СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ АСПИРИНОВОЙ ФОРМЫ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЫ Российский патент 1995 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к клинической медицине, в частности к пульмонологии, и касается дифференциальной диагностики форм бpонхиальной астмы.

Уже известно применение провокационного теста с аспирином при диагностике in vivo аспириновой бронхиальной астмы и гиперчувствительности к тестероидным противовоспалительным препаратам у части больных, причем при положительной пробе диагноз гиперчувствительности к аспирину считался достоверным (Припутенова Зденка. Эффективность различных схем десенситизации аспирином и исследование роли метаболитов арахидоновой кислоты в патогенезе аспириновой бронхиальной астмы. Дисс. канд. мед. наук. М. 1990, с. 34-45). Однако данный способ диагностики в значительной степени опасен, поскольку использование аспирина провоцирует ухудшение состояния больного, сопровождающееся развитием реакций непереносимости крапивницей, ухудшением дыхания, удушьем. Практически в клинике данный способ используется с очень большими ограничениями.

С целью диагностики in vitro непереносимости нестероидных противовоспалительных препаратов, а также выявления прямого цитотоксического действия продуктов реакции нестероидных противовоспалительных препаратов с кровью больного аспириновой астмой на иммунокомпетентные клетки, использовали метод исследования энергетического состояния мембран тимоцитов крысы с помощью флюоресцентного зонда катиона 4-(n-диметиламиностирил)-1-метилпиридиний (Захаржевская Т. В. Дифференцированная терапия различных вариантов течения аспириновой астмы: Автореф. дисс. канд. мед. наук. М. 1990, с. 78). Сущность способа заключается в том, что деполяризация плазматической мембраны приводит к падению интенсивности флюоресценции зонда-катиона. Коэффициент снижения доли светящихся клеток достоверно отличался от показателя, полученного у здоровых лиц и у больных с другими формами бронхиальной астмы, не чувствительными к нестероидным противовоспалительным препаратам. Флюоресцентный тест осуществлялся параллельно с аспириновой пероральной пробой.

Другим лабораторным тестом in vitro для диагностики непереносимости нестероидных противовоспалительных препаратов у больных бронхиальной астмой может служить исследование спектра и биологической активности высвобождаемых лейкотриенов из лейкоцитов периферической крови, предынкубированных с индометацином (Сулаквелидзе И.В. Изучение клинико-патогенетических особенностей и терапии аспириновой бронхиальной астмы. Дисс. канд. мед. наук. М. 1987, с. 35-39, 64-86). Инкубация лейкоцитов с индометацином приводила к продукции лейкотриенов, определяемых биологическими методами только у больных аспириновой бронхиальной астмой. Биологическая активность лейкотриенов колебалась от 0,32 до 1,3 ед. в среднем 0,92+0,16 ед. Десенситизация больных аспирином устраняла эту извращенную реакцию на индометацин.

Для дифференциальной диагностики атопических и псевдоаллергических реакций на НПВП рекомендуется определение циклического аденозинмонофосфата в обогащенной тромбоцитами плазме, предынкубированной с препаратом, до и после действия индукторов агрегации (Астафьева Н.Г. Роль тромбоцитов в развитии аллергических заболеваний. Дисс. докт. наук. М. 1989, с. 124-134, 349-351). Циклические нуклеотиды определялись радиоиммунным методом, использовали коммерческие наборы для радиоиммунного определения циклического аденозинмонофосфата. Базальные уровни циклических нуклеотидов в тромбоцитах больных с непереносимостью нестероидных противовоспалительных препаратов не отличались от контрольной группы. Наиболее яркой отличительной особенностью больных аспириновой астмой было аномальное увеличение уровня циклического аденозинмонофосфата в тромбоцитах при АДФ -- (аденозин-5'-дифосфат)- и адреналининдуцированной агрегации, что легло в основу способа диагностики аллергической реакции на препарат.

Несмотря на, казалось бы, значительное количество предлагавшихся методик диагностики, а также применение их в совокупности, установление точного диагноза аспириновой бронхиальной астмы представляет собой довольно сложную задачу на сегодня, поскольку врач щадит больного, а применение методов в совокупности нередко дает противоречивые результаты.

Целью изобретения является сокращение времени и объективизация диагностики аспириновой бронхиальной астмы.

Эта цель достигается тем, что регистрируют контрольную кривую АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов и кривые АДФ-индуцированной агрегации, полученные после предынкубации обогащенной тромбоцитами плазмы с нитропруссидом в концентрациях от 10^-5 М до 10^-4 М, и в случае практического совпадения получаемых кривых диагностируют аспириновую бронхиальную астму.

На фиг.1 представлены кривые зависимости показателя максимальной агрегации, индуцированной АДФ, в тромбоцитах контрольной группы (1), у больных атопической бронхиальной астмой (2) и у больных аспириновой бронхиальной астмой (3) от концентрации нитропруссида, что имеет непосредственное отношение к описываемому методу диагностики аспириновой бронхиальной астмы; на фиг.2 агрегатограммы здорового донора при действии различных концентраций нитропруссида; на фиг.3, 4, 5 агрегатограммы конкретных больных, истории болезни которых приводятся в данном описании.

П р и м е р 1. Больная Д. 50 лет, история болезни N 4626. Поступила в отделение пульмонологии 57 ГКБ г. Москвы 31.03.1992. Клинический диагноз: бронхиальная астма, аспириновая форма, тяжелое течение, стадия обострения, хронический обструктивный бронхит, обострение, эмфизема легких, пневмосклероз, ДН₂, поливалентная лекарственная непереносимость.

При поступлении больную беспокоил кашель с выделением слизисто-гнойной мокроты, затрудненное дыхание. Из анамнеза известно, что первые приступы удушья появились в 1989 гду. С 1990 года постоянно принимает кортикостероидные препараты. Частые госпитализации (4-5 раз в году), дважды развивался астматический статус на прием анальгетиков.

Аллергологический анамнез: непереносимость анальгина, йода, сульфаниламидов, нистатина, кефзола, клафорана, линкомицина, пенициллина, димедрола, сурастина, тавегила. Из пищевых продуктов не переносит мед, клубнику, шоколад. Больной проведено исследование агрегации тромбоцитов венозной крови.

Исследование проводилось на анализаторе агрегации тромбоцитов методом изучения кинетики агрегации тромбоцитов, основанном на анализе флюктуаций светопропускания образца суспензии, вызванных изменениями числа частиц в оптическом канале устройства, разработанном НИИ Экспериментальной кардиологии КНЦ РАМН (Москва) (З.А.Габбасов, Е.Г.Попов, И.Ю.Гаврилов, Е.Я.Позин, Р.А.Маркосян. Новый методический подход к исследованию агрегации тромбоцитов in vitro, БЭБМ, 1989, N 10, с. 437-439).

При исследовании использовали программу АGGR, предназначенную для автоматизации работы анализатора агрегации. Она позволяет отображать процесс агрегации на экране и в ходе эксперимента, записывать результаты эксперимента на диск и предоставляет возможности для их дальнейшего просмотра и обработки. Программа рассчитана на IВМ ХТ/АТ совместимый компьютер, работающий под управлением операционной системы MS-DOS 3,0 или выше.

На фиг.1 представлены данные контрольной группы при концентрациях нитропруссида 10^-5 М, 3 ˙ 10^-5 М, 10^-4 М. Видно, что показатель АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов понижается, соответственно, на 28% 44% 55% Обнаружить отличия в действии активатора гуанилатциклазы (нитропруссида) на АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов в группе больных атопической бронхиальной астмой при всех использованных концентрациях нитропруссида не смогли.

Обнаружено, что в отличие от контрольной групы и группы больных атопической бронхиальной астмой, тромбоциты больных аспириновой бронхиальной астмой практически не чувствительны к действию нитропруссида при всех изученных концентрациях. Выявленная нами абсолютная потеря чувствительности к нитропруссиду у больных аспириновой бронхиальной астмой взята нами за основу лабораторного теста in vitro на аспириновую бронхиальную астму.

Для сравнения на фиг.2 представлены агрегатограммы здорового донора: контрольная (1) и при действии нитропруссида в концентрациях 10^-5 М (2), 3 ˙ 10^-5 М (3), 10^-4 М (4). Совершенно очевидно, что в зависимости от концентрации нитропруссида форма кривой существенно изменяется. Аналогичные кривые получены и при исследовании агрегации тромбоцитов больных атопической бронхиальной астмой, в то время как у больных аспириновой бронхиальной астмой никакого изменения кривых в зависимости от изменения концентрации нитропруссида практически не происходит, что, в частности, будет показано ниже на примере обследования описываемой больной Д (фиг.3).

Для исследования агрегации тромбоцитов кровь больной Д. в количестве 5 мл получали пункцией локтевой вены, стабилизировали 0,13 М (рН 7,4) раствором цитрата натрия в соотношении 1:9 и центрифугировали при 200 g 10 мин. Супернатант в количестве 1,5 мл осторожно отбирали из центрифужной пробирки пластиковой пипеткой в отдельную пластиковую пробирку. Для приготовления обедненной тромбоцитами плазмы проводили повторное центрифугирование крови при 200 g в течении 15 мин, затем отбирали 1,5 мл верхнего слоя в отдельную пластиковую пробирку. Проводили калибровку прибора. Богатую тромбоцитами плазму получали путем разбавления супернатанта аутологичным образцом обедненной тромбоцитами плазмы в соотношении 1:1. Подготовленную к исследованию богатую тромбоцитами плазму разливали по 300 мкл в кюветы для агрегометра. Все процедуры приготовления богатой тромбоцитами плазмы и исследование агрегации тромбоцитов проводили при температуре 29^оС. При исследовании использовали следующие препараты АДФ ("Вoegringer", Германия), нитропруссид ("Sigma", США), ЭДТА ("Serva", Германия).

За три минуты до начала измерений образец богатой тромбоцитами плазмы помещали в кюветное отделение агрегометра и инкубировали при заданной температуре. Добавляли 10 мкл Н20 и предынкубировали образец 2 мин, после чего добавляли 2,5 мкМ АДФ и регистрировали кривую агрегации тромбоцитов. Затем предынкубировали следующий образец богатой тромбоцитами плазмы 2 мин с нитропруссидом в концентрации 10^-5 М, после чего добавляли 2,5 мкМ АДФ и регистрировали следующую кривую агрегации. Аналогичную процедуру проделывали с образцами богатой тромбоцитами плазмы при концентрации нитропруссида 3 ˙ 10^-5 М и 10^-4 М. Получали четыре агрегатограммы, первая из которых является контрольной. На основании практически полного совпадения кривых диагностировали аспириновую бронхиальную астму. Это подтверждалось и значением показателя максимальной агрегации, который рассчитывался как отношение максимальной амплитуды агрегации с нитропруссидом к максимальной амплитуде агрегации в отсутствии нитропруссида (контроль с Н₂О это значение принималось за 100%).

На фиг. 3 представлены агрегатограммы больной Д. контрольная (1) и в присутствии нитропруссида в концентрациях 10^-5 М (2), 3 ˙ 10^-5 М (3), 10^-4 М (4).

Таким образом, применение заявленного способа позволило подтвердить ранее поставленный диагноз аспириновой бронхиальной астмы.

П р и м е р 2. Больной 3. 30 лет, история болезни N 9040. Поступил в аллергологическое отделение 57 ГКБ г. Москвы 25.06.1992. Клинический диагноз: бронхиальная астма, аспириновая форма, течение средней тяжести, обострение, хронические бронхит, обострение, эмфизема легких, пневмосклероз, ДН₂.

Из анамнеза известно, что в 1986 году появились первые приступы удушья, в этот же период появилась непереносимость анальгина, аспирина. Страдает полипозным риносинуситом. Больному проведено исследование агрегации тромбоцитов по описанному выше методу.

На фиг. 4 представлены агрегатограммы больного 3. контрольная (1) и в присутствии нитропруссида в концентрациях 10^-5 М (2), 3 ˙ 10^-5 М (3), 10^-4 М (4).

Применение заявленного способа позволило подтвердить ранее поставленный диагноз аспириновой бронхиальной астмы.

П р и м е р 3. Больная К. 57 лет, история болезни N 9101. Поступила в аллергологическое отделение 57 ГКБ г. Москвы 26.06.1992. Клинический диагноз: бронхиальная астма, аспириновая форма, течение средней тяжести, обострение.

Из анамнеза известно, что в 1982 году впервые появились приступы удушья. С 1986 года полипозный риносинусит. В марте 1992 года после приема седалгина развился приступ удушья. Больной проведено исследование агрегации тромбоцитов.

На фиг. 5 представлены агрегатограммы больной К. контрольная (1) и в присутствии нитропруссида в концентрациях 10^-5 М (2), 3 ˙ 10^-5 М (3), 10^-4 М (4).

Предложенным способом диагностики у больной была установлена аспириновая форма бронхиальной астмы. Больной даны рекомендации по лечению, питанию. Проведен тромбоцитаферез с положительным эффектом.

Способ диагностики отработан в клинике внутренних болезней РГМУ на базе 57 КГБ г. Москвы совместно с отделом клинико-экспериментальной биофизики и генетики НИИ пульмонологии МЗРФ.

Впервые выполнено исследование АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов у больных бронхиальной астмой на фоне действия нитропруссида (активатора гуанилатциклазы), отличающееся принципиальной новизной.

Разработанный способ диагностики аспириновой бронхиальной астмы явился результатом кропотливых и длительных исследований по изучению АДФ-индуцированной агрегации тромбоцидов у больных бронхиальной астмой на фоне действия форсколина (активатора аденилатциклазы), нитропруссида (активатора гуанилатциклазы), теофиллина (ингибитора фосфодиэстеразы), причем факт абсолютной потери чувствительности к нитропруссиду у больных аспириновой бронхиальной астмой и как следствие этого совпадение агрегатограмм (контрольной и в присутствии нитропруссида в различных концентрациях) в значительной мере оказался неожиданным для специалистов, работающих в данной области. Именно этот факт был использован при разработке способа диагностики, что придало ему явную неочевидность и позволило упростить диагностику без причинения какого-либо вреда обследуемому больному.

Способ может быть легко освоен практически любыми биохимическими лабораториями больничных учреждений, он прост в исполнении, относительно дешев, позволяет использовать персональный компьютер для хранения информации о больном в процессе динамического наблюдения. Способ непосредственно готов к использованию в практической деятельности.

Использование: в медицине для диагностики аспириновой бронхиальной астмы. Сущность изобретения: регистрируют контрольную кривую АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов венозной крови больных бронхиальной астмой и кривые АДФ-индуцированной агрегации после предъинкубации с различными концентрациями нитропруссида (10^-5-10^-4 м) В случае совпадения получаемых кривых диагностируют аспириновую бронхиальную астму. Это подтверждается показателем максимальной агрегации, который рассчитывается как отношение максимальной амплитуды агрегации с нитропруссидом к максимальной амплитуде агрегации в его отсутствии (контроль с H₂O это значение принимается за 100%). 5 ил.

СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ АСПИРИНОВОЙ ФОРМЫ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЫ путем исследования агрегации тромбоцитов венозной крови, отличающийся тем, что регистрируют контрольную кривую АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов и кривые АДФ-индуцированной агрегации, полученные после предъинкубации обогащенной тромбоцитами плазмы с нитропруссидом в концентрациях 10^-5 10^-4 М, и в случае практического совпадения получаемых кривых диагностируют аспириновую бронхиальную астму.