СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОРОШКА НАТРИЕВОЙ СОЛИ ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ ИЗ МОЛОК РЫБ Российский патент 1995 года по МПК C07H21/04 C12N15/10 

Изобретение относится к химии биологически активных веществ, конкретно к способу получения порошка натриевой соли дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) из животного сырья, который может найти применение в медицинской практике, фармацевтической промышленности, биохимии, косметике и парфюмерии.

Основным видом сырья для выделения ДНК являются зрелые молоки рыб, т.к. содержание ДНК в них составляет >40% в расчете на сухое вещество, а примеси (в особенности РНК) минимальны.

Известен способ получения ДНК, заключающийся в том, что молоки лососевых рыб гомогенизируют 2 мин в 0,5%-ном растворе порошка "Новость", депротеинизацию проводят, добавляя смесь фенола и хлороформа в течение 1 ч, разделение фаз ведут на проточной центрифуге СГС-100, осаждают ДНК ацетоном, гомогенизируют ДНК в воде, осаждают спиртом и сушат при 20^оС на воздухе 10-12 ч и 1 ч при 55-60^оС. В полученном порошке ДНК определяли содержание ДНК, РНК, белка и гиперхромный эффект. Следует обратить внимание на весьма низкое значение гиперхромного эффекта, составляющего 21-24% Учитывая весьма мягкое проведение выделения и очистки ДНК, понижение нативности можно объяснить только проведением двойного осаждения целевого продукта [2]
Известен способ получения высокополимерной ДНК, заключающийся в том, что измельченные молоки гомогенизируют, гомогенизат отделяют центрифугированием, обрабатывают детергентом и концентрированным солевым раствором при нагревании до температуры 60^оС, выдерживают при этой температуре, охлаждают до (-2)-(-4)^оС, сорбируют на кизельгур, элюируют цитратно-солевой смесью и высаживают этиловым спиртом [1]
Недостатками известного способа являются трудоемкость и нетехнологичность стадии выделения ДНК, использование больших количеств необходимых реагентов, продолжительность процесса. Кроме того, получаемый продукт имеет высокую молекулярную массу и при получении порошка теряет нативность. Высокое содержание белка показывает, что целевой продукт нуждается в дополнительной очистке. Конечный продукт не может быть использован в медицинской практике.

Целью предлагаемого способа является получение порошка ДНК из молок рыб с сохранением нативной структуры с достаточно высоким выходом, в удобной для хранения, транспортировки и дальнейшего использования форме с применением баромембранных методов, позволяющих иметь высокую производительность процесса, обеспечить легкость масштабирования и автоматизации. По предлагаемому способу может быть получен порошок ДНК практически любой молекулярной массы.

Это достигается за счет того, что после обработки детергентом и концентрированным солевым раствором при повышенной температуре реакционную смесь подвергают ультразвуковой обработке таким образом, чтобы мол.м. ДНК составляла 0,6-1,5 х x10⁶ Да; детергент и белок отделяют либо с помощью фильтрации с кизельгуром и последующей тонкой фильтрации, либо с помощью микрофильтрации через фильтры с диаметром пор 0,4-1,2 мкм, раствор концентрируют на ультрафильтрационном модуле при давлении 0,1-0,8 ати и проводят диафильтрацию от остаточного белка и солей, очищенный раствор подвергают вторичной ультразвуковой обработке до требуемой молекулярной массы, высаживают ДНК этиловым спиртом (96% ), а полученный осадок сушат до постоянного веса. Выход ДНК составляет 56-60% от количества ДНК, содержащегося в молоках. Гиперхромный эффект составляет 40-50%
Предлагаемый способ включает необходимость двух ультразвуковых обработок реакционной смеси. Первый раз озвучивание проводят после стадии обработки детергентом и концентрированным солевым раствором при повышенной температуре до мол. м. 0,6-1,5˙10⁶ Да. Попытки в одну стадию деполимеризовать ДНК до мол. м. 2,5-6˙10⁵ Да требуют очень длительной процедуры ультразвуковой обработки, в результате которой происходит существенная потеря нативности и резко возрастает время, необходимое для проведения процесса, а также возрастают энергетические затраты на процесс (во-первых, это работа ультразвукового генератора, во-вторых, необходимость поддержания постоянной температуры реакционной массы, в противном случае возможна полная потеря нативности). Альтернативной возможностью проведения одностадийной ультразвуковой обработки являются дорогостоящие усложнения конструкции озвучивающего модуля. Вторая фрагментация молекул ДНК методом ультразвуковой обработки проводится на любой стадии процесса после отделения белка и детергента, однако из экономических соображений целесообразно ее проводить перед осаждением ДНК. Предлагаемый способ позволяет использовать стандартные ультразвуковые генераторы. Дополнительным преимуществом проведения двух ультразвуковых обработок является получение ДНК с более узким распределением молекулярных масс.

Из вышесказанного следует, что предлагаемый способ существенно упрощает технологию получения ДНК, позволяет легко масштабировать процесс и получать нативную ДНК заданной молекулярной массы с высоким гиперхромным эффектом.

Отличительными особенностями предлагаемого способа являются осуществление стадии отделения белка и детергента после первой ультразвуковой обработки, которую проводят до мол. м. 0,6-1,5 х 10⁶ Да; концентрирование жидкой фазы на ультрафильтрационных мембранах при давлении 0,1-0,8 ати; диафильтрация, вторая фрагментация молекул ДНК до мол. м. 2,5-6 x10⁵ Да; высушивание осадка ДНК.

П р и м е р 1. 0,5 кг молок гомогенизируют в 3 л цитратно-солевого раствора (0,54% цитрата натрия; 0,88% хлорида натрия), полученный гомогенат разделяют на центрифуге при температуре (-3)-(+5)^оС. Надосадочную жидкость сливают, а осадок помещают в реактор с 14 л цитратно-солевого раствора. При перемешивании доводят температуру смеси до 55-60^оС и добавляют 20л 5%-ного раствора додецилсульфата натрия в 35%-ном водном растворе этилового спирта и выдерживают при перемешивании и постоянной температуре в течение 1,5 ч, добавляют 170 л концентрированного цитратно-солевого раствора (29% хлорида натрия; 4,8% цитрата натрия), нагревают до температуры 55-60^оС и выдерживают при этой температуре еще 1,5 ч, затем охлаждают до температуры 10-12^оС. Озвучивание реакционной массы ведут в течение 15 мин ультразвуком с частотой 22 кГц в вертикальной герметичной ячейке при непрерывном прокачивании раствора перистальтическим насосом, что позволяет обеспечить равномерное движение суспензии по всей поверхности магнитостриктера и предотвращает пенообразование. Мол. м. ДНК после озвучивания составляет 1,5 х 10⁶ Да. Детергент и белок отделяют фильтрацией озвученного раствора с кизельгуром и последующей тонкой фильтрацией. Очищенный раствор концентрируют на ультрафильтрационном модуле при давлении 0,6 ати и температуре 20^оС, проводят диафильтрацию для отделения от остаточного белка и солей. Получают очищенный раствор с концентрацией ДНК ≈0,8% (концентрацию ДНК определяют спектрофотометрически), который озвучивают в течение 50 мин до мол. м. 3,7 х 10⁵ Да, добавляют хлорид натрия (20 г/л), фильтруют через пакет мембран с диаметром пор 1,2-0,2 мкм и высаживают ДНК этиловым спиртом. Осадок отделяют от маточника, промывают этиловым спиртом и сушат в термостате при 30^оС.

Получают порошок с содержанием ДНК 95% Гиперхромный эффект составляет 47% Выход 59% от количества ДНК, содержащегося в молоках, и 3,9% на загруженное сырье.

Остальные примеры получения порошка ДНК приведены в таблице.

Использование: фармацевтическая промышленность, биотехнология, научно-исследовательская практика. Сущность изобретения: молоки рыб гомогенизируют, отделяют осадок, обрабатывают детергентом и концентрированным солевым раствором и после инкубации подвергают воздействию ультразвука, используя при этом типовой комплект озвучивающего оборудования и условия, обеспечивающие получение ДНК с мол. м. от 0,6×10⁶ до 1,5×10⁶ Да, затем белок и детергент отделяют либо фильтрованием через кизельгур и последующей тонкой фильтрацией, либо микрофильтрацией через фильтры с диаметром пор от 0,4 до 1,2 мкм, фильтрат концентрируют на ультрафильтрационном модуле при давлении 0,1-0,8 ати, подвергают диафильтрации и повторно обрабатывают ультразвуком в условиях, обеспечивающих получение ДНК с мол.м. от 2,5×10⁵ до 6,0×10⁵ Да, осаждают ее из раствора этиловым спиртом и высушивают осадок до постоянного веса. 1 табл.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОРОШКА НАТРИЕВОЙ СОЛИ ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ ИЗ МОЛОК РЫБ, включающий гомогенизацию сырья, обработку реакционной массы детергентом и концентрированным раствором соли при повышенной температуре, охлаждение, отделение белка и детергента фильтрованием и осаждение ДНК спиртом, отличающийся тем, что после обработки реакционной массы детергентом и солевым раствором проводят первую обработку ультразвуком с использованием типового комплекта озвучивающего оборудования в условиях, обеспечивающих получение ДНК с мол.м. (0,6 1,5) х 10⁶ дальтон, фильтрат после отделения белка и детергента концентрируют с помощью ультрафильтрационного модуля при давлении 0,1 0,8 ати, подвергают диафильтрации и второй обработке ультразвуком в условиях, обеспечивающих получение ДНК с мол.м. (2,5 6,0) · 10⁵ дальтон, а полученный осадок ДНК сушат до постоянной массы.