Способ иммуноанализа биологически активных веществ Советский патент 1993 года по МПК G01N33/543 

Изобретение относится к области биотехнологии, точнее к способам иммунофер- ментного определения биологически активных веществ.

Целью изобретения является упрощение процесса.

Способ осуществляют следующим образом. К исследуемому образцу добавляют антитела, ковалентно иммобилизованные на водорастворимом полианионе или поликатионе, например, полиметакриловой кислоте (ПМАК), и конъюгат антител (антигенов), меченных ферментом, при этом в растворе одновременно протекают реакции: связывания иммобилизованных антител с антигеном и мечеными антигенами (антителами). После образования растворимых иммунокомплексов раствор приводят в контакт с

нерастворимым положительно заряженным носителем (полимером), вследствие чего компоненты, связанные с иммобилизованными антителамидцсорбируются на носителе в результате кооперативных ионных взаимодействий между молекулами отрицательно заряженного полианиона, содержащего иммунокомплекс антигена с меченными ферментом антителами, и положительно заряженной матрицей. После про- мывания носителя с целью удаления неспецифически связавшегося конъюгата антител с ферментом на него наносят раствор субстрата фермента и количественно измеряют концентрацию продукта, которая пропорциональна концентрации определяемого антигена и служит характеристикой его содержания в исследуемом растворе.

00

о

Ю Ј

СО

Концентрацию антигена в исследуемом образце определяют с помощью калибровочного графика, полученного при использовании стандартных препаратов. Если в качестве носителя используют поло- жительно заряженную мембрану, а продукт ферментативной реакции является водоне- растворимым и удерживается на мембране, то детекцию можно проводить визуально.

В качестве положительно заряженных нерастворимых полимеров могут быть использованы пористые матрицы (например, нитроцеллюлозные, ацетатцеллюлозные и др. мембраны), на которых предварительно был адсорбирован поликатион (например, поли-4-винил-пиридинийбромид (ПВП), хи- тозан, полиэтиленимин и др,); заряженные вследствие наличия ионогенных групп матрицы (например, ДЕАЕ-целлюлоза, ДЕ-бу- мага, DEAE-Sephacel и др.) и т.д.

Детекция ферментативной активности может вестись как непосредственно на матрице, так и в-смывах активных компонентов с нее. Применение в первом случае субстратных систем, образующих в результате ферментативной реакции нерастворимый продукт, позволяет проводить визуальную оценку результата анализа. Визуальная регистрация окраски поверхности пористого носителя (в отраженном свете, а не на про- пускание, как это имеет место при сравне нии окраски жидких образцов в способе-прототипе) позволяет с большей точностью проводить сравнение получаемых образцов со стандартами. С другой сто- роны, .обратимость ион-ионного взаимодействия при высоких значениях ионной силы позволяет.многократно использовать нерастворимый положительно заряженный полимер, элюируя с него свя- завшиеся компоненты и измеряя ферментативную активность в элюате.

П р и м е р 1. Анализ иммуноглобулинов 6(дС)человека. В качестве антител используют у -глобулиновую фракцию кроличьей антисыворотки против 1дС-человека, дополнительно очищенную ионообменной хроматографией на DEAE-Sephacel.

Иммуносорбенты на основе полиметак- риловой кислоты .(ПМАК) с молекулярной массой 200 000 получают ковалентным связыванием антигенов или антител с ПМАК, используя в качестве сшивающих агентов водорастворимые карбодиимиды (1-этил- 3(3-диметиламинопропил)-карбодиимид гидрохлорид или 1-циклогексил-3-(2-морфо- лино-4-этил)-карбодиимид п-толуол-фосфат) совместно с М-оксисукцинимидом.

В качестве антигена используют коммерческий препарат IgG человека.

В качестве фермента используют перок- сидазу хрена с PZ 3,0 (ПХ).

Конъюгат IgG человека с пероксидазой (ПХ/ЕС1.11.1.7) получают методом окисления углеводного компонента фермента пе- риодатом натрия.

Нерастворимый заряженный полимер готовят следующим образом. Нитроцеллюлозные фильтры производства фирмы Сим- пор инкубируют в 1x10 М растворе поли-4-винил-пиридинийбромида (ПВП) с молекулярной массой 80000 в калий-фосфатном буфере рН 7,2 (КФ Б) в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем фильтры блокируют 3%-ным раствором бычьего сывороточного альбумина в КФБ в течение 1 часа при комнатной температуре.

В серию инкубационных пробирок, содержащих 1gG человека в концентрациях , , , , , в 0,01 калий-фосфатном буфере рН 7,2,0,05% Твин-20, 0.15М NaCI, добавляют 0,1 мл раствора конъюгата lgG-перокси- даза (1 ). Затем в пробирку добавляют 0,1 мл раствора иммуносорбента (), инкубируют 5 минут при комнатной температуре.

Разделение компонентов раствора проводят, пропуская его через нитроцеллюлоз- ный фильтр с иммобилизованным ПВП. Детекцию ферментной метки на фильтре ведут инкубацией его в растворе субстратов, содержащем 3,3 -диаминобензидин (0,5 мг/мл), перекись водорода и добавки солей кобальта (0,2%).

Определение концентрации измеряемого IgG проводят по интенсивности окрашивания фильтра по калибровочному графику, полученному со стандартными препаратами IgG. Чувствительность метода -5х10 11М. время анализа - 10 минут.

П р и м е р 2. Анализ HBS-антигена, В качестве антител используют у -глобулиновую фракцию кроличьей антисыворотки против HBS-антигена.

Иммуносорбент, конъюгат IgG, специфический к HBS-антигену и нерастворимый заряженный полимер получают, как в примере 1.

В качестве антигена используют коммерческий препарат HBS-антигена.

В серию инкубационных пробирок, содержащих HBS-антиген в концентрациях 320, 160, 80, 40, 20, 10, 5, 2,5 и 1,25 нг/мл в 0,01 калий-фосфатном буфере рН 7,2, 0,05% Твин-20, 0,15М NaCI, добавляют 0,1 мл раствора конъюгата lgG-пероксидаза (1x10 М). Затем в пробирку добавляют 0,1 мл раствора иммуносорбента (), инкубируют 5 минут при комнатной температуре.

Далее способ осуществляют как в примере 1.

Чувствительность метода - 2,5 нг/мл, время проведения анализа 10 мин.

П р и м е р 3. Анализ тироксина. В качестве антител используют у -глобулино- вую фракцию кроличьей антисыворотки против тироксина.

В качестве антигена используют коммерческий препарат тироксина.

Иммуносорбент и конъюгат тироксина с пероксидазой получают, как в примере 1.

В качестве нерастворимого заряженного полимера используют ДЕАЕ-бумагу. Предварительно носитель блокируют в 3% растворе бычьего сывороточного альбумина в КФБ в течение 1 часа при комнатной температуре.

В серию инкубационных пробирок, содержащих, тироксин в концентрациях 50, 150, 300, 500 нг/мл в 0,01 калий-фосфатном буфере рН 7,2, 0,05% Твин-20, 0,15MJSIaCI, добавляют 0,1 мл раствора конъюгата ти- роксин-пероксидаза (60 нг/мл). Затем в пробирку добавляют 0,1 мл раствора имму- носорбента (), инкубируют 5 минут при комнатной температуре.

Разделение компонентов раствора проводят, пропуская его через блокированную ДЕАЕ-бумагу. Далее способ осуществляют как в примере 1.

Чувствительность метода - 150 нг/мл, время анализа 5 мин.

П р и м е р 4. Анализ пероксидазы в качестве антигена. В качестве антител ис- пользуют у -глобулиновую фракцию кроличьей антисыворотки против пероксидазы.

Иммуносорбенты получают как в примере 1.

В качестве антигена используют фер- мент - пероксидазу хрена с RZ 3,0 (ПХ).

В качестве нерастворимого заряженного полимера используют ДЕАЕ-Sephacel. Предварительно носитель блокируют 3%ным раствором бычьего сывороточного альбумина в КФБ в течение 1 часа при комнатной температуре.

В серию инкубационных пробирок, содержащих пероксидазу в 0,01 калий-фосфатном буфере рН 7,2, 0,05% Твин-20, 0.15М NaCI, добавляют 0,1 мл раствора им- муносорбента (), инкубируют 5 минут при комнатной температуре.

Далее способ осуществляют как в примере 1.

Чувствительность метода - , время анализа 10 мин.

Таким образом предлагаемый способ экспресс-анализа по чувствительности сопоставим с твердофазными методами ИФА. В то же время гомогенность аналитической системы позволяет сократить количество стадий, увеличить точность и воспроизводимость анализа.

Формула изобретения Способ иммуноанализа биологически активных веществ, включающий добавление в исследуемый образец меченных ферментом антигенов или антител и Специфических антигенов или антител, иммобилизованных на водорастворимом полианионе или поликатионе, разделение компонентов иммунологической реакции с помощью противоположно заряженного полимера и последующее определение ферментативной активности, отличающий- с я тем, что, с целью упрощения способа, для разделения компонентов иммунологической реакции используют нерастворимые, заряженные полимеры, при этом реакционный раствор приводят сначала в контакте нерастворимым заряженным полимером, затем с субстратным раствором и определяют ферментативную активность на поверхности полимера или в элюате, полученном элюцией с поверхности полимера связавшихся компонентов.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу проведения имму- ноферментного анализа, и может быть использовано для определения биологически активных веществ. Цель изобретения - упрощение анализа. Сущность изобретения: к исследуемому образцу добавляют антитела, иммобилизованные на полиметакриловой кислоте, и конъюгат антитела (антигена) с ферментом. После образования растворимых иммунокомплексов раствор приводят во взаимодействие с нерастворимым положительно заряженным носителем. Ферментативную активность определяют на поверхности полимера или в элюате, полученном элюцией с поверхности полимера связавшихся компонентов. Положительный эффект. Анализ непродолжителен и прост, предполагает возможность использования малых проб, содержащих антиген, что делает его практичным и эффективным. ел