СПОСОБ КОНКУРЕНТНОГО ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНТНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИГЕНОВ Российский патент 1995 года по МПК G01N33/53 G01N33/533 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для определения биологически активных веществ с использованием в качестве маркера флуоресцентных меток.

Сущность конкурентного метода заключается в следующем. Используют меченый антиген, идентичный тому, который определяют в исследуемом препарате, и антисыворотку против данного антигена. В раствор, содержащий известное количество меченого антигена и недостаток по отношению к этому количеству специфических антител, добавляют раствор определяемого антигена. В результате конкуренции за связанные с находящимися в недостатке антителами доля меченых антигенов в составе иммунных комплексов понижается при увеличении содержания в растворе определяемого антигена. После установления в системе равновесия образовавшиеся иммунные комплекcы отделяют от cвободных компонентов одним из стандартных методов и измеряют флуоресценцию раствора или осадка. Количество исследуемого антигена определяют по калибровочной кривой.

Наиболее близким к предлагаемому методу является конкурентный твердофазный способ проведения иммунофлуоресцентного анализа (ИФА), согласно которому антитела против определяемого антигена адсорбционно иммобилизуют на поверхности водонерастворимого полимерного носителя (например, из полистирола, поливинилхлорида и т.д.) путем инкубации носителя в течение 2 ч в растворе антител с последующей отмывкой несвязавшихся антител. Полученный носитель обрабатывают раствором, содержащим некоторое избыточное по отношению к антителам фиксированное количество определяемого антигена, меченного флуоресцентной меткой, например флуоресцеинизотиоцианатом, и неизвестное количество определяемого антигена, инкубируют в течение 1-24 ч (время установления равновесия в системе, которое зависит от природы антигена, концентрации компонентов, температуры, перемешивания и т.п.). Образующийся иммунный комплекс отделяют от растворимых компонентов реакции и многократно промывают водой для удаления несвязывающихся с носителем меченых и немеченых антигенов. Регистрируют флуоресцентный сигнал меченого соединения непосредственно с твердой поверхностью или предварительно переводя меченый компонент в раствор, десорбируя метку с поверхности носителя и определяя интенсивность флуоресценции раствора. В результате конкуренции между меченым и немеченым антигеном за связывание с активными центрами антител на полимерном носителе увеличение содержания немеченого антигена в образце приводит к уменьшению интенсивности флуоресценции.

Основными недостатками метода являются его многостадийность и длительность. Проведение анализа в несколько стадий, включающих разделение иммуносорбента и жидкой фазы, промывку и последующий перевод метки в раствор, приводит к методическому усложнению способа и увеличению продолжительности анализа, снижает его точность из-за вероятности случайных ошибок и возможной десорбции меченого компонента с иммуносорбента, делает чрезвычайно трудной возможность полной автоматизации анализа. Для обеспечения максимальной чувствительности и воспроизводимости анализ следует проводить в равновесном режиме. Для определения времени достижения равновесия в системе, которое зависит прежде всего от природы антигена, необходимо в каждом конкретном случае провести серию дополнительных экспериментов с различными периодами инкубации реагентов, что приводит как к увеличению продолжительности анализа, так и непроизводительному расходу реагентов.

Кроме того, так как анализ является гетерогенным, то ввиду наличия диффузионных затруднений при взаимодействии антигена с иммобилизованными на твердом носителе антителами, время установления равновесия в системе составляет обычно несколько часов. Поэтому сам анализ является длительным и занимает несколько часов.

Предлагаетcя способ проведения флуоресцентного иммуноанализа, предусматривающий иммобилизацию антител и обработку их меченым антигеном в присутствии определяемого антигена, иммобилизацию и обработку ведут в проточном режиме с использованием проточной флуориметрической кюветы с длиной оптического пути (толщиной) 0,005-0,1 мм.

Анализ осуществляют следующим образом.

Через проточную флуориметрическую кварцевую кювету с длиной оптического пути 0,005-0,1 мм последовательно пропускают раствор специфических антител против определяемого антигена, буферный раствор и раствор, содержащий меченный флуоресцентной меткой определяемый антиген и свободный антиген, со скоростью не менее 0,3 мл/мин. Измеряют максимальную величину интенсивности флуоресценции, по величине которой по стандартной кривой рассчитывают искомую концентрацию определяемого антигена в растворе.

На первой стадии при прокачивании раствора антител через кювету происходит их адсорбционная иммобилизация на внутренних стенках кюветы. В качестве материала стенок кюветы могут быть использованы кварц, полистирол, поливинилтолуол или другие полимерные материалы. При прокачивании через кювету раствора с анализируемым и меченым образцом происходит сорбция меченого антигена на стенках кюветы, сопровождающаяся увеличением сигнала флуоресценции с поверхности кюветы. Так как толщина кюветы относительно мала (0,005-0,1 мм), а в объем проточной кюветы непрерывно вводятся новые порции меченого антигена с постоянной концентрацией, то сигнал, обусловленный меткой в растворе, будет постоянен и относительно мал (интенсивность флуоресценции пропорцио- нальна толщине слоя, через который проходит возбуждающий свет, а ее можно сделать относительно малой). С другой стороны, благодаря взаимодействию меченого антигена с антителами на поверхности стенок кюветы происходит постоянное накопление меченого антигена на стенках кюветы, приводящее к возрастанию интенсивности флуоресценции во времени. При толщине кюветы не больше 0,1 мм фоновый сигнал (соответствующий интенсивности флуоресценции в начальный момент времени и обусловленный меченым антигеном, находящимся в объеме кюветы) будет значительно меньше сигнала, обусловленного меченым антигеном, связанным на поверхности кюветы с антигеном.

Выбор интервала толщины кюветы 0,005-0,1 мм обусловлен следующими причинами. При работе кюветы общий сигнал флуоресценции складывается из двух составляющих сигнала флуоресценции от адсорбированного на стенках кюветы меченого препарата и сигнала от меченого препарата, находящегося в растворе, причем последний сигнал тем меньше, чем меньше толщина кюветы. Так, например, в случае анализа белков расчет показывает, что при размерах кюветы 10 мм х 10 мм х 0,01 мм объем кюветы составляет 1 мкл, поэтому при концентрации анализируемого белкового препарата 1-10 мкг/мл в объеме кюветы постоянно находится 1-10 нг вещества, что значительно меньше максимальной удельной адсорбционной емкости поверхности кюветы (которая, например, в случае кварца или полистирола составляет ≈500 нг белка на см²).

Использование кюветы с толщиной более 0,1 мм нецелесообразно, так как, во-первых, при больших концентрациях определяемого антигена сигнал, обусловленный меткой в растворе, становится сравнимым или больше сигнала адсорбиро- ванного меченого антигена, во-вторых, скорость взаимодействия меченого соединения с антителами сильно замедляется вследствие образования диффузионных ограничений при взаимодействии антигена из раствора с иммобилизованными на поверхности антителами.

Значение нижней границы толщины кюветы 0,005 мм обусловлено необходимостью создания большого давления насоса для прокачивания раствора через проточную кювету и уменьшением скорости прокачивания раствора через кювету при постоянном давлении перистальтического насоса.

Проведение стадий иммобилизации и обработки в проточном режиме позволяет существенно упростить методику проведения анализа. Несколько отдельных стадий (инкубацию носителя с антителами, промывку, инкубацию с определяемым и меченым антигеном, промывку) заменяют простым прокачиванием соответствующих растворов через кювету. Использование проточной кюветы с толщиной, не превышающей 0,1 мм, позволяет, во-первых, существенно снизить время установления равновесия в иммунохимической реакции (до нескольких минут), так как при прокачивании раствора через кювету происходит интенсивное перемешивание раствора и снижаются диффузионные затруднения реакции, во-вторых, осуществлять непрерывную регистрацию кинетики накопления меченого соединения на стенках кюветы, так как ввиду малой толщины кюветы сигнал, обусловленный меткой в растворе, значительно меньше сигнала флуоресцентно меченного соединения, непосредственно связанного с твердой фазой.

Таким образом, весь процесс определения сводится к прокачиванию раствора реагентов через проточную кювету флуориметра и непрерывной регистрации интенсивности флуоресценции в той же реакционной ячейке.

Необходимо отметить, что кювета может быть как многоразового использования, так и одноразового. Кювета многоразового использования изготавливается из кислотостойкого материала, например кварца, и подвергается промывке кислотой для восстановления адсорбционных свойств, кювета одноразового использования может быть изготовлена из полимеров, например из полистирола. В варианте сменной кюветы одноразового использования возможна предварительная адсорбция соответствующих специфических антител на стенках кюветы. В таком случае определение антигена в анализируемой жидкости осуществляется в одну стадию путем введения анализируемой пробы в раствор в присутствии меченого антигена.

Предложенный подход является универсальным и может быть применен для проведения анализа не только по конкурентной схеме, но и другим, в том числе в сандвич-варианте анализа поливалентных антигенов при использовании флуоресцентно меченых антител. Анализ в этом случае также можно осуществить в одну стадию без разделения реагентов путем введения в кювету анализируемого образца и флуоресцентно меченных антител и последующей непрерывной регистрацией кинетики комплексообразования меченых антител с антигенами, специфически адсорбированными на поверхности иммуносорбента.

Источник света и фотоэлектрический умножитель в флуориметре могут располагаться как по одну сторону от одной из плоскостей кюветного отделения (например, под углом 90^о), так и по разные стороны (например, под углом 270^о), что позволяет при использовании светодиодов, фотодиодов и микропроцессорной техники проводить одновременные измерения в нескольких ячейках на различные антигены.

Таким образом, основным отличительным признаком предлагаемого способа является осуществление иммобилизации и обработки антителами, определяемым и меченым антигеном в проточной системе путем пропускания растворов через проточную кювету толщиной 0,005 мм 0,1 мм.

Использование тонкослойной проточной кюветы обеспечивает достижение технического результата, который сводится к уменьшению числа стадий до одной и сокращению времени проведения анализа.

П р и м е р 1. Получение стандартной кривой определения IgG человека с использованием флуоресцеиновой метки.

Для адсорбции антител к IgG человека на стенках кюветы через проточную кювету флуориметра толщиной 0,16 мм прокачивают 1 мл раствора антител кролика против IgG человека в ФБС (0,05 М фосфатный буфер, рН 7,2, 0,14 М NaCl). Концентрация IgG составляет 10 мкг/мл, скорость прокачивания 20 мл/ч. Для промывки кюветы прокачивают 1 мл ФБС.

Через кювету пропускают раствор 1 мл ФБС, содержащего меченный флуоресцеином IgG человека (концентрация 3 ˙ 10^-8 М) и стандартную концентрацию IgG человека. Измеряют максимальную интенсивность флуоресценции.

Строят стандартную кривую зависимости наблюдаемой максимальной интенсивности флуоресценции от концентрации IgG человека в образце.

П р и м е р 2. Определение концентрации IgG в растворе с использованием меченного флуоресцеином антигена.

Для определения концентрации IgG человека в образце к 0,8 мл фосфатного буфера (0,1 М, рН 7,2, 0,3 М NaCl), содержащего меченный флуоресцеином IgG человека (концентрация 3 ˙ 10^-8 М) добавляют 0,2 мл раствора IgG человека (с концентрацией 120 нМ, полученной путем разбавления раствора со стандартной концентрацией, определенной по оптической плотности), 1 мл полученного раствора пропускают через кювету согласно примеру 1. Концентрация IgG, определенная по калибровочной кривой, составляет 115 нМ.

Кювету отмывают 2% -ным раствором бихромата калия в серной кислоте. Повторяют иммобилизацию антител и определение IgG в том же растворе. Коэффициент вариации результатов, определенный для одной серии определений, составляет 10-15%
П р и м е р 3. Определение концентрации тироксина в растворе.

На стенках проточной кюветы толщиной 0,01 мм иммобилизуют антитела кролика против тироксина согласно примеру 1. Через кювету пропускают 1 мл ФБС, содержащего меченный флуоресцеином тироксин в концентрации 10^-8 М и стандартную концентрацию тироксина. Строят стандартную кривую зависимости наблюдаемой максимальной интенсивности флуоресценции от концентрации тироксина в образце.

Для определения содержания тироксина в неизвестном образце сыворотки крови 0,2 мл образца добавляют к 0,8 мл фосфатного буфера, содержащего меченый тироксин в концентрации 10^-8 (0,06 М, рН 7,2, 0,18 М NaCl) и 1 мл полученного раствора пропускают через проточную кювету. Измеряют максимальную интенсивность флуоресценции (через интервал времени ≈2 мин), концентрацию рассчитывают по стандартной кривой. Коэффициент вариации результатов анализа для одной серии измерений ≈15%
П р и м е р 4. Определение концентрации инсулина.

На стенках проточной кюветы толщиной 0,02 мм иммобилизуют антитела кролика против инсулина согласно примеру 1. Через кювету пропускают 1 мл раствора, содержащего меченный флуоресцеином инсулин в концентрации 2 ˙ 10^-8 М и стандартную концентрацию свободного инсулина. Строят стандартную кривую зависимости наблюдаемой максимальной интенсивности флуоресценции (через промежуток времени 2 мин) от концентрации инсулина в образце.

Для определения содержания инсулина в неизвестном образце 0,2 мл образца добавляют к 0,8 мл фосфатного буфера, содержащего меченый инсулин в концентрации 2 ˙ 10^-8 М (0,06 М, рН 7,2, 0,18 М NaCl) и 1 мл полученного раствора пропускают через проточную кювету. Измеряют максимальную интенсивность флуоресценции (через интервал времени ≈2 мин), концентрацию рассчитывают по стандартной кривой. Коэффициент вариации результатов анализа ≈15
П р и м е р 5. Определение IgG человека с использованием меченного родамином В антигена.

На стенках проточной флуориметрической кюветы толщиной 0,01 мм иммобилизуют согласно примеру 1 антитела кролика против IgG человека. Через кювету пропускают раствор 1 мл ФБС, содержащего меченный родамином В IgG человека (концентрация 3 ˙ 10^-8 М) и стандартную концентрацию IgG человека. Измеряют интенсивность флуоресценции во времени (длина волны возбуждения 550 нм, длина волны испускания 585 нм).

Строят стандартную кривую зависимости наблюдаемой максимальной интенсивности флуоресценции от концентрации IgG человека в образце.

Для определения неизвестной концентрации IgG человека в образце к 0,8 мл фосфатного буфера (0,1 М, рН 7,2, 0,18М NaCl), содержащего меченный родамином В IgG человека, добавляют 0,2 мл раствора IgG человека (с концентрацией 120 нМ, полученной путем разбавления раствора со стандартной концентрацией, определенной по оптической плотности). 1 мл полученного раствора пропускают через кювету, обработанную раствором антител против IgG человека согласно примеру 1. Концентрация раствора IgG, определенная по калибровочной кривой, составляет 110 нМ.

Кювету отмывают 2%-ным раствором бихромата калия в серной кислоте и промывают буфером. Повторяют иммобилизацию антител и определение IgG в том же растворе. Коэффициент вариации результатов для одной серии определений составляет 10-15%
П р и м е р 6. Определение IgG с использованием дансильной метки.

На стенках проточной флуориметрической кюветы толщиной 0,01 мм иммобилизуют согласно примеру 1 антитела кролика против IgG человека. Через кювету пропускают раствор 1 мл ФБС, содержащего меченный диметиламинонафталин-5-сульфо- нилхлоридом (ДАНС) IgG человека (концентрация 5 ˙ 10^-8 М), и стандартную концентрацию IgG человека. Измеряют интенсивность флуоресценции во времени (длина волны возбуждения 360 нм, длина волны испускания 514 нм).

Строят стандартную кривую зависимости наблюдаемой максимальной интенсивности флуоресценции от концентрации IgG человека в образце.

Для определения неизвестной концентрации IgG человека в образце к 0,8 мл фосфатного буфера (0,1 М, рН 7,2, 0,18М NaCl), содержащего данс-IgG человека, добавляют 0,2 мл раствора IgG человека, концентрацию которого необходимо определить. 1 мл полученного раствора пропускают через кювету, обработанную согласно примеру 1. По калибровочной кривой определяют неизвестную концентрацию раствора.

Кювету отмывают 2%-ным раствором бихромата калия в серной кислоте. Повторяют иммобилизацию антител и определение IgG в том же растворе. Коэффициент вариации результатов для одной серии определений составляет 10-15%
Таким образом, предлагаемый метод может быть использован для количественного определения как низкомолекулярных соединений (гаптенов), так и высокомолекулярных, в том числе белков, гормонов, стероидов и т.д.

Предложенный метод приводит к существенному упрощению иммунофлуоресцентного анализа, сокращению числа его стадий, времени проведения. Метод может быть использован и в научном эксперименте для наблюдения за ходом протекания реакции антиген-антитело без какого-либо возмущающего воздействия на компоненты иммунохимической системы с целью изучения кинетических и термодинамических параметров, характеризующих лиганд-рецеп- торные взаимодействия. На основе предложенного метода могут быть созданы коммерческие наборы реагентов, позволяющие осуществлять иммунофлуоресцентный анализ в автоматическом режиме, что приведет к значительному удешевлению стоимости проведения единичного анализа.

Использование: иммунобиотехнология, определение биологически активных веществ с использованием в качестве маркера флуоресцентных меток. Сущность изобретения: разработка флуоресцентного иммуноанализа, предусматривающая иммобилизацию антител и обработку их меченым антигеном в присутствии определяемого антигена, причем иммобилизацию антител и обработку ведут в проточном режиме с использованием флуориметрической кюветы с длиной оптического пути 0,005 0,1 мм. Коэффициент вариации результатов анализа составляет 10 15%

СПОСОБ КОНКУРЕНТНОГО ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНТНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИГЕНОВ, предусматривающий иммобилизацию специфических антител на твердой фазе, обработку их известным количеством флуоресцентно-меченого определяемого антигена и регистрацию интенсивности флуоресценции на твердой фазе, отличающийся тем, что иммобилизацию антител и обработку их антигеном осуществляют в проточной системе путем пропускания антител и антигена через флуориметрическую кювету с длиной оптического пути 0,005 0,1 мм, при этом обработку иммобилизованных антител и регистрацию интенсивности флуоресценции на твердой фазе осуществляют одновременно.