СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НАТРИЕВОЙ СОЛИ ДНК ИЗ МОЛОК РЫБ Российский патент 1997 года по МПК A61K35/60 C07H21/04 

Изобретение относится к способу получения натриевой соли ДНК из зрелых молок рыб и может найти применение при получении иммуномодуляторов на основе нуклеиновой кислоты в фармацевтической промышленности.

В настоящее время помимо широкого использования препаратов дезоксирибонуклеиновых кислот в научных целях для изучения структурно-функциональной организации генетического аппарата клетки активно разрабатываются схемы их применения в качестве лечебных средств при раковых заболеваниях, лучевой болезни, диабете и других патологических состояниях организма, при которых необходима его иммунокоррекция либо иммуномодуляция.

Хорошо зарекомендовавшим себя источником выделения дезоксирибонуклеиновых кислот (ДНК) в промышленных целях являются зрелые молоки рыб, имеющие ряд преимуществ перед сырьем иного происхождения, таким, например, как органы и ткани животных либо растений, биомасса микроорганизмов и т.п. К основным преимуществам рыбных молок, как сырья, могут быть отнесены: наиболее высокое содержание ДНК по сравнению с другими источниками, относительно низкое содержание рибонуклеиновых кислот (РНК) и других примесей, а также дешевизна и доступность молок, являющихся отходами рыбной промышленности.

Известные способы получения ДНК предусматривают выделение на первом этапе дезоксинуклеопротеида (ДНП), из которого на второй стадии удаляют белок с помощью детергентов, катионитов или протеазами.

Известен способ получения ДНК (авт. свид. СССР N 1373709, 1988, МКИ С 07 Н 21/04), cогласно которому ткани животных гомогенизируют и затем центрифугируют. Осаждающийся хроматин отмывают от рибонуклеопротеидов не менее 6 раз, каждый раз отделяя его центрифугированием и проводя весь процесс при 4^oC. Отмытый ДНП суспендируют в солевом буферном растворе с 0,15 М хлористого натрия, доводят концентрацию соли до 2 М, после чего добавляют катионит и проводят диализ полученной суспензии ДНП с катионитом против физраствора при постоянном перемешивании в течение 12 ч при 4^oC. Диализованный препарат ДНК центрифугируют, в надосадочной жидкости остается раствор ДНК концентрацией не более 0,2 мг/мл и содержанием белка менее 1%
Недостатками данного способа являются необходимость проведения работы при низких температурах (сложность технологии), возможность получения только разбавленных растворов ДНК и небольших ее количеств. Способ пригоден только для использования в лабораторной практике.

Известен способ (авт. свид. СССР N 496279, 1975, МКИ С 07 Н 21/04), по которому удаляют белки из ДНП экстракцией хлороформом в присутствии бентонита при 15-20^oC и интенсивном перемешивании. После центрифугирования суспензии ДНК из надосадочной жидкости осаждают этиловым спиртом. В этом случае продемонстрирована авторами возможность получения нескольких десятков грамм ДНК с содержанием основного вещества в конечном продукте 80-85%
Недостатками способа являются использование экологически вредного соединения хлороформа, высокая стоимость процесса, а также его трудоемкость.

Известен способ (авт. свид. СССР N 644484, 1979, МКИ С 07 Н 21/04), согласно которому депротеинизацию отмытого ДНП также проводят экстракцией органическими растворителями смесью хлороформа с изоамиловым спиртом. После отделения осадка центрифугированием ДНК осаждают из надосадочной жидкости 2 объемами охлажденного этилового спирта. К сожалению, авторы не указывают степень чистоты получаемой ими ДНК.

Недостатком данного способа является использование экологически вредного соединения хлороформа.

Известен способ получения ДНК (авт. свид. СССР N 487897, 1975, МКИ С 07 G 7/026), согласно которому молоки рыб гомогенизируют в холодном цитратно-солевом растворе, центрифугируют и осадок вновь гомогенизируют в цитратно-солевом растворе, затем при перемешивании добавляют 6%-ный раствор додецилсульфата натрия (ДНС) до конечной концентрации ДСН 1% и, не прекpащая перемешивания, нагревают раствор до 60^oC и выдерживают при этой температуре 1,5 ч. После чего добавляют вновь цитратно-солевую смесь до конечной концентрации хлористого натрия 16% и концентрации трехзамещенного цитрата натрия 2,6% и перемешивают смесь еще 1,5 ч при 60^oC, по окончании чего смесь охлаждают до 2-4^oC, смешивают с кизельгуром и элюируют ДНК с него цитратно-солевым раствором. Раствор ДНК отделяют от кизельгура фильтрацией через слой бальтинга и фильтровальной бумаги на нутч-фильтре. ДНК из раствора осаждают холодным 96% -ным этиловым спиртом. ДНК, полученная данным способом, содержит не более 1,5% белка, обладает значительным гиперхромным эффектом (41%).

Недостатком данного способа является расход значительных количеств растворов: для получения 1 г ДНК требуется около 12 л цитратно-солевого раствора, что требует использования больших емкостей реакционных сосудов.

Известен способ получения ДНК (пат. РФ N 2017496, 1994, МКИ С 07 Н 21/04), согласно которому молоки гомогенизируют в цитратно-солевом растворе, осадок после центрифугирования трижды промывают этим же раствором, отмытый осадок суспендируют в цитратно-солевом растворе с 6% додецилсульфата натрия в 45% -ном этиловом спирте, нагревают до 60^oC, после чего добавляют равный объем 5 М хлористого натрия, перемешивают и охлаждают до 12-16^oC. Полученную реакционную массу обрабатывают ультразвуком и осадок отделяют фильтрацией суспензии через кизельгур. ДНК из фильтрата отделяют на мембране с размером пор 0,45 мкм и промывают на этой же мембране до отрицательной пробы на белок в промывочных растворах.

Недостатком данного способа является использование в ходе получения ДНК ультразвука, что неизбежно влечет применение в технологии мощных ультразвуковых машин, что удорожает получение субстанции и усложняет технологию.

Известен способ (авт. свид. СССР N 652187, 1979, МКИ С 07 Н 21/04), по которому гомогенат молок рыб в 0,15 М хлористом натрии центрифугируют и многократно промывают полученный осадок солевым буфером до отрицательной пробы на белок в промывочной жидкости, после чего осадок ресуспендируют в растворе протеолитического фермента (обычно трипсина или проназы) и инкубируют при 370^oC в течение 18 ч. Далее клетки лизируют 0,5%-ным раствором додецилсульфата натрия и из полученной вязкой массы удаляют белки экстракцией фенолом. После центрифугирования к надосадочной жидкости добавляют хлористый натрий до конечной концентрации 3 М и экстрагируют равным объемом смеси хлороформа с изоамиловым спиртом. После центрифугирования из надосадочной жидкости осаждают ДНК равным объемом концентрированного этилового спирта. Для получения ДНК повышенной чистоты ее обрабатывают РНК-азой и затем трипсином для удаления примеси РНК и белка. Затем полученную ДНК несколько раз переосаждают и проводят одну-две депротеинизации хлороформом, после чего ее осаждают концентрированным этанолом, промывают несколько раз 70%-ным этиловым спиртом.

Данным способом удается получить ДНК высокой степени чистоты (содержание белка около 1% отсутствие примеси полисахаридов, примеси РНК). Однако к недостаткам метода следует отнести многостадийность и использование органических растворителей для депротеинизации ДНП, которые являются экологически вредными и достаточно дорогими, что делает процесс более дорогостоящим и сложным.

Наиболее близким техническим решением является способ получения ДНК, в котором удаление белка из ДНП ведут с помощью протосубтилина протеазы, выделенной из Bacillus Subtilis (авт. свид. СССР N 780444, 1985, МКИ С 07 D 13/06). Гомогенат молок лосося разбавляют равным объемом 0,15 М NaCl, центрифугируют, осадок трижды промывают 0,15 М NaCl, затем этанолом. Полученный ДНП суспендируют в солевом буфере, нагревают суспензию до 35^oC, добавляют протосубтилин до 1,2 ед. акт/мл и выдерживают 30 мин при слабом перемешивании. После центрифугирования реакционной смеси надосадочную жидкость смешивают с равным объемом этилового спирта и извлекают пряди ДНК.

Однако существенным недостатком известного способа является получение с использованием протосубтилина ДНК с высоким содержанием белка (2,4%), которую нельзя использовать без дополнительной очистки для получения инъекционных или иных лекарственных препаратов, в которых содержание белка не должно превышать 1,5% Другим недостатком является то, что согласно описанному способу удается получать только высокомолекулярную ДНК, которая медленно растворяется, образует очень вязкие растворы и также не годится без дополнительной фрагментации для получения на ее основе лекарственных препаратов.

Задачей изобретения является разработка такого ферментативного способа получения ДНК из молок половозрелых рыб, который бы позволял без дополнительной очистки и усложнения технологической схемы получать ДНК с содержанием белка не более 1,5% и одновременно позволял бы получать заданный размер нуклеиновых кислот, не прибегая к дополнительным техническим средствам, например использованию ультразвуковых установок.

Поставленная задача решается тем, что предлагается способ получения натриевой соли ДНК из молок рыб путем их гомогенизации и удаления белков из комплекса с ДНК с помощью обработки ферментным препаратом, выделенным из гепатопанкреаса Камчатского краба, обладающий протеолитической, липазной и нуклеазной активностями. Другим важным приемом является добавление в реакционную смесь натриевой соли ЭДТА с последующей инкубацией.

Молекулярную массу получаемой натриевой соли ДНК можно регулировать, варьируя количество добавленной ЭДТА. Для получения низкомолекулярной ДНК добавляют ЭДТА до концентрации 3-10 мМ. Для получения ДНК средних размеров добавляют ЭДТА до концентрации 10-20 мМ. Для получения высокомолекулярной ДНК добавляют ЭДТА до концентрации 20-30 мМ.

Кроме того, установлено, что повторная инкубация реакционной смеси в присутствии хлористого натрия в конечной концентрации 20-100 г/л позволяет получить препарат ДНК с меньшим содержанием белка.

Для получения высокоочищенной ДНК с содержанием белка менее 0,1% раствор ДНК пропускают через колонку с аминообменником модифицированным силикагелем (полисил СА-500, 20-30 мкм), промывают колонку 0,5-1 М раствором хлористого натрия и элюируют высокочистую ДНК 2 М раствором NaCl.

В сравнении с известными способами более высокая степень чистоты ДНК достигается за счет добавления вместо конкретной протеазы протосубтилина смеси протеаз из гепатопанкреаса камчатского краба и дополнительной стадией
прогреванием реакционной смеси при 56-60^oC после гидролиза в солевом растворе. После этих обработок содержание белка в препарате ДНК не превышает 0,7%
Следует также добавить, что для получения ДНК, как лекарственной субстанции, ее необходимо фрагментировать, в частности, для этих целей и повышения выхода ДНК до 3% используется ультразвук. В заявляемом способе использование ультразвука не требуется, поскольку в комплексе ферментов из камчатского краба присутствуют и ДНКазы и РНКазы, поэтому только регуляцией количества добавляемого ЭДТА можно добиться получения препарата ДНК с заданным распределением молекулярных весов фрагментов, а выход ДНК из молок рыб также возрастает с 3% до 4-7,5% в предлагаемом способе.

На фиг.1 изображена схема получения препарата ДНК по заявляемому способу, где (А) дополнительные стадии, необходимые для получения высокоочищенной ДНК с содержанием белка менее 0,1% на фиг.2 спектр поглощения полученных по заявляемому способу образцов ДНК в УФ-области; на фиг.3 электрофорегpамма образцов ДНК, выделенных согласно заявляемому способу при различном содержании ЭДТА в реакционной смеси, 1-22 маркеры молекулярного веса. Стрелками отмечено положение самого большого фрагмента (1300 пар оснований) и самого маленького (50 пар оснований).

1, 22 маркеры молекулярного веса, Bspl гидролизат плазмидной ДНК pQPR, стрелками отмечено положение самого большого фрагмента (1300 пар оснований) и самого маленького (50 пар оснований).

2, 7, 12, 17 ДНК, полученная согласно заявляемого способа при концентрации ЭДТА 5 мМ.

3, 8, 13, 18 ДНК, полученная при концентрации ЭДТА 10 мМ.

4, 9, 14, 19 ДНК, полученная при концентрации ЭДТА 15 мМ.

5, 10, 15, 20 ДНК, полученная при содержании ЭДТА в реакционной смеси 20 мМ.

6, 11, 16, 21 образцы ДНК, полученные согласно [5]
Пример 1. Схема получения ДНК представлена на фиг.1. 1 кг замороженных молок лосося промывают питьевой водопроводной водой и затем ополаскивают дистиллированной водой, гомогенизируют в 900 мл 0,15 М раствора хлористого натрия в течение 10-15 мин при максимальных оборотах ножа гомогенизатора. К гомогенату добавляют 100 мл 0,40 М раствора динатриевой соли ЭДТА (рН 8,0) до конечной концентрации 20 мМ и гомогенизируют дополнительно 5 мин. К полученной вязкой массе добавляют 1 г комплекса ферментов, полученного из гепатопанкреаса Камчатского краба, и перемешивают массу гомогенизацией в течение 2 мин. Далее смесь инкубируют при 37^oC в течение 16 ч. К полученной гидролитической массе присыпают 20-100 г/л хлористого натрия, нагревают при перемешивании до 56^oC и выдерживают при этом температуре. Далее реакционную массу охлаждают и отделяют раствор ДНК от осадка центрифугированием либо фильтрацией на нутч-фильтре. К охлажденному раствору при перемешивании добавляют два объема охлажденного этилового спирта и формируют осадок ДНК в течение не менее 2 ч. Полученный осадок отделяют на нутч-фильтре, промывают 300 мл 70% этилового спирта, подсушивают на воздухе и растворяют в 800-1000 мл 0,5 М раствора хлористого натрия. Полученный раствор вновь прогревают и осаждают ДЕК этиловым спиртом. Сформированный осадок отделяют фильтрацией на нутч-фильтре, последовательно промывают 300 мл 70%-ного, а затем 96%-ного этилового спирта и сушат при 30-50^oC в вакууме водоструйного насоса. Выход натриевой соли ДНК в зависимости от ее содержания в исходном сырье 40-75 г.

Cпектр поглощения полученной по данной схеме ДНК представлен на фиг.2, электрофореграмма на фиг.3. Белок определяли по стандартному методу Бредфорда, используя в качестве стандарта раствор человеческого сывороточного альбумина. Выход ДНК рассчитывали по поглощению при 260 нм, используя коэффициент пересчета 1 о.е.50 мкг. Гиперхромизм ДНК (в) определяли, сравнивая оптическую плотность при 260 нм раствора ДНК до и после гидролиза 5% хлорной кислотой при 100^oC в течение 20 мин.

Содержание белка в образцах ДНК, полученных по заявляемому способу, существенно ниже, чем у известных способов. Кроме этого, выход ДНК также значительно выше (4-7,5% вместо 3, как в известных способах). Получаемая по нашему способу ДНК имеет двухцепочечную структуру, о чем свидетельствует высокое значение гиперхромного эффекта (33-42%). Наличие в ферментном препарате нуклеазных активностей приводит к получению фрагментированной ДНК, с размером фрагментов от 50 до 1300 пар оснований. Максимум распределения ДНК по фрагментам смещается в сторону более протяженных фрагментов при повышении концентрации ЭДТА в реакционной смеси (фиг.3).

Пример 2. 1 кг замороженных молок лосося промывают питьевой водопроводной водой и затем ополаскивают дистиллированной водой, гомогенизируют в 950 мл 0,15 М раствора хлористого натрия в течение 10-15 мин при максимальных оборотах ножа гомогенизатора. К гомогенату добавляют 50 мл 0,40 М раствора динатриевой соли ЭДТА (рН 8,0) до конечной концентрации 10 мМ и гомогенизируют дополнительно 5 мин. Далее из полученного гомогената выделяют низкомолекулярную нативную ДНК согласно примера 1.

Пример 3. 1 кг замороженных молок лосося промывают питьевой водопроводной водой и затем ополаскивают дистиллированной водой, гомогенизируют в 850 мл 0,15 М раствора хлористого натрия в течение 10-15 мин при максимальных оборотах ножа гомогенизатора. К гомогенату добавляют 150 мл 0,40 М раствора динатриевой соли ЭДТА (рН 8,0) до конечной концентрации 30 мМ и гомогенизируют дополнительно 5 мин. Далее из полученного гомогената выделяют высокомолекулярную нативную ДНК согласно примера 1.

Пример 4. ДНК, полученную согласно примеров 1-3, растворяют в физиологическом растворе (концентрация 10 мг/мл) и пропускают через колонку с модифицированным силикагелем (Полисил СА-500, 20-30 мкм). После нанесения колонку промывают и элюируют ДНК 2 М NaCl. Анализ относительного содержания белка в различных фракциях показал, что высокочистая ДНК (содержание белка менее 0,1%) элюируется 2 М NaCl.

Промышленная применимость. Изобретение может быть использовано в медицине и фармацевтической промышленности, а также при приготовлении косметических препаратов.

Изобретение относится к способу получения натриевой соли ДНК из зрелых молок рыб и может найти применение при получении иммуномодуляторов на основе нуклеиновых кислот в фармацевтической промышленности. Способ заключается в том, что гомогенизируют зрелые молоки рыб, к гомогенату добавляют комплекс ферментов, выделенный из гепатопанкреаса Камчатского краба, обладающий протеолитической, липазной и нуклеазной активностями, и натриевую соль этилендиаминотетрауксусной кислоты до конечной концентрации ее в реакционной смеси 3-30 мМ, инкубируют реакционную смесь, после чего добавляют хлористый натрий до концентрации 20-100 г/л в реакционной смеси, нагревают до 56-60^oC, выдерживают при этой температуре, охлаждают до 2-8^oC и отделяют осадок центрифугированием или нутч-фильтрацией. Способ позволяет получать ДНК различной молекулярной массы с содержанием белка 0,7 и 0,1%. 4 з.п. ф-лы, 3 ил.

1. Способ получения натриевой соли ДНК из молок рыб путем гомогенизации сырья в растворе хлористого натрия, инкубации гомогената в присутствии протеолитического фермента с последующим отделением и очисткой целевого продукта, отличающийся тем, что гомогенат обрабатывают раствором натриевой соли ЭДТА до конечной концентрации в реакционной смеси 3 30 мМ, инкубируют в присутствии комплекса протеолитических ферментов при 20 40^oС, далее добавляют хлористый натрий до конечной концентрации 20 100 г/л в реакционной смеси, а перед отделением целевого продукта реакционную смесь охлаждают до 2 - 8^oС. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для получения низкомолекулярной ДНК добавляют ЭДТА до конечной концентрации в реакционной смеси 3 10 мМ. 3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для получения ДНК средних размеров добавляют ЭДТА до конечной концентрации в реакционной смеси 10 20 мМ. 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что для получения высокомолекулярной ДНК добавляют ЭДТА до конечной концентрации в реакционной смеси 20 30 мМ. 5. Способ по пп. 1 4, отличающийся тем, что для получения высокоочищенной ДНК с содержанием белка менее 0,1 процента раствор ДНК пропускают через колонку с анионообменником.