растворе диспазы при 30-32°С и в растворе ферментов (трипсина, гиалуронидазы и кинуреновой кислоты) при 37°С. После ферментативной обработки РПЭ разрезали на кусочки размером 1 мм, переносили в бессывороточную среду и механически ресуспендировали, затем диссоциированные клетки помещали на непокрытые культуральные чашки 35 мм в бессывороточной среде, состоящей из DMEM/F12 (1:1), 20 нг/мл EGF и/или 10 нг/мл FGF2 с 2 мкг/мл гепарина, инсулина, трансферрина, прогестерона, путресцина, селенита, глюкозы, 2 mM глютамина, и культивировали до получения в суспензионной культуре свободноплавающих ретиносфер, экспрессирующих Chx10 и не экспрессирующих GFAP, NSE и MBP.

Данный метод направлен на получение суспензионной культуры из пигментированных эпителиальных клеток цилиарной области, а также на получение дифференцированных клеток.

Известно изобретение [патент TW №422881, МПК C12N 5/06], заключающееся в изоляции клеток нативного РПЭ взрослого человека из свежевыделенного глаза, обработке организованного монослоя 0,25%-ным раствором ЭДТА в течение 12 минут, покрытии его 12% желатином при +4°С и трансплантации.

В данном методе дифференцированные клетки РПЭ выделяются слоем.

Обычно для выделения ретинального ПЭ из глаз взрослого человека на этапе отделения клеток от мембраны Бруха используют ферменты (трипсина, папаина). Однако при использовании ферментов происходит разрушение не только межклеточных и клеточно-матриксных контактов, но и самих клеток.

Задачей, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, является получение большого количества жизнеспособных дедифференцированных клеток ретинального пигментного эпителия, уменьшение длительности и упрощение процесса.

Техническим результатом является исключение повреждающего действия ферментов, а также достижение прикрепления на культуральной поверхности популяции клеток с более низкими адгезивными свойствами.

Для решения поставленной задачи способ получения дедифференцированных клеток ретинального пигментного эпителия глаза взрослого человека характеризуется тем, что энуклиируют глазное яблоко при аутопсии, промывают его в спиртовом растворе последовательно при концентрациях 70°, 50°, 30° и в растворе Хенкса без

Са²⁺, Mg²⁺ антибиотиком, удаляют по зубчатой линии передний сегмент глазного яблока, отделяют стекловидное тело и нейральную сетчатку от пигментного эпителия, наполняют глазную чашу раствором Хенкса без Са²⁺, Mg²⁺ с ЭДТА и инкубируют клетки ретинального пигментного эпителия в течение 15-30 мин, полученные клетки собирают пипеткой и переносят в стерильную среду для выделения, состоящую из 500 мл среды DMEM/F12, 2 mМ L-глутамина, 50 мл 10% FBS, 5 мл раствора антибиотика, пипетируют, центрифугируют при в течение 5-7 мин при скорости 800 об/мин, выделенные клетки ресуспендируют на ростовую среду с высоким содержанием сыворотки, состоящую из 500 мл среды DMEM/F12 в соотношении 1:1, 2 mМ L-глутамина, 50 мл 20% FBS, добавки В27 (1:100), 20 нг/мл FGF-2, 20 нг/мл EGF, 2 мкг/мл гепарина, 5 мл раствора антибиотика, затем полученную суспензию клеток ретинального пигментного эпителия распределяют на культуральной поверхности и инкубируют до достижения прикрепления клетками 15-25% ее площади, суспензию с неприкрепившимися клетками аспирируют и распределяют на свежей культуральной поверхности и инкубируют, а к прикрепившимся клеткам добавляют ростовую среду с высоким содержанием сыворотки и инкубируют до достижения конфлюэнтного монослоя целевого продукта, причем распределение суспензии клеток на свежую культуральную поверхность и инкубирование проводят неоднократно до прекращения прикрепления клеток ретинального пигментного эпителия на культуральной поверхности.

В частном варианте энуклиирование глазного яблока проводят до 24 часов после смерти донора.

В другом частном варианте глазное яблоко промывают в спиртовом растворе в течение 1-2 мин при каждой концентрации.

В другом частном варианте глазное яблоко промывают от спиртового раствора в растворе Хенкса без Са²⁺, Mg²⁺ с антибиотиком 2-3 раза.

В другом частном варианте в качестве антибиотика используют 100 U/ml пенициллина и 100 U/ml стрептомицина (10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% Nad).

В другом частном варианте зубчатую линию определяют по границе между темным и светлым участком.

В другом частном варианте отделяют стекловидное тело и нейральную сетчатку от пигментного эпителия, подрезая нейральную сетчатку в области зрительного нерва.

В другом частном варианте раствор Хенкса без Са²⁺, Mg²⁺ содержит 3,76 г/л ЭДТА.

В другом частном варианте полученные клетки ретинального пигментного эпителия собирают пипеткой с объемом наконечника 200µ1.

В другом частном варианте выделение клеток ретинального пигментного эпителия проводят при пониженной температуре на льду.

В другом частном варианте процесс инкубирования проводят при 37°С, влажности воздуха 95%, в атмосфере 5% СО₂.

В другом частном варианте клетки ретинального пигментного эпителия подвергают иммуноцитохимической оценке.

Наиболее важным является время энуклеации глазных яблок до 24 часов после смерти донора. Чем дольше глазные яблоки находятся среди омертвевших тканей, тем дольше они подвергаются воздействию гидролитических ферментов погибших клеток и тканей, т.е. аутолизу. Раннее изъятие биоматериала благоприятно влияет на жизнеспособность клеток РПЭ, при условии, что глазные яблоки находятся в питательной среде при пониженной температуре. При данных условиях время обработки глаз может быть отсрочено до 24 часов.

Использование диссоциирующего раствора Хенкс-ЭДТА без этапа трипсинизации обеспечивает получение большего в 2-3 раза количества жизнеспособных клеток и упрощает процесс. ЭДТА, связывая ионы кальция, блокирует действие кадгеринов, опосредующих клеточную адгезию. Таким образом, ЭДТА, нарушая адгезивные контакты, способствует разрушению эпителиального монослоя, не влияя на жизнеспособность клеток. Больший выход клеток РПЭ связан с отсутствием необходимости отмывки от фермента, на котором происходит потеря клеток.

Инкубирование культуры более 2 дней после посадки на пластик способствует прикреплению популяции клеток с более низкими адгезивными свойствами. Это обеспечивает более быструю пролиферацию клеток, получение достаточного количества клеток на первичном этапе и получение популяции клеток с менее дифференцированными свойствами.

Скорость пролиферации клеток РПЭ в культуре и время достижения конфлюэнтного монослоя целевого продукта (дедифференцированных клеток ретинального пигментного эпителия глаза взрослого человека) зависит не только от возраста донора, причины смерти, времени после смерти, но и от обогащения ростовой среды сывороткой и добавления в нее нейральной добавки и ростовых факторов, стимулирующих пролиферацию и миграцию клеток.

При инкубировании в обогащенной ростовой среде, содержащей высокий процент сыворотки, нейральную добавку и ростовые факторы, конфлюэнтный монослой можно ожидать на 2-3 недели раньше, чем при инкубировании в ростовой среде с низким содержанием 5-10% сыворотки без факторов.

Клетки ретинального пигментного эпителия (РПЭ) были выделены следующим образом.

Клетки РПЭ были выделены из аутопсийного материала (глазных яблок), полученных из судебного морга от доноров с неизвестным офтальмологическим анамнезом. Энуклеацию глаз производили в срок до 24 часов после смерти донора. Глазные яблоки транспортировали в научную лабораторию в стерильной ростовой среде с антибиотиком: 500 мл среды DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham, Sigma, Cat. № D6421, USA); 5 мл р-ра Пенициллина-стрептомицина (10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% NaCl, Sigma, Cat. № P0781) в контейнере при +4°С. Обработку глазных яблок осуществляли в стерильных условиях под ламинарным шкафом через 24-48 часов после смерти донора. Процедуру выделения РПЭ выполняли на льду, используя холодные растворы. Глазные яблоки помещали в чашку Петри диаметром 90-100 мм, содержащую раствор Хэнкса с антибиотиком (на 500 мл раствора Хэнкса 5 мл антибиотика). Стерильными ножницами освобождали глазные яблоки от окружающих тканей. Затем глазные яблоки промывали в спиртовом растворе с нисходящей концентрацией 70°, 50°, 30° в течение 1-2 мин при каждой концентрации перенося каждый раз в новую 50 мл-центрифужную пробирку. Далее для отмывки от спиртового раствора глазные яблоки помещали в раствор Хэнкса с антибиотиком и промывали 2-3 раза. В качестве антибиотика используют 100 U/ml пенициллина и 100 U/ml стрептомицина (10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% NaCl). После промывки глазные яблоки помещали в чашку Петри диаметром 90-100 мм, содержащую раствор Хэнкса с антибиотиком. Скальпелем протыкали склеру, отступив от радужки латеральнее на 0,5-0,7 см позади зубчатой линии, ориентиром которой при обычном освещении служит граница между темным и светлым участками. Склеру с подлежащими тканями разрезали офтальмологическими ножницами по окружности глазного яблока. Передний сегмент глаза удаляли. В заднем сегменте глаза пинцетом и препаровальной иглой отделяли нейральную сетчатку и стекловидное тело от РПЭ и удаляли, подрезая ножницами нейральную сетчатку в области зрительного нерва. Серологической пипеткой наполняли глазную чашу холодным раствором Хэнкса-ЭДТА и инкубировали 15-30 минут. В течение изоляционной процедуры глазные чаши находились на льду в растворе Хэнкса с антибиотиком. Клетки РПЭ собирали пипеткой с объемом наконечника 200µl. Контролируя процесс под бинокулярной лупой, наконечником проводили по слою и одновременно засасывали клетки, отделившиеся от мембраны Бруха. Способ забора ретинального ПЭ из глазной чаши взрослого человека с помощью 200µl наконечника облегчает процесс отделения клеток от мембраны Бруха и снижает процент потери клеток на этапе их выделения. Клетки вместе с раствором Хэнкса-ЭДТА (на 1 литр дистиллированной воды 9,5 г порошка Хэнкса, 3,75 г ЭДТА и 0,35 г. Бикарбоната натрия (4,7 мл 7,5% w/v) извлекали из глазной чаши, переносили в стерильную пробирку, содержащую ростовую среду для выделения, состоящую из 500 мл среды DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham, Sigma, Саl. № 06421, USA); 2 mM L-глутамина (Sigma, USA); 50 мл FBS (10%) (Fetal Bovine Serum, HyClone, USA); 5 мл раствора Пенициллина-стрептомицина (10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% NaCl, Sigma, Саt. № Р0781), пипетировали (механическая диссоциация клеток) и центрифугировали в течение 5-7 мин при 800 об/мин до осаждения клеток. Далее выделенные клетки РПЭ ресуспендировали в ростовой среде с высоким содержанием сыворотки, содержащей 500 мл среды DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham, Sigma, Cat. № D6421, USA); 2mM L-глутамина (Sigma, USA); 50 мл 20% FBS (HyClone, USA); добавку В27 (1:100, Invitrogen, USA); 20 нг/мл FGF-2 (Sigma, USA); 20нг/мл EGF (Sigma, USA); 2 мкг/мл гепарина (Sigma, USA); 5 мл раствора Пенициллина-стрептомицина (10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% Nad, Sigma, Саt. № Р0781). В зависимости от образовавшегося осадка клетки РПЭ из первого глазного яблока равномерно распределяли в 1-2 стерильных пластиковых флаконах площадью 25 см² и на поверхности 7 вкладышей в 24-луночных платах (Falcon, Greiner, Germany) для дальнейшей иммуноцитохимической (ИЦХ) оценки.

Процесс инкубирования проводили при 37°С, влажности воздуха 95%, в атмосфере 5% СО₂.

В таблице приведены различные условия выделения и инкубирования клеток РПЭ.

Предложенный способ характеризуется следующими примерами и иллюстрируется на фиг.1, фиг.2, фиг.3 и фиг.4.

Пример 1.

Культура РПЭ донора №1.

Мужчина, 50 лет. Диагноз: Отравление этиловым спиртом. Энуклеация глаз - время после смерти, часы: 24. Обработка глазных яблок - время после смерти, часы: 31.

Выделение клеток РПЭ из первого глазного яблока осуществляли следующим образом.

Клетки РПЭ были выделены из аутопсийного материала (глазных яблок), полученных из судебного морга от доноров с неизвестным офтальмологическим анамнезом. Энуклеацию глаз производили через 24 часа после смерти донора. Глазные яблоки доставляли в научную лабораторию в стерильной ростовой среде с антибиотиком для транспортировки глазных яблок, состоящей из 500 мл среды DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham, Sigma, Саt. № 06421, USA); 5 мл раствора Пенициллина-стрептомицина (10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% Nad, Sigma, Cat. № P078 1) в контейнере (в 50 мл-центрифужной пробирке) при +4°С. Обработку глазных яблок осуществляли в стерильных условиях под ламинарным шкафом через 31 час после смерти доноров. Процедуру выделения РПЭ выполняли на льду, используя холодные растворы. Глазные яблоки помещали в чашку Петри диаметром 90-100 мм, содержащую раствор Хэнкса с антибиотиком. Стерильными ножницами освобождали глазные яблоки от окружающих тканей. Затем глазные яблоки промывали спиртовым раствором с нисходящей концентрацией 70°, 50°, 30° в течение 1 мин при каждой концентрации, перенося каждый раз в новую 50-мл центрифужную пробирку. Далее для отмывки от спирта глазные яблоки помещали в раствор Хэнкса с антибиотиком и промывали 2 раза. После промывки глазные яблоки помещали в чашку Петри диаметром 90-100 мм, содержащую раствор Хэнкса с антибиотиком. Скальпелем протыкали склеру, отступив от радужки латеральнее на 0,5-0,7 см позади зубчатой линии, ориентиром которой при обычном освещении служит граница между темным и светлым участками. Склеру с подлежащими тканями разрезали офтальмологическими ножницами по окружности глазного яблока. Передний сегмент глаза удаляли. В заднем сегменте глаза пинцетом и препаровальной иглой отделяли нейральную сетчатку и стекловидное тело от РПЭ и удаляли, подрезая ножницами нейральную сетчатку в области зрительного нерва. Серологической пипеткой наполняли глазную чашу холодным раствором Хэнкса-ЭДТА и инкубировали 20 мин. В течение изоляционной процедуры глазные чаши находились на льду в растворе Хэнкса с антибиотиком. Клетки РПЭ собирали пипеткой с объемом наконечника 200µl. Контролируя процесс под бинокулярной лупой, наконечником проводили по слою и одновременно засасывали клетки, отделившиеся от мембраны Бруха. Клетки вместе с раствором Хэнкса-ЭДТА извлекали из глазной чаши, переносили в стерильную пробирку, содержащую ростовую среду для выделения, состоящую из 500 мл среды DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham, Sigma, Cat. № D6421, USA); 2mM L-глутамина (Sigma, USA); 50 мл FBS (10%) (Fetal Bovine Serum, HyClone, USA); 5 мл раствора Пенициллина-стрептомицина (10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% Nad, Sigma, Саt. № Р0781), пипетировали (механическая диссоциация клеток) и центрифугировали в течение 5 мин при 800 об/мин, до осаждения клеток.

Выделенные клетки РПЭ ресуспендировали в ростовой среде с высоким содержанием сыворотки, состоящей из 500 мл среды DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham, Sigma, Саt. № 6421, USA); 2mM L-глутамина (Sigma, USA); 20% FBS (HyClone, USA); добавка В27 (1:100, Invitrogen, USA); 20 нг/мл FGF-2 (Sigma, USA); 20 нг/мл EGF (Sigma, USA); 2 мкг/мл гепарина (Sigma, USA); 5 мл раствора Пенициллина-стрептомицина (10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% NaCl, Sigma, Саt. № Р0781). Культуры инкубировали при 37°С, влажности воздуха 95%, в атмосфере 5% СO₂.

Выделение клеток РПЭ из второго глазного яблока осуществляли так же, но с дополнением: на этапе инкубирования использовали трипсин 0,125% (Sigma, USA), инкубирование вели в течение 3 мин.

Свежевыделенные эксплантаты РПЭ из обоих глазных яблок состояли из небольших кластеров и единичных полигональной формы, крупных, сильно пигментированных эпителиоидных клеток,

Прикрепление кусочков и распластывание клеток РПЭ из первого глазного яблока наблюдалось уже на следующий день, тенденция клеток к образованию монослоя наблюдалось через 1 неделю от начала культивирования, а конфлюэнтный монослой был достигнут через 2 недели. Прикрепление и колониеобразование клеток РПЭ из второго глазного яблока отсрочивалось, по сравнению с первым глазным яблоком, на 3 дня, конфлюэнтная монослойная культура была образована через 1 месяц от начала инкубирования.

Замедление пролиферации клеток РПЭ из второго глазного яблока было связано с повреждающим действием трипсина.

Клетки РПЭ, полученные при выделении и ресуспендировании в ростовой среде с высоким содержание сыворотки из первого глазного яблока, были равномерно распределены на культуральной поверхности - в 2 стерильных пластиковых культуральных флаконах M1 и М2 площадью 25 см² каждый.

Клетки в M1 и М2 прикреплялись и начинали делиться и в течение 5 дней создавали сильно пигментированные первичные колонии. Распластанные крупные клетки делались плоскими и полигональными, с гранулами пигмента, собранными группками вокруг выступающего ядра, содержащего 1 или 2 ядрышка. Цитоплазма на периферии тонкая и относительно прозрачная с резко очерченными межклеточными границами. Делящиеся клетки становились мельче, депигментировались, некоторые из них приобретали веретенообразную форму.

Образование конфлюэнтного монослоя было достигнуто через 16 дней от распределения на культуральной поверхности (посадки). Через 5 дней после посадки в M1 и М2 была произведена первая смена среды. Аспирированная ростовая среда с M1 и М2 со всей взвесью, состоящей из неприкрепившихся клеток, так называемый «детрит», была распределена на свежей культуральной поверхности - перенесена в стерильные культуральные пластиковые флаконы М3 и М4, в которых через 3 дня после переноса отмечалось прикрепление клеток и образование колоний, а через 2 недели - рост колоний и образование конфлюэнтного монослоя. Через 3 дня после переноса удаленной ростовой среды в М3 и М4 была проведена смена среды. Удаляемая ростовая среда из М3 и М4 со всей взвесью, состоящей из неприкрепившихся клеток, была объединена и перенесена на новую свежую культуральную поверхность - в стерильный культуральный пластиковый флакон М5, в котором через 4 дня была проведена смена среды. В М5 отмечались большие пролиферирующие эпителиоподобные колонии, а через 17 дней - конфлюэнтный монослой. Таким образом, клетки РПЭ от момента их выделения, перенесенные в М5, находились без смены ростовой среды 12 дней, при этом они не только сохраняли свою жизнеспособность, но и прикреплялись к пластику, распластывались и пролиферировали.

На фиг.1 и фиг.2 приведены общие схемы инкубирования клеток РПЭ до достижения конфлюэнтного монослоя.

При подсчете клеток в камере Горяева количество клеток в конфлюэнтной культуре первого глаза составило: M1 ≈ 4 млн кл., М2 ≈ 4,2 млн кл., М3 ≈ 3,5 млн кл, М4 ≈ 3,2 млн кл, М5 ≈ 3 млн кл.

Таким образом, из первого глаза приблизительно через один месяц от начала инкубирования было получено ≈ 17,9 млн клеток

Пример 2.

Культура РПЭ донора №2.

Мужчина, 51 год. Диагноз: Отравление алкоголем. Энуклеации глаз - время после смерти, часы: 21. Обработка глазных яблок - время после смерти, часы: 26.

Выделение и ресуспендирование клеток РПЭ из первого глазного яблока осуществляли по примеру 1 для первого глазного яблока. Выделении РПЭ из второго глазного яблока осуществляли по примеру 1 для первого глазного яблока с ресуспендированием клеточного осадка в ростовой среде состава с низким содержанием сыворотки, состоящей из 500 мл среды DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham, Sigma, Cat. № D6421, USA); 2mM L-глутамина (Sigma, USA); 50 мл 10% FBS (HyClone, USA); 5 мл раствора Пенициллина-стрептомицина (10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% NaCl, Sigma, Саt. № Р0781).

Свежевыделенные эксплантаты РПЭ из обоих глазных яблок состояли из небольших кластеров и единичных полигональной формы, крупных сильно пигментированных эпителиоидных клеток. В результате выделения клеток РПЭ из первого глазного яблока прикрепление кусочков и распластывание клеток наблюдалась уже на следующий день, образование конфлюэнтного монослоя наблюдалось через 12 дней от начала инкубирования, а конфлюэнт был достигнут через 19 дней от посадки (фиг.3). В результате выделения клеток РПЭ из второго глазного яблока прикрепление и колониеобразование отсрочивалось, по сравнению с первым глазным яблоком, на 3 дня, конфлюэнтная монослойная культура была образована через 1,5 мес от начала инкубирования.

Пример 3.

Культура РПЭ донора №3.

Мужчина, 32 года. Диагноз: Кардиомиопатия. ОСН. Энуклеации глаз - время после смерти, часы: 25. Обработка глазных яблок - время после смерти, часы; первый глаз - 28, второй глаз - 48.

Выделение РПЭ из первого и второго глазных яблок осуществляли способом, описанным в примере 1, с ресуспендированием клеточного осадка в ростовой среде с высоким содержанием сыворотки. Свежевыделенные эксплантаты РПЭ из обоих глазных яблок состояли из небольших кластеров и единичных полигональной формы, крупных сильно пигментированных эпителиоидных клеток. Прикрепление кусочков и распластывание клеток РПЭ из обоих глазных яблок наблюдалось уже на следующий день. Клетки РПЭ из обоих глазных яблок начинали делиться и создавали сильно пигментированные первичные колонии в течение 3-5 дней после прикрепления к пластику. Распластанные крупные клетки делались плоскими и полигональными, с гранулами пигмента, собранными группками вокруг выступающего ядра. Делящиеся клетки становились мельче, депигментировались.

Тенденция клеток к достижению конфлюэнтного монослоя из обоих глазных яблок наблюдалась через 1 неделю от начала посадки, а конфлюэнтный монослой был достигнут из первого глазного яблока - через 14 дней от посадки, из второго глазного яблока - через 10 дней от посадки.

Клетки РПЭ из второго глазного яблока были неравномерно распределены в двух стерильных культуральных пластиковых флаконах площадью 25 см² каждый: в первый флакон было высажено основное количество клеток, во второй флакон - небольшое количество клеток, примерно составившее 1/10 часть от количества клеток, высаженных в первый флакон. В первом флаконе клеточная культура носила эпителиоподобный характер, эпителиальные клетки располагались по типу «булыжной мостовой». Во втором флаконе с изначально небольшим количеством клеток прикрепление и колониеобразование отсрочивалось, по сравнению с клетками в первом флаконе, на 6 дней, конфлюэнтная культура была образована через 20 дней от начала инкубирования. Причем в культуре преобладали клетки веретенообразной формы, образующие на поверхности сфероподобные структуры (фиг.4).

Таким образом, выход клеток в монослойную культуру зависит также от плотности посадки во флаконы.

Известно, что плотность колоний достигает до 25-50% культуральной поверхности в течение 14-28 дней.

По предлагаемому изобретению плотность колоний достигает 75-90% культуральной поверхности в течение 14-20 дней.

Способ позволяет достичь прикрепления популяции клеток с низкими адгезивными свойствами, это обеспечивает более быструю пролиферацию клеток, получение достаточного количества клеток на первичном этапе и получение популяции клеток с менее дифференцированными свойствами. Таким образом, предложенный способ позволяет получить большое количество жизнеспособных дедифференцированных клеток ретинального пигментного эпителия.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению дедифференцированных клеток ретинального пигментного эпителия глаза взрослого человека, и может быть использовано в нейробиологии и офтальмологии. Энуклиируют глазное яблоко при аутопсии, промывают его в спиртовом растворе и в растворе Хенкса без Са²⁺, Mg²⁺ с антибиотиком, удаляют по зубчатой линии передний сегмент глазного яблока, отделяют стекловидное тело и нейральную сетчатку от пигментного эпителия, наполняют глазную чашу раствором Хенкса без Са²⁺, Mg²⁺ с ЭДТА и инкубируют клетки ретинального пигментного эпителия в течение 15-30 мин, полученные клетки собирают пипеткой и переносят в стерильную среду для выделения, пипетируют, центрифугируют, выделенные клетки ресуспендируют в ростовой среде с высоким содержанием сыворотки, затем полученную суспензию клеток ретинального пигментного эпителия распределяют на культуральной поверхности и культивируют до достижения прикрепившимися клетками 15-25% ее площади, суспензию с неприкрепившимися клетками аспирируют, распределяют на свежей культуральной поверхности и культивируют, а к прикрепившимся клеткам добавляют ростовую среду с высоким содержанием сыворотки и культивируют до достижения конфлюэнтного монослоя целевого продукта. Изобретение позволяет исключить повреждающее действия ферментов и достичь прикрепления на культуральной поверхности популяции клеток с более низкими адгезивными свойствами. 12 з.п. ф-лы, 4 ил., 1 табл.

1. Способ получения дедифференцированных клеток ретинального пигментного эпителия глаза взрослого человека, характеризующийся тем, что энуклиируют глазное яблоко при аутопсии, промывают его в спиртовом растворе последовательно при концентрациях 70°, 50°, 30° и в растворе Хенкса без Са²⁺, Mg²⁺ с антибиотиком, удаляют по зубчатой линии передний сегмент глазного яблока, отделяют стекловидное тело и нейральную сетчатку от пигментного эпителия, наполняют глазную чашу раствором Хенкса без Са²⁺, Mg²⁺ с ЭДТА и инкубируют клетки ретинального пигментного эпителия в течение 15-30 мин, полученные клетки собирают пипеткой и переносят в стерильную среду для выделения, состоящую из среды DMEM/F12 в соотношении 1:1, 2 мМ L-глютамина, 10% FBS, раствора антибиотика, пипетируют, центрифугируют в течение 5-7 мин при скорости 800 об/мин, выделенные клетки ресуспендируют в ростовой среде с высоким содержанием сыворотки, состоящей из среды DMEM/F12 в соотношении 1:1, 2 мМ L-глютамина, 20% FBS, добавки В27 (1:100), 20 нг/мл FGF-2, 20 нг/мл EGF, 2 мкг/мл гепарина, раствора антибиотика, затем полученную суспензию клеток ретинального пигментного эпителия распределяют на культуральной поверхности и культивируют до достижения прикрепившимися клетками 15-25% ее площади, суспензию с неприкрепившимися клетками аспирируют, распределяют на свежей культуральной поверхности и культивируют, а к прикрепившимся клеткам добавляют ростовую среду с высоким содержанием сыворотки и культивируют до достижения конфлюэнтного монослоя целевого продукта, причем распределение суспензии клеток на свежую культуральную поверхность и культивирование проводят неоднократно до прекращения прикрепления клеток ретинального пигментного эпителия на культуральной поверхности.

2. Способ по п.1, характеризующийся тем, что энуклиирование глазного яблока проводят в период времени до 24 ч после смерти донора.

3. Способ по п.1, характеризующийся тем, что глазное яблоко промывают в спиртовом растворе в течение 1-2 мин при каждой концентрации.

4. Способ по п.1, характеризующийся тем, что глазное яблоко промывают от спиртового раствора в растворе Хенкса без Са²⁺, Mg²⁺ с антибиотиком 2-3 раза.

5. Способ по п.1, характеризующийся тем, что в качестве антибиотика используют 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (10000 Ед пеницилин и 10 мг стрептомицин на мл в 0.9% NaCl).

6. Способ по п.1, характеризующийся тем, что зубчатую линию определяют по границе между темным и светлым участком.

7. Способ по п.1, характеризующийся тем, что отделяют стекловидное тело и нейральную сетчатку от пигментного эпителия, подрезая нейральную сетчатку в области зрительного нерва.

8. Способ по п.1, характеризующийся тем, что раствор Хенкса без Са²⁺ Mg²⁺ содержит 3,75 г/л ЭДТА.

9. Способ по п.1, характеризующийся тем, что клетки ретинального пигментного эпителия в глазной чаше инкубируют с раствором Хенкса без Са²⁺, Mg²⁺ с ЭДТА в течение 15-30 мин.

10. Способ по п.1, характеризующийся тем, что полученные клетки ретинального пигментного эпителия собирают пипеткой с объемом наконечника 200 мкл.

11. Способ по п.1, характеризующийся тем, что выделение клеток ретинального пигментного эпителия проводят при пониженной температуре на льду.

12. Способ по п.1, характеризующийся тем, что процесс культивирования проводят при 37°С, влажности воздуха 95%, в атмосфере 5% СО₂.

13. Способ по п.1, характеризующийся тем, что клетки ретинального пигментного эпителия по мере необходимости подвергают иммуноцитохимической оценке.