СПОСОБ ОЦЕНКИ АГРЕГАЦИОННЫХ СВОЙСТВ ТРОМБОЦИТОВ Российский патент 2003 года по МПК G01N33/86 

Изобретение относится к медицине, а точнее - к гемостазиологии, и предназначено для оценки функциональных свойств тромбоцитов (кровяных пластинок) - их способности к агрегации. Предложенное техническое решение может быть использовано в комплексе с другими тестами для исследования системы гемостаза с целью диагностики нарушений процессов свертывания крови и контроля эффективности проводимых лечебных мероприятий, а также в экспериментальной медицине при испытании новых антиагрегационных фармакологических препаратов.

Известны способы оценки агрегационных свойств тромбоцитов. Наиболее простые из них - "ручные" методы: после добавления в пробирку с плазмой, содержащей тромбоциты, индуктора агрегации кровяных пластинок (АДФ - аденозиндифоофат, адреналин, коллаген, ристомицин и т.д.) включают секундомер и фиксируют время появления агрегатов тромбоцитов в виде мелкодисперсных хлопьев (Смоляницкий А.Я. Методы исследования системы гемостаза // Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник / Под ред. В.В. Меньшикова. - М.: Медицина, 1987, c.152-154). Однако характер информации, получаемый этим способом, крайне недостаточен и не соответствует современным требованиям оценки агрегационных свойств тромбоцитов.

Наиболее близким к предлагаемому техническому решению является способ оценки агрегационных свойств кровяных пластинок с помощью анализатора агрегации тромбоцитов, оснащенного компьютером и соответствующим программном обеспечением (Анализатор агрегации тромбоцитов АР 2110. Инструкция по определению агрегационной активности тромбоцитов. - Минск, 1995). При этом процесс агрегации, сопровождающийся снижением оптической плотности анализируемого образца, непрерывно регистрируется, и получаемые результаты представляются в виде кривой агрегации тромбоцитов, характеризующей кинетику этого процесса. По окончании процедуры сканирования препарата на агрегатограмме фиксируется показатель степени агрегации тромбоцитов (%) и скорости агрегации кровяных пластинок за первые 30 с процесса агрегации клеток (%/мин). Агрегация проводится как минимум с двумя индукторами агрегации - АДФ (по характеру кривой судят о способности тромбоцитов к агрегации) и коллагеном (оценка секреторной функции тромбоцитов - "реакция высвобождения"). При этом для оценки агрегационной способности тромбоцитов последовательно используют растворы АДФ в двух или трех вариантах концентрации реагента - в низкой, средней и высокой дозе.

Однако метод имеет недостатки. Часть признаков агрегатограммы является качественной: исследователь выносит суждение о характере агрегации тромбоцитов под влиянием АДФ по внешнему виду кривой агрегатограммы (отмечается, имеется или нет спад кривой после достижения максимума снижения оптической плотности образца (реакция дезагрегации), имеется или нет второй волны агрегации после первой ("реакция высвобождения"). При исследовании секреторной способности кровяных пластинок оценивается такой качественный признак, как наличие или отсутствие на агрегатограмме кривой, характеризующей кинетику "реакции высвобождения" при индукции агрегации тромбоцитов коллагеном.

Кроме того, к недостаткам способа-прототипа следует отнести то, что анализируемые исследователем показатели агрегации тромбоцитов - степень агрегации (%), скорость агрегации (%/мин) и качественные признаки агрегатограммы, упомянутые выше, не объединены между собой, и агрегационная способность кровяных пластинок не оценивается в целом каким-либо интегральным показателем.

Задачей настоящего изобретения является создание интегрального показателя для комплексной оценки состояния агрегационных свойств тромбоцитов, основанного на результатах измерения количественных и качественных параметров агрегатограммы, что позволит объективизировать и повысить диагностическую значимость способа для характеристики агрегационных свойств кровяных пластинок.

Эта задача решается за счет того, что для индукции агрегации тромбоцитов используют только низкую дозу АДФ, которую подбирают заранее опытным путем на образцах плазмы крови здоровых людей, а показатели, характеризующие степень и скорость агрегации тромбоцитов, записывают в виде коэффициентов K₁-К₄ и рассчитывают интегральный показатель агрегации тромбоцитов (ИПАТ, усл. ед.) по формуле
ИПАТ=K₁+К₂+К₃+К₄+Z,
где K₁ - отношение степени агрегации тромбоцитов у обследуемого в условиях индукции агрегации АДФ к среднему арифметическому аналогичного показателя здоровых людей;
К₂ - отношение скорости агрегации тромбоцитов у обследуемого в условиях индукции агрегации АДФ к среднему арифметическому аналогичного показателя здоровых людей;
К₃ - отношение степени агрегации тромбоцитов у обследуемого в условиях индукции агрегации коллагеном к среднему арифметическому аналогичного показателя здоровых людей;
К₄ - отношение скорости агрегации тромбоцитов у обследуемого в условиях индукции агрегации коллагеном к среднему арифметическому аналогичного показателя здоровых людей, а качественные признаки агрегатограмм выражают в виде количественного параметра Z, где
Z - "+2" - регистрация второй волны агрегации тромбоцитов или отсутствие феномена дезагрегации при индукции процесса АДФ;
Z - "-2" - отсутствие волны агрегации тромбоцитов при индукции процесса коллагеном;
Z - "0" - отсутствие на агрегатограмме патологических качественных признаков,
и при значении ИПАТ в пределах 1,6-5,5 ед. агрегационную способность тромбоцитов оценивают как нормальную, свыше 5,5 ед. - как повышенную, а ниже 1,6 ед. - как пониженную.

Способ осуществляют следующим образом. У пациентов, страдающих тем или иным заболеванием, из локтевой вены забирают кровь, отделяют плазму и с применением известной методики готовят образцы тромбоцитов для анализа. Процесс агрегации тромбоцитов проводят по известной методике с помощью АДФ в низкой дозе и коллагена, а кинетику процесса агрегации кровяных пластинок регистрируют с помощью агрегометра (Анализатор агрегации тромбоцитов АР 2110. Инструкция по определению агрегационной активности тромбоцитов. - Минск, 1995). Низкая доза АДФ - минимальная концентрация АДФ, при которой у здоровых людей получают одноволновую спадающую кривую агрегации (агрегация с последующей дезагрегацией), что свидетельствует о нормальных агрегационных свойствах тромбоцитов. Доза АДФ подбирается в зависимости от фирмы-изготовителя реагента, так как на активность препарата влияют степень чистоты реактива и особенности технологии его изготовления. В наших исследованиях используется набор реагентов (АДФ и растворитель), выпускаемый фирмой "Технология-Стандарт" (г. Барнаул) при конечной концентрации АДФ в реакционной кювете 1,25 мкг/мл, которая по данным фирмы-поставщика набора АДФ является низкой дозой реагента (Инструкция по применению АДФ). Для оценки секреторной функции тромбоцитов применяют известный метод агрегации кровяных пластинок коллагеном. С этой целью в наших исследованиях используют набор реагентов (коллаген и растворитель), выпускаемый фирмой "Технология-Стандарт" (г. Барнаул) при конечной концентрации коллагена в реакционной кювете 2 мг/мл (Инструкция по применению коллагена). В условиях нормы при индукции агрегации тромбоцитов коллагеном наблюдается отчетливо выраженная кривая агрегации, которая постепенно спадает после достижения того или иного уровня степени агрегации.

Результаты агрегатограммы трактуют следующим образом. Увеличение степени агрегации (%) свидетельствует о возрастании агрегационных свойств тромбоцитов, уменьшение параметра - о снижении способности кровяных пластинок к агрегации. Увеличение скорости агрегации за первые 30 с регистрации агрегатограммы (%/мин) отражает высокие темпы агрегации тромбоцитов, то есть свидетельствует о повышении агрегационных свойств клеток. Уменьшение этого параметра - о понижении темпов агрегации кровяных пластинок, отражающих снижение способности тромбоцитов к агрегации. Наличие второй волны агрегации при индукции процесса АДФ в низкой дозе свидетельствует о гиперагрегации, равно, как и отсутствие феномена дезагрегации. В последнем случае кривая кинетики процесса, достигнув того или иного уровня степени агрегации, в дальнейшем до конца регистрации агрегатограммы выявляется как горизонтальная линия без спада.

Увеличение степени агрегации кровяных пластинок при индукции этого процесса коллагеном свидетельствует о возрастании способности тромбоцитов участвовать в "реакции высвобождения", и, следовательно, о высоких потенциальных способностях клеток высвобождать в окружающую среду специфическое содержимое гранул тромбоцитов, а снижение этого показателя - о противоположном эффекте. Аналогичная трактовка результатов исследования приемлема и при анализе скорости агрегации тромбоцитов в условиях индукции процесса коллагеном.

Так как показатели степени и скорости агрегации тромбоцитов являются разноразмерными величинами, а наличие второй волны агрегации в случае индукции процесса АДФ в низкой дозе или отсутствие волны агрегации клеток под влиянием коллагена - качественными признаками, то значения анализируемых параметров записывают в виде относительных величин - коэффициентов K₁-К₄, а качественным признакам присваивают определенные баллы. При этом K₁=X₁/M₁, где X₁ - найденное значение степени агрегации тромбоцитов у обследуемого при индукции процесса АДФ в низкой дозе, M₁ - среднее арифметическое значение аналогичного показателя, заранее вычисленное на основании данных, полученных при обследовании группы здоровых людей; К₂=Х₂/М₂, где Х₂ - скорость агрегации тромбоцитов у обследуемого при индукции процесса АДФ в низкой дозе, М₂ - средняя арифметическая величина аналогичного параметра здоровых людей; К₃= Х₃/М₃, где Х₃ - выявленное значение степени агрегации тромбоцитов у обследуемого при индукции процесса агрегации коллагеном, М₃ - средняя арифметическая аналогичного параметра у здоровых людей; К₄=Х₄/М₄, где Х₄ - скорость агрегации тромбоцитов при индукции процесса коллагеном, М₄ - средняя арифметическая аналогичного параметра у здоровых людей.

Качественным признакам (Z) присваивают баллы, которые имеют размерность со знаком "+" и "-". Признаки, свидетельствующие о гиперагрегации (наличие второй волны или отсутствие феномена дезагрегации тромбоцитов при индукции процесса агрегации кровяных пластинок АДФ в низкой дозе), приобретают знак "+" (+2) - оптимальное значение числа баллов при апробировании предложенного теста от +1 до +3. Признак, отражающий отсутствие секреторной способности тромбоцитов при индукции процесса коллагеном (отсутствие волны агрегации), получает знак "-" (-2) - оптимальное значение баллов при апробации предлагаемого теста от -1 до -3. Z=0, если качественные признаки на кривых агрегатограмм, свидетельствующие о патологии агрегационных свойств тромбоцитов, отсутствуют.

Рассчитывают интегральный показатель агрегации тромбоцитов (ИПАТ, усл. ед.) по формуле
ИПАТ=K₁+K₂+К₃+К₄+Z
и при значении показателя в пределах 1,62-5,50 ед. (М±2σ, где М - средняя арифметическая, σ - среднеквадратическое отклонение - сигма) агрегационную способность тромбоцитов оценивают как находящуюся в пределах нормы. Если ИПАТ превышает 5,50 ед., то диагностируют гиперагрегацию, а падение показателя ниже 1,62 ед. свидетельствует о снижении агрегационных свойств кровяных пластинок. При формулировке заключения по результатам агрегатограммы представляется целесообразным давать более подробную оценку ИПАТ в пределах физиологической нормы: при размахе ИПАТ от 2,60 до 4,52 ед. показатель рекомендуется оценивать как находящийся в пределах оптинормы (интервал ИПАТ от М-σ до М+σ), от 4,53 до 5,50 ед. - в верхнем диапазоне нормы (интервал от М+σ до М+2σ), а в интервале от 1,62 до 2,59 ед. - в нижнем диапазоне нормы (интервал от М-2σ до М-σ).

Основанием для определения референтных границ ИПАТ явились результаты определения способности тромбоцитов к агрегации у здоровых людей (контрольная группа). В условиях нормы анализируемый параметр варьировал в пределах от 1,62 до 5,50 ед. (М±2σ) при средней арифметической показателя 3,56±0,279 ед. (М±m, где М - средняя арифметическая, m - ошибка средней арифметической). Обследование пациентов, находившихся на лечении в специализированной ортопедо-хирургической клинике НИИ травматологии и ортопедии по поводу коксартроза и асептического некроза головки бедренной кости (АНГБК), позволило выявить у части больных нарушение агрегационных свойств тромбоцитов (см. таблицу). В 8 случаях из 17 обследованных зафиксирована гиперагрегация тромбоцитов: ИПАТ у этой группы пациентов составил 8,67±0,836 ед., а в 2 случаях - снижение агрегационных свойств кровяных пластинок (ИПАТ 1,21±0,207 ед. ). Остальные пациенты (7 человек) не имели нарушений агрегационных свойств тромбоцитов и ИПАТ у больных этой группы был в пределах нормы (3,66±0,485 ед.). В таблице видно, что ИПАТ у больных с гипер- и гипоагрегацией тромбоцитов статистически значимо различались как между собой (р₆<0,001), так и в сравнении с контрольной группой (р₂ и р₃<0,001). При этом анализируемый показатель у части больных, страдающих коксартрозом и АНГБК, у которых зафиксирована гиперагрегация тромбоцитов, превышал ИПАТ в контрольной группе в 2,4 раза, а у пациентов с гипоагрегацией кровяных пластинок, напротив, этот параметр был ниже усредненной величины ИПАТ в группе контроля в 2,9 раза. Различие показателей у больных с гипер- и гипокоагуляцией тромбоцитов достигало более семикратной величины (7,2 раза).

Ниже представлено несколько примеров, иллюстрирующих диагностические возможности предложенного способа оценки агрегационных свойств тромбоцитов.

Пример 1
Пациент Я-в С.Г., 40 лет (ист. б-ни N 194141) поступил в ННИИТО 16.10.00 г. на оперативное лечение по поводу асептического некроза головки бедренной кости. В связи с предстоящей операцией протезирования левого тазобедренного сустава больному проведено исследование состояния системы гемостаза, в том числе определена агрегационная способность тромбоцитов. По данным анализа агрегатограммы агрегационная способность тромбоцитов оказалась в пределах нормы (ИПАТ=4,6 ед.).

Пример 2
Больная Ш-ва Е.А., 34 лет (ист. б-ни N 193961) поступила в ННИИТО из г. Кирова на лечение по поводу двустороннего асептического некроза головок бедренных костей. Сопутствующее заболевание - системная красная волчанка в стадии ремиссии. По данным исследования агрегации тромбоцитов диагностирована гиперагрегация кровяных пластинок (ИПАТ=9,177 ед.). При этом на агрегатограмме в условиях индукции процесса АДФ в низкой доза зафиксирована вторая волна агрегации клеток ("реакция высвобождения"). Полученные данные о повышенной способности тромбоцитов к агрегации является показанием для назначения курса терапии дезагрегантами в пред- и послеоперационном периоде с целью профилактики возможной тромбоэмболии. Следует заметить, что системная красная волчанка относится к категории хронических заболеваний-индукторов, которые могут провоцировать активацию латентных форм нарушений в системе свертывания крови и при различных неблагоприятных условиях быть тригером в развитии патологии коагуляционного гомеостаза.

Пример 3
Больной Т-ов Ю.П., 44 лет (ист. б-ни N 192123) поступил в ННИИТО из г. Мурома 22.05.00 г. на оперативное лечение по поводу двустороннего асептического некроза головок бедренных костей. В связи с предстоящей операцией эндопротезирования тазобедренного сустава у пациента исследовано состояние системы гемостаза, в том числе определена агрегационная способность тромбоцитов. Выявлена гипоагрегация тромбоцитов (ИПАТ= 1,090 ед.). При этом на агрегатограмме при индукции процесса коллагеном зафиксировано отсутствие волны агрегации (секреторной способности) тромбоцитов. Низкие значения ИПАТ явились основанием для отмены антиагрегантов (аспирина), которые больной получал в предоперационном периоде.

Вышеизложенное свидетельствует об адекватности, высокой чувствительности и пользе метода для объективной оценки агрегационной способности тромбоцитов. Наиболее существенным достоинством предложенного метода является возможность количественного выражения меры агрегационных свойств тромбоцитов интегральным параметром, рассчитанным на основании результатов комплекса различных показателей агрегатограммы. Предлагаемый способ позволяет проводить статистический сравнительный анализ вариационных рядов ИПАТ, например, при различных методах лечения нарушений системы гемостаза, контролировать динамику патологического процесса и следить за эффективностью лечебных мероприятий. Способ может быть использован как в практической, так и экспериментальной медицине.

Вместе с тем необходимо подчеркнуть, что способ не предназначен для специализированных гематологических клиник, занимающихся диагностикой и лечением больных с некоторыми врожденными нарушениями функций тромбоцитов (болезнь Виллебранда, синдром бернара-Сулье), для диагностики которых в качестве индуктора агрегации тромбоцитов дополнительно используют ристомицин.

Изобретение относится к области медицины, в частности к гемостазиологии. Способ позволяет объективизировать и повысить его диагностическую значимость для характеристики агрегационных свойств кровяных пластинок. Проводят забор крови, отделение плазмы и подготовку ее для анализа, индукцию агрегации тромбоцитов АДФ и коллагеном, запись агрегатограммы с регистрацией значений степени и скорости агрегации тромбоцитов, при этом рассчитывают интегральный показатель агрегации тромбоцитов (ИПАТ, усл.ед.) по формуле ИПАТ= K₁+К₂+К₃+К₄+Z, где К₁ - отношение степени агрегации тромбоцитов у обследуемого в условиях индукции агрегации АДФ к среднему арифметическому аналогичного показателя здоровых людей; К₂ - отношение скорости агрегации тромбоцитов у обследуемого в условиях индукции агрегации АДФ тромбоцитов к среднему арифметическому аналогичного показателя здоровых людей; К₃ - отношение степени агрегации тромбоцитов у обследуемого в условиях индукции агрегации коллагеном среднему арифметическому аналогичного показателя здоровых людей; К₄ - отношение скорости агрегации тромбоцитов у обследуемого в условиях индукции агрегации коллагеном к среднему арифметическому аналогичного показателя здоровых людей, а качественные признаки агрегатограмм выражают в виде количественного параметра Z, где Z - "+2" - регистрация второй волны агрегации тромбоцитов при индукции процесса АДФ или отсутствии феномена дезагрегации; Z - "-2" - отсутствие волны агрегации тромбоцитов при индукции процесса коллагеном; Z - "0" - отсутствие на агрегатограмме патологических качественных признаков, и при значении ИПАТ в пределах 1,6-5,5 ед. агрегационную способность тромбоцитов оценивают как нормальную, свыше 5,5 ед. - как повышенную, а ниже 1,6 ед. - как пониженную. 1 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Способ оценки агрегационных свойств тромбоцитов, включающий забор крови, отделение плазмы и подготовку ее для анализа, индукцию агрегации тромбоцитов АДФ и коллагеном, запись агрегатограммы с регистрацией значений степени и скорости агрегации тромбоцитов, отличающийся тем, что рассчитывают интегральный показатель агрегации тромбоцитов (ИПАТ, усл.ед.) по формуле ИПАТ= К₁+К₂+К₃+К₄+Z, где К₁ - отношение степени агрегации тромбоцитов у обследуемого в условиях индукции агрегации АДФ к среднему арифметическому аналогичного показателя здоровых людей; К₂ - отношение скорости агрегации тромбоцитов у обследуемого в условиях индукции агрегации АДФ тромбоцитов к среднему арифметическому аналогичного показателя здоровых людей; К₃ - отношение степени агрегации тромбоцитов у обследуемого в условиях индукции агрегации коллагеном среднему арифметическому аналогичного показателя здоровых людей; К₄ - отношение скорости агрегации тромбоцитов у обследуемого в условиях индукции агрегации коллагеном к среднему арифметическому аналогичного показателя здоровых людей, а качественные признаки агрегатограмм выражают в виде количественного параметра Z, где Z - "+2" - регистрация второй волны агрегации тромбоцитов при индукции процесса АДФ или отсутствии феномена дезагрегации; Z - "-2" - отсутствие волны агрегации тромбоцитов при индукции процесса коллагеном; Z - "0" - отсутствие на агрегатограмме патологических качественных признаков, и при значении ИПАТ в пределах 1,6-5,5 ед. агрегационную способность тромбоцитов оценивают как нормальную, свыше 5,5 ед. - как повышенную, а ниже 1,6 ед. - как пониженную. 2. Способ оценки агрегационных свойств тромбоцитов по п.1, отличающийся тем, что для индукции агрегации тромбоцитов используют только низкую дозу АДФ, которую подбирают опытным путем на образцах крови здоровых людей.