МЕМБРАНА ДЛЯ РАЗДЕЛЕНИЯ КОМПОНЕНТОВ ИММУНОЛОГИЧЕСКОЙ РЕАКЦИИ Российский патент 1995 года по МПК G01N33/543 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к иммуноферментному анализу, и представляет собой мембрану для разделения компонентов иммунологической реакции.

Известны различные способы, проведения твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА), основанные на иммобилизации антител на твердых носителях, образовании специфических иммунокомплексов на носителе с определяемым антигеном и их выявлении с помощью ферментной метки.

Важным пунктом при проведении процедуры ИФА является стадия отделения меченых антител (антигена), не связанных в иммунокомплекс, от меченых антител (антигенов), связанных в иммунокомплекс. В процедурах ИФА гетерогенного типа для этого проводят иммобилизацию антител (антигена) на твердых нерастворимых носителях. Это, однако, приводит к значительному увеличению времени анализа.

Также известны способы разделения компонентов иммунохимической реакции с использованием фильтрации на пористых нитроцеллюлозных мембранах, что упрощает процедуру и исключает необходимость иммобилизации одного из компонентов в том случае, когда размер анализируемого соединения превышает диаметр пор.

В качестве прототипа предлагается микропланшет с фильтрующим дном, изготовленным из нитроцеллюлозной мембраны (диаметр пор 0,54 мкм), используемый в методе определения висцерального лейшманиоза человека [1] Образец паразитов инкубировали с формалином, наносили на микропланшеты, далее инкубировали с анализируемой пробой. Разделение в данном случае осуществлялось вследствие большого размера антигена.

Данная мембрана не позволяет осуществлять разделения компонентов в нижеописанном методе.

Известен способ проведения иммуноферментного анализа биологически активных веществ, осуществляемый следующим образом. К исследуемому образцу добавляют антитела, ковалентно иммобилизованные на водорастворимом поликатионе или полианионе, например полиметакриловой кислоте (ПМАК), и конъюгат антител (антигенов), меченых ферментом, при этом в растворе одновременно протекают реакции: связывания иммобилизованных антител с антигеном и мечеными антигенами (антителами). После образования растворимых иммунокомплексов раствор приводят в контакт с нерастворимым положительно заряженным носителем (полимером), вследствие чего компоненты, связанные с иммобилизованными антителами, адсорбируются на носителе в результате кооперативных ионных взаимодействий между молекулами отрицательно заряженного полианиона, содержащего иммунокомплекс антигена с мечеными ферментом антителами, и положительно заряженным носителем. После промывания носителя с целью удаления неспецифически связавшегося конъюгата антител с ферментом на него наносят раствор субстрата фермента и количественно измеряют концентрацию продукта, которая пропорциональна концентрации определяемого антигена и служит характеристикой его содержания в исследуемом растворе. Концентрацию антигена в исследуемом образце определяют с помощью калибровочного графика, полученного при использовании стандартных препаратов.

Для разделения компонентов иммунологической реакции, в результате которой образуется отрицательно заряженный комплекс полианиона и антигена, связанного с антителом, меченым ферментом, предлагается использовать мембрану, которая представляет собой подложку из ацетат- или нитроцеллюлозы, на которой адсорбирован поликатион. В качестве поликатиона можно использовать поли-4-винил-пиридинийбромид (ПВП), хитозан, полиэтиленимин и др.

Если в качестве носителя используют положительно заряженную мембрану, а продукт ферментативной реакции является нерастворимым и удерживается на мембране, то детекцию можно проводить визуально.

Заряженные мембраны получают следующим образом. Нитро- или ацетатцеллюлозные фильтры помещают в раствор поликатиона и инкубируют в нем в течение 1-2 ч при комнатной температуре.

П р и м е р 1. Анализ иммуноглобулинов G (IgG) человека.

В качестве антител использовали γ -глобулиновую фракцию кроличьей антисыворотки против IgG человека, дополнительно очищенную ионообменной хроматографией на ДЕАЕ-Sephacel.

Иммуносорбенты на основе ПМАК по- лучали ковалентным связыванием антигенов или антител с ПМАК, используя в качестве сшивающих агентов водорастворимые карбодиимиды (1-этил-3(3-диметил-аминопропил)-карбодиимид гидрохлорид или 1-циклогексил-3-(2-морфолино-4-этил)-карбо- диимид n-толуол-фосфат) совместно с N-оксисукцинимидом.

В качестве антигена использовали коммерческий препарат IgG человека.

В качестве фермента использовали пероксидазу хрена с RZ=3,0 (ПХ).

Конъюгат IgG человека с пероксидазой (ПХ/ЕС1.11.1.7) получали методом окисления углеводного компонента фермента периодатом натрия.

Нерастворимый заряженный полимер готовили следующим образом.

Нитроцеллюлозные фильтры производства фирмы "Синпор" инкубировали в растворе 1˙10^-7 М поли-4-винил-пиридинийбромида с молекулярной массой 80000 в калий-фосфатном буфере рН 7,2 (КФБ) в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем фильтры блокировали в 3%-ном растворе бычьего сывороточного альбумина в КФБ в течение 1 ч при комнатной температуре.

В серию инкубационных пробирок, содержащих IgG человека в концентрациях 1˙10^-9, 5˙10^-10, 2˙10^-10, 1˙10^-10, 5˙10^-11, 2˙10^-11 М в 0,01 калий-фосфатном буфере рН 7,2, 0,05% Твин-20, 0,15М NaCl, добавляли 0,1 мл раствора конъюгата IgG-пероксидаза (1˙10^-11 М). Затем в пробирку добавляли 0,1 мл раствора иммуносорбента (1˙10^-10 М), инкубировали 5 мин при комнатной температуре.

Разделяли компоненты раствора пропуская его через нитроцеллюлозный фильтр с иммобилизованным ПВП. Детекцию ферментной метки на фильтре вели инкубацией его в растворе субстратов, содержащем 3,3'-диаминобензидин (0,5 мг/мл), перекись водорода 1˙10^-3 М и добавки солей кобальта (0,2%).

Пересчет интенсивности окрашивания фильтра в концентрацию измеряемого IgG производили по калибровочному графику, полученному со стандартными препаратами IgG. Чувствительность метода составила 5˙10^-11 М.

П р и м е р 2. Анализ HBS-антигена.

В качестве антител использовали γ -глобулиновую фракцию кроличьей антисыворотки против НBS-антигена.

Иммуносорбенты на основе ПМАК по- лучали как в примере 1.

В качестве антигена использовали коммерческий препарат HBS-антигена.

В качестве фермента использовали пероксидазу хрена с RZ=3,0 (ПХ).

Конъюгат IgG, специфичных к HBS-антигену, с пероксидазой (ПХ/ЕС1.11.1.7) получали методом окисления углеводного компонента фермента периодатом натрия.

Нерастворимый заряженный полимер готовили следующим образом.

Ацетатцеллюлозные мембраны производства фирмы "Полимерсинтез" (Владимир) инкубировали в 1˙10^-7 М растворе полиэтиленимина с молекулярной массой 50000 в калий-фосфатном буфере рН 7,2 (КФБ) в течение 2 ч при комнатной температуре. Затем фильтры блокировали в 3%-ном растворе бычьего сывороточного альбумина в КФБ в течение 1 ч при комнатной температуре.

В серию инкубационных пробирок, содержащих HBS-антиген в концентрациях 320, 160, 80, 40, 20, 10, 5, 2,5 и 1,25 нг/мл в 0,01 калий-фосфатном буфере рН 7,2, 0,05% Твин-20, 0,15М NaCl, добавляли 0,1 мл раствора конъюгата IgG-пероксидаза (1˙10^-11 М). Затем в пробирку добавляли 0,1 мл раствора иммуносорбента (1˙10^-10 М) и инкубировали 5 мин при комнатной температуре.

Разделение компонентов раствора проводили пропуская его через нитроцеллюлозный фильтр с иммобилизованным поликатионом. Детекцию ферментной метки на фильтре вели инкубацией его в растворе субстратов, содержащем 3,3'-диаминобензидин (0,5 мг/мл), перекись водорода 1˙10^-3 М и добавки солей кобальта (0,2%).

Пересчет интенсивности окрашивания фильтра в концентрацию измеряемого НBS-антигена производили по калибровочному графику, полученному со стандартными препаратами HBS. Чувствительность метода составляет 2,5 нг/мл.

Таким образом, предлагаемая мембрана позволяет значительно упростить и ускорить процесс иммуноферментного анализа.

Использование: биотехнология. Сущность: мембрана состоит из подложки из ацетатцеллюлозы или из нитроцеллюлозы, на которой адсорбирован поликатион, например поли-4-винил-пиридинийбромид или полиэтиленимин.

МЕМБРАНА ДЛЯ РАЗДЕЛЕНИЯ КОМПОНЕНТОВ ИММУНОЛОГИЧЕСКОЙ РЕАКЦИИ, представляющая собой целлюлозную основу, отличающаяся тем, что в качестве целлюлозной основы используют ацетат- или нитроцеллюлозу, на которой адсорбирован поликатион.