СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ Российский патент 1997 года по МПК G01N33/535 

Изобретение относится к области иммунохимии, точнее к способам поточно-инжекционного иммунохемилюминесцентного определения биологически активных веществ с использованием в качестве маркера пероксидазы хрена и реакции усиленной хемилюминесценции для регистрации каталитической активности пероксидазы.

Описано несколько различных вариантов проведения проточно-инжекционного твердофазного иммуноферментного анализа, в том числе конкурентный, сандвич-метод и др. Суть конкурентного метода заключается в следующем. Используют меченный ферментом антиген, идентичный тому, который определяют в исследуемом препарате, и антисыворотку против данного антигена. Раствор, содержащий известное количество меченого антигена и неизвестное количество определяемого антигена, вводят в контакт с иммобилизованными на твердом носителе антителами, находящимися в недостатке по отношению к антигену. В результате конкуренции за связывание с антителами доля меченых антигенов в составе иммунных комплексов на носителе понижается при увеличении содержания в растворе определяемого антигена. После установления в системе равновесия между реагирующими компонентами в растворе и на носителе образовавшиеся иммунные комплексы отделяют от свободных компонентов и измеряют ферментативную активность на носителе. Количество исследуемого антигена определяют по калибровочной кривой.

В сандвич-варианте к иммуносорбенту добавляют исследуемый раствор, после инкубации непрореагировавшие компоненты отделяют от иммуносорбента, промывают его и образовавшиеся специфические иммунокомплексы выявляют путем инкубации с раствором меченных ферментом антител с последующей промывкой и регистрацией количества меченого соединения, связанного с иммуносорбентом, путем измерения ферментативной активности на носителе.

Общим недостатком всех этих методов является длительность анализа, составляющая несколько десятков минут, обусловленная проведением анализа в несколько стадий, и значительным временем установления равновесия в гетерогенной системе, когда один из реагирующих компонентов иммобилизован на носителе, а другой находится в растворе.

Наиболее близким к заявляемому является твердофазный способ проведения проточно-инжекционного иммуноферментного анализа. Согласно способу-прототипу антитела против определяемого антигена адсорбционно иммобилизуют на поверхности водонерастворимого полимерного носителя (полистирольного шарика) путем инкубации носителя в течение 2 ч в растворе антител с последующей отмывкой несвязавшихся антител. Полученный носитель помещают в специальную проточную реакционную ячейку, через которую последовательно пропускают раствор определяемого антигена, буферный раствор и раствор конъюгата специфических антител, меченных пероксидазой. При достижении в проточной системе образцом или реакционным компонентом ячейки с полистирольным шариком поток останавливают на определенный промежуток времени от нескольких минут до десятков минут.

Время установления равновесия между реагирующими компонентами из раствора и иммобилизованными на поверхности полистирольного шарика на каждой стадии в такой системе составляет величину более 1 ч. Для сокращения времени анализа проводят определение в кинетическом режиме, уменьшая время инкубации на каждой стадии до нескольких минут. Для увеличения чувствительности регистрации ферментативной метки на носителе используют реакцию усиленной химилюминесценции (катализируемое пероксидазой окисление перекисью водорода люминола в присутствии усилителя, п-йодфенола, сопровождающееся свечением), позволяющую повысить предел обнаружения фермента по крайней мере на два порядка по сравнению с фотометрическим методом слежения за активностью фермента. После отмывки буферным потоком шарик с иммобилизованным иммунокомплексом, содержащим пероксидазную метку, переносят в кювету люминометра и измеряют максимальную интенсивность хемилюминесценции, величина которой была пропорциональна определяемой концентрации антигена.

Проведение анализа в несколько стадий, включающих разделение иммуносорбента и жидкой фазы, промывку и последующий перенос носителя в кювету люминометра, приводит к методическому усложнению способа и увеличению продолжительности анализа, снижает его точность из-за вероятности случайных ошибок и возможной десорбции меченого компонента с иммуносорбента, затрудняет полную автоматизацию анализа. Для обеспечения максимальной чувствительности и воспроизводимости анализ следует проводить в равновесном режиме. Для определения времени достижения равновесия в системе, которое зависит прежде всего от природы антигена, необходимо в каждом конкретном случае провести серию дополнительных экспериментов с различными периодами инкубации реагентов, что приводит как к увеличению продолжительности анализа, так и непроизводительному расходу реагентов.

Кроме того, так как анализ является гетерогенным, то ввиду наличия диффузионных затруднений при взаимодействии антигена из раствора с иммобилизованными на твердом носителе антителами, время установления равновесия в системе составляет обычно несколько часов. Поэтому сам анализ является длительным и занимает по продолжительности также несколько часов. Перевод реакции на каждой из стадий в кинетический режим (сокращение времени инкубации) приводит при выигрыше во времени всего анализа к уменьшению абсолютного количества иммунокомплекса, образующегося на твердой фазе, и, как следствие, потере чувствительности, воспроизводимости и точности результатов анализа.

Предлагается способ поточно-инжекционного хемилюминесцентного иммуноанализа, предусматривающий иммобилизацию антител на прозрачной полимерной пленке, последовательную обработку ее специфическими антителами против определяемого антигена и субстратным раствором и регистрацию интенсивности хемилюминесценции непосредственно с поверхности прозрачной полимерной пленки в проточной узкой кювете, при этом обработку ведут в проточном режиме с использованием проточной кюветы с толщиной 0,005 0,1 мм.

Анализ осуществляют следующим образом. Через проточную кювету толщиной 0,005 0,1 мм, одна из стенок которой представляет прозрачную пленку с предварительно иммобилизованными на ней специфическими антителами против определяемого антигена, расположенную в непосредственной близости от окошка фотоэлектрического умножителя (см. фиг.1), последовательно пропускают порцию раствора определяемого антигена, буферный раствор, раствор конъюгата специфических антител с пероксидазой, буферный раствор и раствор субстрата пероксидазы со скоростью не менее 0,3 мл/мин. Измеряют величину интенсивности хемилюминесценции, по величине которой по стандартной кривой рассчитывают искомую концентрацию определяемого антигена в растворе.

Предварительную иммобилизацию антител на поверхности полимерной пленки можно проводить прокачиванием раствора антител через кювету, при этом происходит их адсорбционная иммобилизация на полимерной пленке, являющейся внутренней стенкой кюветы, либо инкубацией пленки в растворе антител. В качестве материала полимерной пленки может быть использован полистирол, поливинилтолуол или другие полимерные материалы, обладающие хорошими сорбционными по отношению к белкам свойствами.

При последовательном прокачивании через кювету растворов с анализируемым образцом и конъюгатом антител с ферментом происходит образование специфических иммунокомплексов на поверхности полимерной пленки и последующее взаимодействие меченных пероксидазой антител с образовавшимися иммунокомплексами на внутренней поверхности полимерной пленки. При дальнейшем прокачивании через кювету буферного раствора происходит отмывка несвязавшихся компонентов, и при пропускании раствора субстрата наблюдается регистрируемая фотоэлектрическим умножителем хемилюминесценция, интенсивность которой пропорциональна количеству сорбированной на пленке ферментной метки.

Выбор интервала толщины кюветы 0,005 0,1 мм обусловлен быстрым временем установления равновесия между реагирующими компонентами в такой системе (порядка одной трех минут), а также следующими причинами. Использование кюветы с толщиной более 0,5 мм нецелесообразно, так как скорость взаимодействия меченого соединения с антителами сильно замедляется вследствие возникновения диффузионных ограничений при взаимодействии антигена из раствора с иммобилизованными на поверхности антителами.

Значение нижней границы толщины кюветы 0,005 мм обусловлено необходимостью создания большого давления перистальтического насоса для прокачивания раствора через проточную кювету и уменьшением скорости прокачивания раствора через кювету при постоянном давлении, создаваемом насосом.

Проведение стадии обработки пленки в проточном режиме позволяет существенно упростить методику проведения анализа. Несколько отдельных стадий (инкубацию носителя с определяемым антигеном и мечеными антителами, промывку) заменяется простым прокачиванием соответствующих растворов через кювету. Использование проточной кюветы с толщиной, не превышающей 0,1 мм, позволяет, во-первых, существенно снизить время установления равновесия в иммунохимической реакции (до нескольких минут), так как при прокачивании раствора через кювету происходит уменьшение толщины неперемешивающегося слоя, существующего вблизи поверхности твердого носителя, омываемого жидкостью, и интенсивное перемешивание раствора, что приводит к резкому снижению диффузионных затруднений реакции, во-вторых, осуществлять простую непосредственную регистрацию кинетики накопления меченого соединения на полимерной пленке-стенке кюветы без дополнительного механического перемещения носителя в кювету люминометра, так как измерение хемилюминесценции проводится непосредственно с поверхности пленки в кювете при прокачивании раствора субстратов.

Таким образом, весь процесс определения сводится к прокачиванию анализируемого раствора и раствора меченных пероксидазой антител через проточную кювету и последующей регистрации интенсивности хемилюминесценции с внутренней поверхности стенки кюветы в той же реакционной ячейке.

Необходимо отметить, что кювета может быть как многоразового использования, так и одноразового. Кювета многоразового использования может быть регенерирована, например, промывкой кислотой для удаления сорбированных белков с последующей повторной адсорбцией антител в потоке на полимерной пленке из раствора. Кювета одноразового использования может быть изготовлена из полимеров, например из полистирола. В варианте сменной кюветы одноразового использования возможна предварительная адсорбция соответствующих специфических антител на стенках кюветы.

Предложенный подход является универсальным и может быть применен для проведения анализа как по сэндвич-схеме, так и в конкурентном варианте анализа одновалентных антигенов при использовании меченных пероксидазой антигенов. Анализ в этом случае также можно осуществить в одну стадию без разделения реагентов путем введения в кювету анализируемого образца и конъюгата антигена с пероксидазой с последующей регистрации кинетики комплексообразования меченых антигенов с антителами, сорбированными на поверхности полимерной пленки.

При использовании светодиодов, фотодиодов и микропроцессорной техники возможно создание установки, позволяющей проводить одновременные измерения в нескольких ячейках на различные антигены.

Таким образом, основным отличительным признаком предлагаемого способа является осуществление обработки определяемым антигеном и мечеными антителами (или антигенами) в проточной системе путем пропускания растворов через поточную кювету толщиной 0,005 0,1 мм с полимерной прозрачной пленкой с иммобилизованными на ней антителами, расположенной вблизи фотоумножителя.

Использование тонкослойной проточной кюветы со стенкой из полимерной прозрачной пленки, располагаемой вблизи фотоумножителя, обеспечивает достижение положительного эффекта, который сводится к уменьшению числа стадий до одной и сокращению времени проведения анализа до нескольких минут. Указанные признаки для решения подобной задачи ранее не использовались, поэтому отвечают критерию существенности новизны.

Пример 1. Получение стандартной кривой определения IgG человека с использованием пероксидазной метки.

Для адсорбции антител против IgG человека на полистирольной пленке, являющейся внутренней стенкой проточной кюветы, через проточную кювету толщиной 0,05 мм прокачивают 1 мл раствора антител кролика против IgG человека в ФБС (0,05 М фосфатный буфер, pH 7,2, 0,14 М NaCl). Концентрация IgG составляет 10 мкг/л, скорость прокачивания 20 мл/ч. Для промывки кюветы прокачивают 1 мл ФБС.

Через кювету пропускают раствор 1 мл ФБС, содержащего стандартную концентрацию IgG человека и затем раствор коньюгата антител против IgG человека (концентрация 10^-7 М) и раствор субстратов (люминол, п-йодфенол и H₂O₂). Измеряют величину максимальной интенсивности хемилюминесценции.

Строят стандартную кривую зависимости наблюдаемой интенсивности хемилюминесценции от концентрации IgG человека в образце (фиг. 2).

Пример 2. Определение концентрации IgG в растворе с использованием меченного пероксидазой антигена сэндвич-методом.

Для определения концентрации IgG человека в образце к 0,8 мл фосфатного буфера (0,1 М, pH 7,2, 0,3 M NaCl), содержащего меченный пероксидазой IgG человека (концентрация 3•10^-8 М), добавляют 0,2 мл раствора IgG человека с неизвестной концентрацией. 1 мл полученного раствора пропускают через кювету согласно примеру 1. Концентрацию IgG рассчитывают по калибровочной кривой.

Кювету отмывают 0,1 М раствором HCl. Повторяют иммобилизацию антител и определение IgG в том же растворе. Коэффициент вариации результатов, определенный для одной серии определений (концентрация IgG 0,120 нМ) составил 8%
Пример 3. Определение концентрации тироксина в растворе конкурентным способом.

На стенках проточной кюветы толщиной 0,03 мм иммобилизуют антитела кролика против тироксина согласно примеру 1. Через кювету пропускают 1 мл ФБС, содержащего меченный пероксидазой тироксин в концентрации 10^-8 М и стандартную концентрацию тироксина. Строят стандартную кривую зависимости наблюдаемой интенсивности хемилюминесценции от концентрации тироксина в образце (фиг. 3).

Для определения содержания тироксина в неизвестном образце 0,2 мл образца добавляют к 0,8 мл фосфатного буфера, содержащего меченый тироксин в концентрации 10^-8 M (0,06 М, pH 7,2, 0,18 М NaCl) и 1 мл полученного раствора пропускают через проточную кювету с иммобилизованными антителами. Промывают кювету 1 мл буферного раствора и после введения субстратного раствора измеряют интенсивность хемилюминесценции, концентрацию рассчитывают по стандартной кривой. Коэффициент вариации результатов для одной серии определений составил ≈ 10%
Пример 4. Определение концентрации инсулина.

На стенках проточной кюветы толщиной 0,01 мм иммобилизуют антитела кролика против инсулина согласно примеру 1. Через кювету пропускают 1 мл раствора, содержащего меченный пероксидазой инсулин в концентрации 5•10^-9 М и стандартную концентрацию свободного инсулина. Строят стандартную кривую зависимости наблюдаемой интенсивности хемилюминесценции от концентрации инсулина в образце (фиг. 4).

Для определения содержания инсулина в неизвестном образце 0,2 мл образца добавляют к 0,8 мл фосфатного буфера, содержащего меченый инсулин в концентрации 5•10^-9 М (0,06 М, pH 7,2, 0,18 М NaCl), и 1 мл полученного раствора пропускают через проточную кювету с иммобилизованными антителами. Промывают кювету 1 мл буферного раствора и после введения субстратного раствора измеряют интенсивность хемилюминесценции, концентрацию рассчитывают по стандартной кривой. Коэффициент вариации результатов анализа ≈ 12%
Предлагаемый метод может быть использован для количественного определения как низкомолекулярных соединений (гаптенов), так и высокомолекулярных, в том числе белков, гормонов, стероидов и т.д.

В России иммунохемилюминесцентный анализ в клинических лабораториях в настоящее время практически не осуществляют ввиду сложности схемы анализа и отсутствия соответствующих наборов реагентов. По сравнению с прототипом, принятым нами за базовый объект, поскольку его описание соответствует общепринятой методике проведения проточно-инжекционного иммуноферментного анализа с использованием стандартных наборов реагентов и аппаратуры, предложенный метод приводит к существенному упрощению анализа, сокращению числа его стадий, времени проведения. Метод позволяет использовать его также в научном эксперименте для слежения за ходом протекания реакции антиген-антитело без какого-либо возмущающего воздействия на компоненты иммунохимической системы с целью изучения кинетических и термодинамических параметров, характеризующих лиганд-рецепторные взаимодействия. На основе предложенного метода могут быть созданы продажные наборы реагентов, позволяющие осуществлять иммунохемилюминесцентный анализ в автоматическом режиме, что должно привести к значительному удешевлению стоимости проведения единичного анализа.

Использование: изобретение относится к области медицины и может быть использовано для иммунохемилюминесцентного определения биологически активных веществ. Сущность изобретения: способ основан на инжекционном введении в буферный поток определяемого антигена и меченных пероксидазой антител и последующем прокачивании раствора через проточную полистирольную кювету толщиной 0,005 - 0,1 мм с иммобилизованными на внутренней поверхности стенки антителами. Так как кювета имеет малую толщину, то время установления равновесия в проточной системе составляет 1 - 3 мин, что соответствует времени прохождения реагентов через кювету. После промывки кюветы и пропускания растворов субстратов регистрируют интенсивность хемилюминесценции непосредственно с поверхности стенки кюветы, по величине которой по стандартной кривой рассчитывают концентрацию антигена. 4 ил.

Способ определения биологически активных веществ, включающий проведение иммунохимической реакции в проточной кювете с участием определяемого антигена и меченого пероксидазой антигена или антитела в проточно-инжекционном режиме с последующей регистрацией содержащего пероксидазную метку сорбированного на твердой фазе иммунокомплекса в реакции усиленной хемилюминесценции с помощью фотоэлектрического умножителя, отличающийся тем, что в качестве твердой фазы используют стенку проточной кюветы из полимерного прозрачного материала, при этом толщина внутренней полости кюветы составляет 0,005 0,1 мм, а регистрацию иммунокомплекса, содержащего пероксидазную метку, осуществляют со стенки кюветы, при этом фотоэлектрический умножитель располагают в непосредственной близости от стенки кюветы.