Способ диагностики аутоиммунного тиреоидита Российский патент 2024 года по МПК G01N33/49 G01N33/78 G01N33/564 G01N33/532 G01N33/573 G01N1/30 

Изобретение относится к области медицины, а именно к эндокринологии и иммунологии, более точно к способу диагностики аутоиммунного тиреоидита. Может быть использовано для диагностики аутоиммунного тиреоидита на основе определения наличия или отсутствия флюоресценции препарата крови, представляющего собой выделенные из венозной крови пациента лимфоциты, инкубированные с помощью меченого L-азидогомоаланином антигена тиреопероксидазы. При облучении указанного препарата крови в проточном цитометре лучом лазера (в случае наличия флюоресценции) обеспечивается возможность идентификации аутоиммунного тиреоидита, в противном случае ставится диагноз отсутствия указанного заболевания.

Технической проблемой, решаемой заявленный изобретением, является недостаточная (неудовлетворительная) достоверность результатов диагностики аутоиммунного тиреоидита, выполняемой известными способами – физикальными исследованиями, лабораторными исследованиями крови и исследованиями биологических жидкостей, УЗИ, а также многоступенчатость, высокая времязатратность процесса и высокая стоимость (дороговизна реактивов и процесса) его осуществления; необходимость участия высококвалифицированного персонала для осуществления диагностики.

Использованные в тексте термины и определения:

Антиген – вещество, которое может связываться со специфическим антителом или рецептором Т-лимфоцитов и вызвать иммунный ответ [https://bigenc.ru/c/antigen-eddc38].

Аутоантигены – компоненты клеток и тканей собственного организма, которые распознаются при определённых условиях как чужеродные [https://бмэ.орг/index.php/ АУТОАНТИГЕНЫ].

Аутоиммунный тиреоидит – хроническое воспалительное аутоиммунное заболевание щитовидной железы, которые на дату подачи заявленного технического решения диагностируются с погрешностью в диапазоне 10-20%. При этом заболевание характеризуется разрушением тканей щитовидной железы пациента лимфоцитами [см. https://www.palomahealth.com/learn/hashimotos-thyroiditis-normal-antibodies].

Аутореактивные лимфоциты – лимфоциты, реагирующие на собственные антигены [см. Мерфи, К. Иммунобиология по Джанвэю / К. Мерфи, К. Уивер; пер. с англ.; под ред. Г.А. Игнатьевой, О.А. Свитич, И.Н. Дьякова. — М.: Логосфера, 2020. — 1184 с.: ил.: 21,3 см.].

Градиент плотности фиколл – раствор полисахарозы 400 с диатризоатом натрия, оптимизированный для создания раствора с заданным градиентом плотности, который используется при разделении клеток и органелл методом центрифугирования. Фиколл является зарегистрированной торговой маркой, принадлежащей компаниям GE Healthcare. Используют в биологических лабораториях для разделения крови на её компоненты (эритроциты, лейкоциты и т.д.) [см. https://www.dia-m.ru/news/fikoll-polisakharoza-400-v-rastvore/].

Лимфоциты – клетки крови из группы лейкоцитов. Обеспечивают гуморальный иммунитет (выработку антител), клеточный иммунитет (контактное взаимодействие с клетками-жертвами), а также регулируют деятельность клеток других типов [см. https://meduniver.com/Medical/Physiology/334.html].

Мононуклеарные клетки периферической крови – клетки периферической крови, имеющие круглое ядро. Эти клетки состоят из лимфоцитов (Т-клеток, В-клеток, натуральных киллеров) и моноцитов, тогда как эритроциты и тромбоциты не имеют ядер, а гранулоциты (нейтрофилы, базофилы и эозинофилы) имеют многодольчатые ядра [см.https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK500157/].

Серонегативный аутоиммунный тиреоидит – аутоиммунный тиреоидит, при котором антитела к тиреопероксидазе и тиреоглобулину не обнаруживаются [см. Rotondi M, de Martinis L, Coperchini F, Pignatti P, Pirali B, Ghilotti S, Fonte R, Magri F, Chiovato L. Serum negative autoimmune thyroiditis displays a milder clinical picture compared with classic Hashimoto's thyroiditis. Eur J Endocrinol. 2014 Jul;171(1):31-6. doi: 10.1530/EJE-14-0147].

Серопозитивный аутоиммунный тиреоидит – аутоиммунный тиреоидит, при котором антитела к тиреопероксидазе и/или тиреоглобулину обнаруживаются.

Тиреопероксидаза – фермент, содержащийся в клетках щитовидной железы и отвечающий за образование активной формы йода для синтеза тиреоидных гормонов. Является главным антигеном, к которому вырабатываются антитела при аутоиммунном тиреоидите [Jean Ruf, Pierre Carayon. Structural and functional aspects of thyroid peroxidase (англ.) // Archives of Biochemistry and Biophysics. — 2006-01. — Vol. 445, iss. 2. — P. 269–277. doi:10.1016/j.abb.2005.06.023].

L-азидогомоаланин – аминокислотный аналог метионина, это биохимический реагент, необходимый для выявления белка, в данном случае тиреопероксидазы, который содержит модификацию, а именно азидогруппу. Это соединение включается в белки во время синтеза белка в клетке при культивировании. Для обнаружения белка с L-азидогомоаланином используют хемоселективное лигирование или реакцию между азидной группой белка и алкинной группой флуоресцентного красителя. Таким образом, необходим для выполнения заявленного способа как исходный реагент для проведения диагностики аутоиммунного тиреоидита [https://ru.lumiprobe.com/p/l-azidohomoalanine-aha].

MHC (Major Histocompatibility Complex) – главный комплекс гистосовместимости, комплекс генов, кодирующих белки, ответственные за представление (презентацию) антигенов (Т-лимфоцитам) при иммунном ответе [https://www.britannica.com/science/major-histocompatibility-complex].

Физикальное исследование – осмотр, пальпация, аускультация и измерение тела и его частей. Это этап, который следует за сбором анамнеза и предшествует назначению лабораторных тестов и лучевых исследований [https://meduniver.com/Medical/ travmi/fizikalnoe_issledovanie.html?ysclid=lq56je6o39717735985].

Диагноз "аутоиммунный тиреоидит" ставят на основании симптомов заболевания, физикального осмотра щитовидной железы и результатов анализов. Для исключения заболеваний, протекающих с похожими проявлениями, например рака щитовидной железы, диффузного токсического зоба, необходим ряд дополнительных исследований [https://helix.ru/kb/item/2509/].

Лабораторные анализы крови при аутоиммунном тиреоидите:

– антитела к тиреопероксидазе (АТ-ТПО);

– антитела к рецепторам тиреотропного гормона (АТ-рТТГ);

– уровень ТТГ, Т3, Т4 [https://helix.ru/kb/item/2509/].

Ультразвуковое исследование – инструментальный метод диагностики аутоиммунного тиреоидита. Применительно к диагностике тиреоидита УЗИ – единственный инструментальный метод. Выполняют с использованием аппарата УЗИ [http://pmarchive.ru/ultrazvukovoe-issledovanie-autoimmunnogo-tireoidita-v-ambulatornyx-usloviyax/].

Исследование уровня техники выполненные заявителем позволили выявить аналоги предлагаемого изобретения. При описании аналогов использована терминология их (аналогов) описаний.

Известно изобретение по патенту CN 102735833 «Набор для гомогенно-фазового люминесцентного иммуноанализа на антитела к тиреопероксидазе и метод обнаружения». Сущностью является способ диагностики аутоиммунного тиреоидита путем гомогеннофазного люминесцентного иммуноанализа на антитела к тиреопероксидазе. Набор для гомогенно-фазового люминесцентного иммуноанализа на антитела к тиреопероксидазе включает гомогенно-фазовый люминесцентный 96-поровый планшет для определения, стандартный продукт антител к тиреопероксидазе, раствор донорских микросфер, покрытых стрептавидином, и меченый биотином антиген тиреопероксидазы, а также раствор микросфер рецептора, покрытых антигеном тиреопероксидазы. Антиген тиреопероксидазы в образце конкурирует с антигеном тиреопероксидазы на микросферах рецептора, объединяясь с меченым биотином антигеном тиреопероксидазы. Способ обнаружения включает измерения сигналов люминесценции известных стандартных продуктов с различным содержанием, построение стандартной кривой и получение математической функции, а также получение содержания неизвестного образца с помощью математической функции. Способ обнаружения объединяет преимущества, как иммуноферментного анализа, так и иммунохемилюминесцентного анализа, точно определяет уровень антител к тиреопероксидазе в сыворотке, применяется для скрининга, диагностики и оценки лечебного эффекта в группах высокого риска с аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы.

Как видно из приведенного в описания изобретения, диагноз ставят по наличию антител к тиреопероксидазе. Антитела к тиреопероксидазе обнаруживаются у 80-90% пациентов, 10-20% пациентов являются серонегативными.

Недостатком является неудовлетворительная (недостаточная) для достоверной диагностики чувствительность.

Известно изобретение по патенту RU 2315313 «Способ определения антител и способ диагностики аутоиммунного тиреоидита». Сущностью является способ определения аутоантител по изменению частоты колебаний пьезокварцевого резонатора на основе объемно-акустических волн до и после поэтапной иммобилизации на твердой поверхности электродов пьезокварцевого резонатора L-полилизина, антигена- ДНК и последующей инкубацией пьезокварцевого резонатора в сыворотке крови, разведенной в буфере, отличающийся тем, что электроды берут серебряные или золотые, L-полилизин берут в водном растворе 1,75 мг/мл в объеме 10 мкл и после нанесения на электрод выдерживают в насыщенной водяными парами камере в течение 4 ч, затем отмывают и сушат, а ДНК берут в концентрации 0,68 мг/мл, разведенной в буфере 0,01 М Трис-HCl, 0,01 М ЭДТА в объеме 10 мкл и после нанесения на электрод выдерживают в камере, насыщенной водяными парами в течение 1 ч, затем промывают и высушивают, а инкубацию пьезокварцевого резонатора в сыворотке крови осуществляют в течение 1 ч в камере, насыщенной водяными парами, промывают и высушивают. Способ диагностики аутоиммунного тиреоидита, включающий клинико-лабораторные исследования, определение аутоантител к ДНК, отличающийся тем, что определение аутоантител к ДНК осуществляют с использованием способа по п. 1 формулы, причем при показателе сдвига частоты колебаний пьезокварцевого резонатора в пределах Δf=124,50±13,84 Гц судят о наличии заболевания у исследуемого.

Таким образом, более коротко, определение аутоантител осуществляют по изменению частоты колебаний пьезокварцевого резонатора на основе объёмно-акустических волн до и после поэтапной иммобилизации на твердой поверхности электродов пьезокварцевого резонатора L-полилизина, антигена-ДНК и последующей инкубации пьезокварцевого резонатора в сыворотке крови.

Недостатком известного изобретения являются ограничения, связанные с использованием объёмно-акустических волн в качестве возбудителя колебаний пьезокварцевого резонатора – такие, как наличие побочных резонансов и температурная нестабильность. Кроме того, осуществление способа происходит с большими затратами времени вследствие того, что скорость анализа зависит от продолжительности времени инкубации, необходимого для образования комплекса антиген-антитело, и времени, затраченного на полную регенерацию датчика. Еще одним недостатком является низкая диагностическая специфичность способа. Известно, что антитела к ДНК обнаруживаются как при аутоиммунном тиреоидите, так и при других аутоиммунных заболеваниях, например, системной красной волчанке, системной склеродермии, ревматоидном артрите.

Существование подобия (одинаковости) наблюдаемых симптомов и признаков различных заболеваний существенно снижает достоверность результатов диагностики и результаты последующего лечения на основе сомнительного (малодостоверного) диагноза, что не позволяет с высокой степенью достоверности провести точную диагностику, поставить точный диагноз и назначить надлежащее лечение.

Известно изобретение по патенту RU 2704232 «Однодоменные антитела, направленные против фактора некроза опухолей альфа, и их применение». Сущностью является полипептидная конструкция, способная специфически связывать TNF-альфа, для лечения, профилактики или облегчения протекания расстройств, которые чувствительны к модуляции веществом, модулирующим TNF-альфа, и связаны с воспалительными процессами или аутоиммунными заболеваниями, содержащая два-четыре антагонистических однодоменных антитела, направленных против TNF-альфа, полученных способом, включающим стадию отбора на основании определения антагонистического эффекта с использованием анализа цитотоксичности и по крайней мере IC50 ~ 100 нМ, и одно однодоменное антитело, направленное против сывороточного белка, в которой указанные два-четыре однодоменных антитела анти-TNF не имеют одинаковую последовательность или все однодоменные антитела анти-TNF имеют одинаковую последовательность.

Более кратко сущность заключается в том, что для диагностики используют полипептидную конструкцию, способную специфически связывать фактор некроза опухолей альфа (TNF-альфа), содержащая два-четыре антагонистических однодоменных антитела, направленных против TNF-альфа, и одно однодоменное антитело, направленное против сывороточного белка.

Недостатком изобретения является низкая достоверность диагностики по определению фактора некроза опухолей альфа в сыворотке крови. Причиной низкой достоверности диагностики является наблюдаемое самопроизвольное увеличение титров TNF-альфа в сыворотке крови. Увеличение титров может быть связано не с одним (аутоиммунным тиреоидитом), а с несколькими другими аутоиммунными и воспалительными заболеваниями, например – такими как ревматоидный артрит, болезнь Крона, системная красная волчанка. Существование подобия симптомов и признаков различных заболеваний снижает достоверность результатов диагностики тиреоидита.

Известно изобретение по патенту US 10796785 «Способ и система для микробиомной диагностики и лечения заболеваний эндокринной системы». Сущностью является способ диагностики и лечения эндокринного заболевания у субъекта, включающий: получение совокупного набора образцов из совокупности субъектов; для каждой пробы совокупного набора проб: определение последовательности микроорганизма, включающее: идентификацию праймеров для последовательностей нуклеиновых кислот, связанных с эндокринным заболеванием, и амплификацию материала нуклеиновой кислоты с использованием идентифицированных праймеров; и определение выравнивания последовательности микроорганизма с эталонной последовательностью, связанной с эндокринным заболеванием; генерирование набора данных о характеристиках микробиома для популяции субъектов на основе сопоставлений; генерирование характеристики эндокринного состояния на основе признаков, извлеченных из набора данных о характеристиках микробиома, и дополнительного набора данных, информативного о характеристиках, связанных с эндокринным состоянием; на основе характеристики создают модель терапии, которая определяет терапию для коррекции эндокринного состояния; и в устройстве вывода, связанном с субъектом, обеспечивая терапию субъекту с эндокринным заболеванием на основе характеристики и модели терапии. Способ диагностики и лечения эндокринного заболевания у субъекта, включающий: получение образца от субъекта; определение набора последовательностей микроорганизмов из образца, включающее: идентификацию праймеров для последовательностей нуклеиновых кислот, связанных с эндокринным состоянием, и амплификацию материала нуклеиновой кислоты образца с использованием идентифицированных праймеров; извлечение набора данных о характеристиках микробиома для субъекта на основе набора последовательностей микроорганизмов; создание характеристики субъекта после обработки набора данных о характеристиках микробиома с помощью модели характеристики, полученной из популяции субъектов, страдающих эндокринным заболеванием; обработка характеристики с помощью модели терапии, которая определяет терапию для коррекции эндокринного состояния; и в устройстве вывода, связанном с субъектом, обеспечивая терапию субъекту с эндокринным заболеванием на основе характеристики и модели терапии.

Более кратко сущность способа заключается в диагностике состояния эндокринной системы у субъекта, при этом способ включает: получение совокупного набора биологических образцов от популяции субъектов; создание, по меньшей мере, одного из набора данных о составе микробиома и набора данных о функциональном разнообразии микробиома для популяции субъектов; создание характеристики состояния эндокринной системы на основе признаков, извлеченных, по меньшей мере, из одного из набора данных о составе микробиома и набора данных о функциональном разнообразии микробиома; на основе характеристики генерация модели терапии, настроенной на коррекцию состояния эндокринной системы; и в устройстве вывода, связанном с субъектом, продвигают терапию для субъекта на основе характеристики и модели терапии.

Недостатками известного способа являются многоступенчатость и высокая времязатратность процесса его осуществления, необходимость использования разнородного и дорогостоящего оборудования. Другим недостатком способа является необходимость привлечения особо высококвалифицированных специалистов узкого профиля для осуществления известного способа. Из-за своих особенностей известный способ реально осуществим преимущественно в крупных научно-исследовательских центрах. Маловероятно применение этого способа в лабораториях преобладающего большинства организаций здравоохранения, не оснащенных специальными приборами и соответствующим персоналом для обслуживания этого оборудования.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению, прототипом по совокупности совпадающих признаков, является изобретение по патенту US 7902121 «Массивы MHC-антигенов для обнаружения и характеристики иммунных ответов». Сущностью является способ профилирования Т-клеток, включающий: приведение в контакт клеточной популяции, содержащей Т-клетки, с матрицей, при этом указанная матрица содержит множество дискретных областей комплексов MHC-антиген, стабильно связанных с поверхностью твердого носителя. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный массив содержит множество различных комплексов MHC-антиген. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный твердый носитель покрыт полиакриламидом. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанное пятно содержит по меньшей мере около 0,01 нг указанного комплекса MHC-антиген. Способ по п. 1, отличающийся тем, что каждый из указанных участков содержит множество различных антигенных комплексов. Способ по п. 1, отличающийся тем, что один или несколько из указанных комплексов MHC-антиген содержат антиген, выбранный из группы, состоящей из опухолевых антигенов; вирусные антигены, бактериальные антигены; паразитарные антигены; экологические антигены; аллергены; и аутоиммунные антигены. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанная популяция клеток имеет множественные антигенные специфичности Т-клеток. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанная популяция клеток включает несколько типов клеток. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный образец выбран из группы, состоящей из крови, лимфы, спинномозговой жидкости и синовиальной жидкости. Способ по п. 9, отличающийся тем, что один или несколько указанных типов клеток дифференциально метят обнаруживаемым маркером перед указанным этапом контактирования, и при этом указанный сайт-специфический анализ обнаруживает присутствие указанного маркера. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанные комплексы MHC-антиген содержат библиотеку антигенных пептидов, образующих комплекс с MHC. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный массив дополнительно содержит одну или более областей, содержащих сигнальные зонды. Способ по п. 12, отличающийся тем, что указанные сигнальные зонды содержат возможные фармакологически активные лекарственные средства. Способ по п. 12, отличающийся тем, что указанные сигнальные зонды содержат пептидную библиотеку. Способ по п. 12, отличающийся тем, что указанные сигнальные зонды печатаются совместно с указанными комплексами MHC-антиген. Способ по п. 12, отличающийся тем, что указанные сигнальные зонды примыкают к указанным комплексам MHC-антиген. Способ по п. 12, в котором указанные сигнальные зонды содержат агенты-кандидаты. Способ по п. 12, в котором указанные сигнальные зонды вызывают изменение способности указанных Т-клеток связываться с указанным массивом, и при этом указанный сайт-специфический анализ включает определение способности клеток связываться с указанным антигенным комплексом MHC в присутствии или в отсутствие указанного сигнального зонда. Способ по п. 12, отличающийся тем, что указанный сигнальный зонд выбран из группы, состоящей из цитокинов, хемокинов и интерлейкинов. Способ по п. 1, дополнительно включающий определение изменения фенотипа указанных Т-клеток после контакта с указанным массивом. Способ по п. 20, отличающийся тем, что указанное изменение фенотипа включает секрецию белка в ответ на антигенную стимуляцию. Способ по п. 1, в котором указанный массив дополнительно содержит одно или более пятен, содержащих ячейки. Способ по п. 22, отличающийся тем, что указанные клетки представляют собой антигенпрезентирующие клетки. Способ по п. 1, дополнительно включающий этап приведения указанного массива в контакт со второй популяцией клеток и определения связывания указанных клеток с указанными Т-клетками. Способ по п. 1, дополнительно включающий этап приведения указанного массива в контакт со второй популяцией клеток и определения изменения фенотипа указанных Т-клеток или указанной второй популяции клеток. Способ по п. 1, дополнительно включающий этап приведения указанной матрицы в контакт с экзогенным агентом и определения изменения фенотипа указанных Т-клеток. Способ по п. 26, отличающийся тем, что указанный экзогенный агент выбран из группы, состоящей из факторов роста и иммуномодулирующих агентов. Способ по п. 1, дополнительно включающий этап определения экспрессии антигенов клеточной поверхности указанными Т-клетками после указанного этапа контактирования. Способ по п. 1, дополнительно включающий этап выделения указанных клеток из указанного массива. Способ по п. 1, дополнительно включающий этап размножения указанных Т-клеток после указанного этапа контактирования. Способ по п. 30, отличающийся тем, что указанный этап расширения включает приведение указанных Т-клеток в контакт с одним или несколькими факторами роста, цитокинами, молекулами клеточной адгезии и материалом внеклеточного матрикса. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанная матрица содержит множество пятен, имеющих различные концентрации комплексов MHC-антиген. Способ по п. 32, дополнительно включающий этап построения масштабной кривой для связывания Т-клеток с указанными комплексами MHC-антиген. Способ по п. 1, дополнительно включающий этап определения связывания указанных клеток с указанными комплексами MHC-антиген с помощью сайт-специфического анализа. Массив, включающий множество дискретных участков комплексов MHC-антиген, стабильно связанных с поверхностью твердого носителя, где плотность пятен составляет по меньшей мере 1/см2 и не более 40 000/см2, и популяцию клеток связанный с указанными комплексами MHC-антиген. Матрица по п. 35, в которой указанная твердая подложка покрыта полиакриламидом. Массив по п. 35, отличающийся тем, что указанное пятно содержит по меньшей мере около 0,01 нг указанного комплекса MHC-антиген. Массив по п. 35, отличающийся тем, что указанная популяция клеток дифференциально помечена. Массив по п. 35, отличающийся тем, что каждый из указанных участков содержит множество различных антигенных комплексов. Массив по п. 35, отличающийся тем, что один или несколько из указанных комплексов MHC-антиген содержат антиген, выбранный из группы, состоящей из опухолевых антигенов; вирусные антигены, бактериальные антигены; паразитарные антигены; экологические антигены; аллергены; и аутоиммунные антигены. Массив по п. 35, отличающийся тем, что указанная популяция клеток имеет множественные антигенные специфичности Т-клеток. Массив по п. 35, отличающийся тем, что указанные комплексы MHC-антиген содержат библиотеку антигенных пептидов, образующих комплекс с MHC. Массив по п. 35, отличающийся тем, что указанный массив дополнительно содержит одно или более пятен, содержащих сигнальные зонды. Массив по п. 43, отличающийся тем, что указанные сигнальные зонды содержат кандидатные фармакологически активные лекарственные средства. Массив по п. 43, отличающийся тем, что указанные сигнальные зонды содержат пептидную библиотеку. Матрица по п. 43, отличающаяся тем, что указанные сигнальные зонды напечатаны совместно с указанными комплексами MHC-антиген. Массив по п. 43, отличающийся тем, что указанные сигнальные зонды расположены рядом с указанными комплексами MHC-антиген. Массив по п. 43, в котором указанные сигнальные зонды содержат агенты-кандидаты. Массив по п. 43, отличающийся тем, что указанный сигнальный зонд выбран из группы, состоящей из цитокинов, хемокинов и интерлейкинов. Матрица по п. 35, отличающаяся тем, что указанная матрица содержит множество пятен, имеющих разные концентрации комплексов MHC-антиген.

Более кратко сущность заключается в профилировании Т-лимфоцитов, при котором клетки профилируют в отношении экспрессии ими антигенных рецепторов и способности реагировать на внешние стимулы в микроокружении. Внешние стимулы включают межклеточные взаимодействия, реакцию на факторы и тому подобное. Клетки располагаются на плоской или трехмерной подложке путем связывания с иммобилизованными или частично диффундирующими клетками и MHC-антигенными комплексами. Дополнительные зонды также могут быть расположены в сочетании с MHC-антигенными комплексами, включая сигнальные сигналы, которые регулируют клеточные реакции, молекулы адгезии, факторы дифференцировки и т. д. После того, как клетки выстроены в ряд, их можно охарактеризовать на предмет экспрессии антигенного рецептора и других фенотипических признаков, например экспрессия других маркеров клеточной поверхности; или поддерживаются в культуре в течение периода времени, достаточного для определения реакции на интересующий стимул. Каждый из массивов MHC-пептидный комплекс «пятна» образует мультивалентную плоскость антигена, аутоантигена, представленные в контексте специфического MHC-молекула. Этот массив используется для отбора Т-клеток в сложной популяции, которые способны связывать этот антиген.

Недостатком прототипа является низкая специфичность выявления аутореактивных Т-лимфоцитов, следствием чего является низкая чувствительность способа и, соответственно, низкая достоверность его результатов. Причиной является известный факт того, что аутоиммунные Т-лимфоциты несут Т-клеточные рецепторы, обладающие низким сродством к родственному антигену, вследствие чего молекулы MHC не связываются с Т-клеточным рецептором, что приводит к ложноотрицательной реакции, а именно – выявлению менее 0,05 % популяции аутореактивных Т-лимфоцитов. Другим недостатком прототипа является многоступенчатость, времязатратность и дороговизна как самого анализа, так и процесса синтеза молекул MHC. Молекулы MHC нестабильны, когда они не входят в состав комплекса с антигеном. По этой причине технология ограничена длительным производством молекул антиген-MHC, ибо каждый пептид антиген-MHC требует индивидуальной процедуры сборки и очистки. Кроме того, разработка высокопроизводительных стратегий для идентификации Т-клеток ограничена этапом, включающим создание больших библиотек антиген-MHC, необходимостью синтезировать более 3-х разных последовательностей комплексов антиген- MHC. Недостатком способа является также необходимость привлечения высококвалифицированных специалистов и специалистов узкого профиля. Из-за своих особенностей способ реально осуществим преимущественно в крупных научно-исследовательских центрах. Маловероятно применение этого способа в лабораториях преобладающего большинства организаций здравоохранения, не оснащенных специальными приборами и соответствующим персоналом для обслуживания этого оборудования.

Таким образом, более детально недостатками прототипа являются:

1 – недостаточная (неудовлетворительная) достоверность результатов диагностики, выполняемой путем лабораторного исследования и обнаружения аутореактивных лимфоцитов;

2 – многоступенчатость, высокая времязатратность процесса и высокая стоимость (дороговизна реактивов и процесса) его осуществления;

3 – необходимость участия высококвалифицированного персонала для осуществления прототипа.

Техническим результатом заявленного технического решения является разработка способа диагностики аутоиммунного тиреоидита, при использовании которого достигается:

1 – повышение достоверности и точности диагностики аутоиммунного тиреоидита путем осуществления диагностики с использованием антигена тиреопероксидазы с L-азидогомоаланиновой меткой;

2 – упрощение (более низкая ступенчатость и времязатратность) процесса осуществления диагностики;

3 – отсутствие необходимости привлечения особо высококвалифицированного персонала.

Сущностью заявленного технического решения является способ диагностики аутоиммунного тиреоидита, заключающийся в том, что выделяют мононуклеарные клетки из венозной крови на градиенте плотности фиколл 1,077, которые инкубируют с антигеном тиреопероксидазы, меченым L-азидогомоаланином; затем проводят их фиксацию в 4% растворе параформальдегида в течение 15 мин; затем отмывают их и инкубируют в растворе 100 мМ сульфата меди (II) и 1 мкМ зеленого флуоресцентного красителя Alexa Fluor 488 в объеме 500 мкл в течение 15 мин; затем мононуклеарные клетки отмывают путем центрифугирования в течение 5 мин, после чего добавляют 500 мкл фосфатно-солевого буферного раствора и осуществляют выполнение их анализа с помощью проточной лазерной цитофлуориметрии: образец облучают лазерным лучом с длиной волны 488 нм, результат облучения детектируют в FL1-канале цитометра с монитором, при этом устанавливают связывание лимфоцитов с антигеном тиреопероксидазы; при наличии более 5% положительно флуоресцирующих клеток образца при облучении его лучом лазера диагностируют аутоиммунный тиреоидит, при наличии менее 5% положительно флуоресцирующих клеток образца диагностируют отсутствие аутоиммунного тиреоидита.

Заявленное техническое решение иллюстрируется фиг. 1–3.

На фиг. 1 приведена детекция методом цитофлуориметрии связывания лимфоцитов периферической крови здорового донора с антигеном тиреопероксидазы, которая содержит L-азидогомоаланин.

На фиг. 2 приведена детекция методом цитофлуориметрии связывания лимфоцитов периферической крови больного серопозитивным АИТ с антигеном тиреопероксидазы, которая содержит L-азидогомоаланин.

На фиг. 3 приведена детекция методом цитофлуориметрии связывания лимфоцитов периферической крови больного серонегативным АИТ с антигеном тиреопероксидазы, которая содержит L-азидогомоаланин.

Далее заявителем приведено описание заявленного технического решения.

Заявленный технический результат достигают осуществлением заявленного способа диагностики аутоиммунного тиреоидита.

Заявленный способ осуществляется в целом по следующей последовательности действий:

1 – выделяют мононуклеарные клетки из венозной крови на градиенте плотности фиколл 1,077, например, с помощью центрифугирования;

2 – затем выделенные мононуклеарные клетки инкубируют с антигеном тиреопероксидазы, меченым L-азидогомоаланином в течение, например, 1 мин;

3 – затем проводят фиксацию инкубированных мононуклеарных клеток в 4% растворе параформальдегида в течение 15 мин;

4 – затем клетки отмывают и инкубируют в растворе 100 мМ сульфата меди (II) и 1 мкМ зеленого флуоресцентного красителя Alexa Fluor 488 в объеме 500 мкл в течение 15 мин; далее инкубированный образец центрифугируют 5 мин, после чего добавляют 500 мкл фосфатно-солевого буферного раствора, получают образец для анализа методом проточной цитофлуориметрии;

5 – затем мононуклеарные клетки отмывают и осуществляют выполнение их анализа с помощью проточной лазерной цитофлуориметрии в FL1-канале цитометра с монитором, при этом детектируют наличие или отсутствие флуоресценции, при этом устанавливают наличие или отсутствие связывания лимфоцитов с антигеном тиреопероксидазы;

6 – при наличии флуоресценции образца (в зоне, обозначенной на фиг. 2 под цифрой 2) диагностируют наличие аутоиммунного тиреоидита, при отсутствии флуоресценции образца (в зоне, обозначенной на фиг. 1 под цифрой 1) диагностируют отсутствие аутоиммунного тиреоидита.

Основываясь на вышеизложенном, представляется возможным сделать логически обоснованные выводы о том, что в заявленном техническом решении, в отличие от прототипа (где обнаружение аутореактивных лимфоцитов выполняют с использованием флуоресцентного комплекса антиген-МНС) для диагностики аутоиммунного тиреоидита используют анализ количества лимфоцитов в % (процентах), связанных с меченым L-азидогомоаланином антигеном тиреопероксидазы, с получением мгновенного и достоверного на 100% результата.

Далее приведена подробная последовательность действий заявленного способа:

1 – выделяют мононуклеарные клетки из венозной крови на градиенте плотности фиколл 1,077, например, с помощью центрифугирования, для чего:

выполняют известным способом отбор пробы крови из локтевой вены в объёме, например, 3 мл в пробирку, содержащую гепарин натрия;

затем разводят фосфатно-солевым буферным раствором в равных по объёму соотношениях;

далее берут пробирку, содержащую раствор градиента плотности (ρ) фиколл ρ = 1,077;

далее берут разведенную фосфатно-солевым буферным раствором пробу крови и аккуратно по стенке пробирки наносят её на фиколл;

далее разведенную пробу крови центрифугируют, например, в течение 40 мин при 1500 об/мин, получают фракцию мононуклеарных клеток венозной крови;

далее к полученной после центрифугирования суспензии (мононуклеарных клеток венозной крови) добавляют равный объем фосфатно-солевого буферного раствора и центрифугируют 5 мин при 1500 об/мин, получают клеточный осадок;

2 – далее к клеточному осадку добавляют 500 мкл фосфатно-солевого буферного раствора и содержимое пробирки перемешивают с получением гомогенного образца, в который добавляют 2 мкл меченого L-азидогомоаланином антигена тиреопероксидазы, получают клеточную суспензию, которую инкубируют 1 мин и центрифугируют 5 мин при 1500 об/мин,

3 – после чего клеточный осадок фиксируют в 4% растворе параформальдегида в течение 15 мин;

4 – далее фиксированные клетки отмывают путем центрифугирования, например, 5 мин, добавляют, например, 500 мкл раствора, содержащего 100 мМ сульфата меди (II) и 1 мкМ зеленого флуоресцентного красителя Alexa Fluor 488 и инкубируют 15 мин;

5 – затем мононуклеарные клетки отмывают путем центрифугирования в течение 5 мин, после чего добавляют 500 мкл фосфатно-солевого буферного раствора и осуществляют выполнение анализа с помощью проточной лазерной цитофлуориметрии в FL1-канале цитометра с монитором, при этом детектируют наличие или отсутствие флуоресценции, чем устанавливают наличие или отсутствие связывания лимфоцитов с антигеном тиреопероксидазы;

6 – при наличии флуоресценции образца (в зоне, обозначенной на Фиг. 2 под цифрой 2) диагностируют наличие аутоиммунного тиреоидита, при отсутствии флуоресценции образца (в зоне, обозначенной на фиг. 1 под цифрой 1) диагностируют отсутствие аутоиммунного тиреоидита.

Для пояснения заявленного технического решения приведены графики проточной цитофлуориметрии (см. фиг.1–3), где по оси x показана логарифмическая шкала интенсивности флуоресценции от 10⁰, до 10⁴, по оси у – количество клеток, под цифрой 1 показано процентное количество не связанных лимфоцитов с меченым L-азидогомоаланином антигеном тиреопероксидазы, а под цифрой 2 – процентное количество связанных лимфоцитов с меченым L-азидогомоаланином антигеном тиреопероксидазы.

На фиг. 1 показано процентное количество лимфоцитов, не связанных с меченой L-азидогомоаланином тиреопероксидазой, периферической крови здоровых доноров.

Характерные показатели лимфоцитов крови здорового донора следующие: отсутствие связывания с антигеном тиреопероксидазы.

На фиг. 2 показано процентное количество лимфоцитов, связанных с меченой L-азидогомоаланином тиреопероксидазой, периферической крови больного серопозитивным аутоиммунным тиреоидитом.

Показатели лимфоцитов крови больного серопозитивным аутоиммунным тиреоидитом следующие: наличие положительного сигнала связывания с антигеном тиреопероксидазы. Обнаружение в 5 - 99% популяции лимфоцитов.

На фиг. 3 показано процентное количество лимфоцитов, связанных с меченой L-азидогомоаланином тиреопероксидазой, периферической крови больного серонегативным аутоиммунным тиреоидитом.

Показатели лимфоцитов крови больного серонегативным аутоиммунным тиреоидитом следующие: наличие положительного флуоресцентного сигнала связывания с антигеном тиреопероксидазы. Обнаружение в 5-99% популяции лимфоцитов.

На основе анализа процента связанных с антигеном тиреопероксидазы лимфоцитов диагностируют наличие или отсутствие у диагностируемого пациента аутоиммунного тиреоидита. При наличии флуоресценции образца диагностируют наличие аутоиммунного тиреоидита, при отсутствии флуоресценции образца диагностируют отсутствие аутоиммунного тиреоидита. Разработанная технология позволяет детектировать наличие аутореактивных лимфоцитов как у больных серопозитивным аутоиммунным тиреоидитом, так и серонегативным аутоиммунным тиреоидитом.

Осуществление заявленного способа показывают приведенные примеры.

Пример 1. Способ диагностики аутоиммунного тиреоидита, т.е. выявление аутореактивных лимфоцитов, выполненное в соответствии с формулой заявленного технического решения

Больная Б.А.В, 23 года, страдает аутоиммунным тиреоидитом. Клинический эутиреоз, гипертрофическая форма. Впервые выявлен в 18 лет. Наследственность – аутоиммунный тиреоидит у матери, отца, бабушки по материнской линии и бабушки по отцовской линии. Сопутствующих аутоиммунных заболеваний не имеется. При клиническом обследовании: титр антител к тиреопероксидазе 2235 МЕ/мл, тироксин (Т4) свободный 14,33 пмоль/л, тиреотропный гормон (ТТГ) 2,56 мкМЕ/мл. При ультразвуковом обследовании: диффузное увеличение щитовидной железы, наличие множественных гипоэхогенных участков, единичные увеличенные подчелюстные лимфатические узлы с обеих сторон. Объем щитовидной железы 27,4 см³.

Была проведена повторная диагностика аутоиммунного тиреоидита по заявленному способу:

– известным способом произведен отбор пробы крови из локтевой вены в объёме 3 мл в пробирку, содержащую гепарин натрия (производства фирмы EUROTUBO, Spain);

– далее отобранную пробу крови развели фосфатно-солевым буферным раствором в равных соотношениях проба : буферный раствор = 1 : 1;

– далее взяли 50 мл пробирку (Nunc), содержащую раствор градиента плотности ρ фиколл (ρ = 1,077);

– далее взяли разведенную буферным раствором пробу крови и аккуратно по стенке пробирки нанесли её на фиколл;

– далее разведенную пробу крови центрифугировали в течение 40 мин в бакет-роторе при 1500 об/мин на центрифуге Eppendorf-5810R (ФРГ, г. Гамбург) с получением фракции мононуклеарных клеток;

– далее к полученной после центрифугирования фракции (мононуклеарных клеток периферической крови) добавили равный объем фосфатно-солевого буферного раствора и центрифугировали 5 мин при 1500 об/мин, получили клеточный осадок;

– далее к полученному клеточному осадку добавляют 500 мкл фосфатно-солевого буферного раствора и содержимое пробирки перемешивают с получением гомогенного образца, в гомогенный образец добавляют 2 мкл меченого L-азидогомоаланином антигена тиреопероксидазы, получают клеточную суспензию;

– далее клеточную суспензию инкубируют 1 мин и центрифугируют 5 мин при 1500 об/мин, после чего клеточный осадок фиксируют в 4% растворе параформальдегида в течение 15 мин;

– далее фиксированные клетки центрифугируют 5 мин, добавляют 500 мкл раствора, содержащего 100 мМ сульфата меди (II) и 1 мкМ зеленого флуоресцентного красителя Alexa Fluor 488 и инкубируют 15 мин;

– далее инкубированный образец центрифугируют 5 мин, после чего в образец добавляют 500 мкл фосфатно-солевого буферного раствора, получают образец для анализа методом проточной цитофлуориметрии;

– далее образец облучают лазерным лучом с длиной волны λ= 488 нм, результат облучения детектируют в FL-1 канале проточного цитометра и на экране монитора наблюдают наличие или отсутствие флуоресценции образца в виде диаграммы, например, фиг. 2;

– при наличии более 5% положительно флуоресцирующих клеток образца диагностируют аутоиммунный тиреоидит, при наличии менее 5% положительно флуоресцирующих клеток образца диагностируют отсутствие аутоиммунного тиреоидита.

По полученным данным проточной цитометрии по заявленному способу, 99% лимфоцитов связались с антигеном тиреопероксидазы, содержащем L-азидогомоаланиновую метку.

Наличие связанных с антигеном тиреопероксидазы, содержащем L-азидогомоаланиновую метку, лимфоцитов позволяет диагностировать наличие аутоиммунного тиреоидита. Диагноз, инструментально определенный по заявленному способу, достоверно совпадает с ранее поставленным диагнозом, установленным традиционными методами – с результатами физикального осмотра щитовидной железы, результатов лабораторных анализов крови и УЗИ исследований.

Пример 2. Способ диагностики аутоиммунного тиреоидита путем определения аутореактивных лимфоцитов

Больная А.Л.И., 21 год. Наследственность отягощена – у бабушки аутоиммунный тиреоидит. При клиническом обследовании: титр антител к тиореопероксидазе 3.51 МЕ/мл, тироксин (Т4) свободный 13.18 пмоль/л, тиреотропный гормон (ТТГ) 2.2816 мкМЕ/мл. В результате лечения на основе сомнительного диагноза заметных улучшений состояния больного не наблюдалось. При дополнительном УЗИ-обследовании: гипоплазия щитовидной железы. Объем щитовидной железы 9,1 см³.

Была проведена диагностика аутоиммунного тиреоидита по заявленному способу:

– известным способом произведен отбор пробы крови из локтевой вены в объёме 3 мл в пробирку, содержащую гепарин натрия (производства фирмы EUROTUBO, Spain);

– далее отобранную пробу крови развели фосфатно-солевым буферным раствором в равных объёмных соотношениях проба : буферный раствор = 1 : 1;

– далее взяли 50 мл пробирку (Nunc), содержащую раствор градиента плотности ρ фиколл (ρ = 1,077);

– далее взяли разведенную буферным раствором пробу крови и аккуратно по стенке пробирки нанесли её на фиколл;

– далее разведенную пробу крови центрифугировали в течение 40 мин в бакет-роторе при 1500 об/мин на центрифуге Eppendorf-5810R (ФРГ, г. Гамбург) с получением фракции мононуклеарных клеток;

– далее к полученной после центрифугирования фракции (мононуклеарных клеток периферической крови) добавляют равный объем фосфатно-солевого буферного раствора и центрифугируют 5 мин при 1500 об/мин, получают клеточный осадок;

– далее к клеточному осадку добавляют 500 мкл фосфатно-солевого буферного раствора и содержимое пробирки перемешивают с получением гомогенного образца, в гомогенный образец добавляют 2 мкл меченого L-азидогомоаланином антигена тиреопероксидазы, получают клеточную суспензию;

– далее клеточную суспензию инкубируют 1 мин и центрифугируют 5 мин при 1500 об/мин, после чего клеточный осадок фиксируют в 4 % растворе параформальдегида в течение 15 мин;

– далее фиксированные клетки центрифугируют 5 мин, добавляют 500 мкл раствора, содержащего 100 мМ сульфата меди (II) и 1 мкМ зеленого флуоресцентного красителя Alexa Fluor 488 и инкубируют 15 мин;

– далее инкубированный образец центрифугируют 5 мин, после чего в образец добавляют 500 мкл фосфатно-солевого буферного раствора, получают образец для анализа известным способом проточной цитофлуориметрии;

– далее образец облучают лазерным лучом с длиной волны λ= 488 нм, результат облучения детектируют в FL-1 канале проточного цитометра и на экране монитора наблюдают наличие или отсутствие флуоресценции образца в виде диаграммы, например, фиг. 2;

– при наличии более 5% положительно флуоресцирующих клеток образца диагностируют аутоиммунный тиреоидит, при наличии менее 5% положительно флуоресцирующих клеток образца диагностируют отсутствие аутоиммунного тиреоидита.

По полученным по заявленному способу данным проточной цитофлуориметрии 91,5% лимфоцитов связались с антигеном тиреопероксидазы, содержащим L-азидогомоаланиновую метку, что обеспечивает высокодостоверное диагностирование наличия аутоиммунного тиреоидита. Определенный инструментально методом УЗИ, диагноз достоверно совпадает с диагнозом по заявленному способу.

Диагноз, определенный инструментально по заявленному способу, не совпадает с ранее поставленным (без использования УЗИ) диагнозом, установленным на основании изучения симптомов заболевания, физикального осмотра щитовидной железы и результатов лабораторных анализов на обнаружение антител к тиреопероксидазе в сыворотке крови – по прототипу (недостатком прототипа является низкая специфичность выявления аутореактивных Т-лимфоцитов).

Заявленный способ, основанный на выявлении связанных с антигеном тиреопероксидазы и флуоресцирующих аутореактивных лимфоцитов обеспечивает однозначное диагностирование наличия аутоиммунного тиреоидита.

На основе диагноза, установленного с использованием заявленного способа, скорректирован лечебный процесс пациента. Через 6 месяцев лечения, согласно скорректированному курсу лечебного процесса, физикальные исследования показали положительные изменения течения болезни пациента – исчезла болезненность щитовидной железы при пальпации, улучшилось самочувствие пациента.

Улучшение состояния здоровья пациента свидетельствует о правильности диагноза и скорректированного курса лечения, установленного с использованием заявленного способа.

Заявитель поясняет, что Примеры 1 и 2 приведены в качестве иллюстрации и не ограничивают возможности осуществления заявленного способа для диагностики аутоиммунного тиреоидита.

Из описанных Примеров 1 и 2 можно сделать вывод, что заявителем достигнут заявленный технический результат, а именно: разработан способ диагностики аутоиммунного тиреоидита, расширяющий арсенал способов диагностики аутоиммунного тиреоидита, при этом достигнуто:

– повышение достоверности и точности диагностики путем использования антигена тиреопероксидазы с L-азидогомоаланиновой меткой и выявления от 5 % до 99 % аутореактивных лимфоцитов (Пример 1, Пример 2, фиг. 1, фиг. 2, фиг. 3), обнаружение аутореактивных лимфоцитов как при серопозитивном, так и при серонегативном аутоиммунном тиреоидите (Примеры 1, Пример 2, фиг. 2, фиг. 3);

– упрощение (более низкая ступенчатость и времязатратность) процесса осуществления диагностики;

– отсутствие необходимости привлечения особо высококвалифицированного персонала.

Заявленный способ применим для диагностики заболеваний в эндокринологии, и иммунологии для достоверной диагностики аутоиммунного тиреоидита при наличии сомнений в достоверности диагноза, например – вызванных неудовлетворительной результативностью лечебного процесса и/или в достоверности диагноза, ранее установленного на основе использования известных способов – физикальных исследований, лабораторных исследований крови, УЗИ диагностируемого лица.

Заявленное техническое решение удовлетворяет условию патентоспособности «новизна», предъявляемому к изобретениям, так как при определении уровня техники не обнаружено средство, которому присущи признаки, идентичные (то есть совпадающие по исполняемой ими функции и форме выполнения этих признаков) всем признакам, перечисленным в формуле изобретения, включая характеристику назначения.

Заявленное техническое решение изобретение удовлетворяет условию патентоспособности «изобретательский уровень», предъявляемому к изобретениям, поскольку не выявлены технические решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками данного изобретения, и не установлена известность влияния отличительных признаков на указанный технический результат.

Заявленное удовлетворяет условию патентоспособности «промышленная применимость», предъявляемому к изобретениям, так как его (техническое решение) возможно реализовать в промышленном производстве диагностического оборудования, в деятельности организаций здравоохранения, посредством использования известных стандартных технических устройств и оборудования.

Изобретение относится к медицине, а именно к эндокринологии и иммунологии, и может быть использовано для диагностики аутоиммунного тиреоидита. Выделяют мононуклеарные клетки из венозной крови на градиенте плотности фиколл 1,077, которые инкубируют с антигеном тиреопероксидазы, меченым L-азидогомоаланином. Проводят их фиксацию в 4% растворе параформальдегида в течение 15 мин. Отмывают их и инкубируют в растворе 100 мМ сульфата меди (II) и 1 мкМ зеленого флуоресцентного красителя Alexa Fluor 488 в объеме 500 мкл в течение 15 мин. Мононуклеарные клетки отмывают путем центрифугирования в течение 5 мин, после чего добавляют 500 мкл фосфатно-солевого буферного раствора. Осуществляют выполнение их анализа с помощью проточной лазерной цитофлуориметрии: образец облучают лазерным лучом с длиной волны 488 нм. Результат облучения детектируют в FL1-канале цитометра с монитором, при этом устанавливают связывание лимфоцитов с антигеном тиреопероксидазы. При наличии более 5% положительно флуоресцирующих клеток образца при облучении его лучом лазера диагностируют аутоиммунный тиреоидит. При наличии менее 5% положительно флуоресцирующих клеток образца диагностируют отсутствие аутоиммунного тиреоидита. Способ обеспечивает возможность диагностики аутоиммунного тиреоидита, при которой достигается повышение достоверности и точности диагностики аутоиммунного тиреоидита, упрощение (более низкая ступенчатость и времязатратность) процесса осуществления диагностики за счет анализа связывания лимфоцитов с антигеном тиреопероксидазы с L-азидогомоаланиновой меткой методом проточной лазерной цитофлуориметрии. 3 ил., 2 пр.

Способ диагностики аутоиммунного тиреоидита, заключающийся в том, что выделяют мононуклеарные клетки из венозной крови на градиенте плотности фиколл 1,077, которые инкубируют с антигеном тиреопероксидазы, меченым L-азидогомоаланином; затем проводят их фиксацию в 4% растворе параформальдегида в течение 15 мин; затем отмывают их и инкубируют в растворе 100 мМ сульфата меди (II) и 1 мкМ зеленого флуоресцентного красителя Alexa Fluor 488 в объеме 500 мкл в течение 15 мин; затем мононуклеарные клетки отмывают путем центрифугирования в течение 5 мин, после чего добавляют 500 мкл фосфатно-солевого буферного раствора и осуществляют выполнение их анализа с помощью проточной лазерной цитофлуориметрии: образец облучают лазерным лучом с длиной волны 488 нм, результат облучения детектируют в FL1-канале цитометра с монитором, при этом устанавливают связывание лимфоцитов с антигеном тиреопероксидазы; при наличии более 5% положительно флуоресцирующих клеток образца при облучении его лучом лазера диагностируют аутоиммунный тиреоидит, при наличии менее 5% положительно флуоресцирующих клеток образца диагностируют отсутствие аутоиммунного тиреоидита.