СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДНК ИЗ МОЛОК ЛОСОСЕВЫХ РЫБ Российский патент 2013 года по МПК C12P19/34 C07H21/04 

Изобретение относится к технологии получения биологически активных веществ и может быть использовано в биотехнологии, а полученный продукт - в пищевой промышленности в качестве сырья при производстве биологически активных добавок к пище и специализированных пищевых продуктов, в парфюмерно-косметической промышленности в качестве биологически активной добавки в составе кремов, масок, лосьонов и других косметических средств, в научно-исследовательской практике.

Известен способ получения порошка натриевой соли дезоксирибонуклеиновой кислоты из молок рыб (1), предусматривающий гомогенизацию молок рыб, отделение осадка, обработку детергентом и концентрированным солевым раствором, воздействие ультразвуком с использованием при этом типового озвучивающего оборудования и условий, обеспечивающих получение ДНК с молекулярной массой от 0,6×10⁵ до 1,5×10⁵ Да, отделение белка и детергента либо фильтрованием через кизельгур и последующей тонкой фильтрацией, либо микрофильтрацией через фильтры с диаметром пор от 0,4 до 1,2 мкм, концентрирование фильтрата на ультрафильтрационном модуле при давлении 0,1-0,8 атм, его диафильтрацию и повторную обработку ультразвуком в условиях, обеспечивающих получение ДНК с молекулярной массой от 2,5×10⁵ до 6,0×10⁵ Да, осаждение ДНК из раствора этиловым спиртом и высушивание осадка до постоянного веса.

Описан также способ выделения дезоксирибонуклеиновых кислот (2), включающий адсорбцию дезоксирибонуклеиновых кислот на силикатном сорбенте в присутствии хаотропного агента, отделение и промывку сорбента с последующей элюцией нуклеиновых кислот с сорбента.

Известен способ получения нуклеопротеинового комплекса (3) который включает измельчение рыбных молок, обработку его 7-10%-ным раствором хлорида натрия в течение 2,5-3,5 часов при температуре кипения, отделение экстракта ДНК от плотной части, ультрафильтрацию с концентрированием экстракта до содержания сухих веществ 1,8-3%, сушку препарата, обработку его этанолом при 40-50°С, сушку на воздухе. Выход ДНК составляет 4,5-6,0%, содержание ДНК в препарате - не менее 65%.

Известен способ выделения натриевой соли ДНК из тканей животного происхождения (4). Способ включает измельчение и гомогенизацию в цитратно-солевом растворе (ССЦ), трехкратную промывку ядерного материала ССЦ. Затем отмытый ядерный материал помещают в реактор с ССЦ и 6% раствором додецилсульфата натрия в 45% этиловом спирте, нагревают до 60°С, добавляют равный объем 5М хлористого натрия, перемешивают, охлаждают до 12-16°С, обрабатывают реакционную массу ультразвуком, отделяют раствор ДНК от осадка балластных веществ фильтрацией реакционной массы через кизельгур на нутч-фильтре; концентрируют фильтрат на мембране с размером пор 0,45 мкм (потери ДНК при этом 3%), отмывают концентрат диафильтрацией на этой же мембране до отрицательной реакции на белок в пермеате.

Основным недостатком известных способов является то, что они предполагают использование этанола, являющегося социально опасным продуктом, требуют использования оборудования, в пожаро- и взрывобезопасном исполнении, а также наличия лицензии у производителя, на осуществление работ с применением этанола.

В качестве прототипа выбран способ производства натриевой соли дезоксирибонуклеиновой кислоты из животного сырья и установка для его осуществления (5), включающий измельчение животного сырья (молоки осетровых рыб, селезенка, эритроциты цыпленка и т.д.) и гомогенизацию в цитратно-солевом растворе, обработку гомогената детергентом и концентрированным раствором хлористого натрия при повышенной температуре, обработку реакционной смеси после предварительного формирования из нее слоя определенной толщины в течение 10-80 минут ультразвуком с частотой 8-35 кГц и интенсивностью 0,2-2,0 Вт/см², смешивание «озвученной» массы с кизельгуром в соотношении соответственно 5:1-25:1 (объем/масс), отделение жидкой фазы фильтрованием и концентрирование барофильтрацией, осаждение Na-соли ДНК из концентрата этиловым спиртом, высушивание осадка при 20-60°С. Масштабирование процесса осуществляется благодаря созданию и использованию новой промышленной установки.

Недостатком известного способа является трудоемкость и продолжительность технологического процесса выделения ДНК, наличие двух этапов обработки ультразвуком в вертикальной герметичной ячейке при непрерывном прокачивании раствора перистальтическим насосом, что приводит к значительному снижению производительности процесса и усложнению его масштабирования, а также использование больших количеств необходимых реагентов, в том числе этилового спирта.

Целью заявленного изобретения является разработка способа получения ДНК из молок лососевых рыб, отличающегося увеличением выхода готовой продукции с более высоким содержанием ДНК, снижению стоимости продукта за счет уменьшения количества стадий технологического процесса и возможности его масштабирования за счет использования типового промышленного оборудования.

Для осуществления поставленной задачи производили размораживание сырья из молок лососевых рыб, его измельчение, гидролиз протеолитическим ферментом трипсином, отделение балластных белков и липидов методом центрифугирования, фильтрацию полученной смеси через бельтинг-ткань, лиофилизацию или распылительное высушивание раствора ДНК.

Полученный продукт характеризуется следующими показателями:

внешний вид - аморфный порошок;

цвет - от белого до светло-коричневого;

запах - свойственный данному продукту с рыбным оттенком;

массовая доля влаги, не более - 8%;

массовая доля основного вещества (ДНК), не менее - 65%.

Идентификацию состава получаемого готового продукта и содержание в нем ДНК определяли спектрофотометрическим методом.

Способ осуществляют следующим образом:

Пример 1. Получение ДНК при оптимальном соотношении исходного сырья и трипсина.

40 кг дефростированных молок лососевых рыб измельчают на коллоидной мельнице, обрабатывают водным раствором ферментного препарата трипсина при следующем соотношении компонентов (масс.%): молоки лососевых рыб: вода: трипсин, как 40:59,88:0,12 в течение 3 часов при 45°С.

Водородный показатель рН полученной реакционной смеси (измельченные молоки лососевых рыб и вода) соответствовал оптимуму действия трипсина (рН 8-9)

Полученный гидролизат, для удаления балластных белков и липидов, центрифугируют на проточной центрифуге (15000об./мин.), фильтруют через бельтинг-ткань и подвергают лиофильной или распылительной сушке.

Выход готовой продукции составляет 16,0-18,0% от количества используемого сырья, при содержании ДНК в готовой продукции не менее 65%.

Пример 2. Получение ДНК при минимальном количественном соотношении исходного сырья и трипсина осуществляется аналогично примеру 1, только с минимальным количественным соотношением компонентов, а именно молоки лососевых рыб: вода: трипсин, как 40:59,96:0,04.

Выход готовой продукции составляет 14,0-16,0% от количества используемого сырья, при содержании ДНК в готовой продукции не менее 64,0%.

Пример 3. Получение ДНК при максимальном количественном соотношении исходного сырья и трипсина осуществляется аналогично примеру 1, только с максимальным количественным соотношением компонентов, а именно молоки лососевых рыб: вода: трипсин, как 40:59,8:0,2.

Выход готовой продукции составляет 17,0-18,0% от количества используемого сырья, при содержании ДНК в готовой продукции не менее 65,0%.

Пример 4. Получение ДНК при нижеминимальном количественном соотношении исходного сырья и трипсина осуществляется аналогично примеру 1, только с нижеминимальным количественным соотношением компонентов, а именно молоки лососевых рыб: вода: трипсин, как 40:59,98:0,02.

Выход готовой продукции составляет 10,0-14,0% от количества используемого сырья, при содержании ДНК в готовой продукции не менее 62,0%.

Пример 5. Получение ДНК при вышемаксимальном количественном соотношении исходного сырья и трипсина осуществляется аналогично примеру 1, только с вышемаксимальным количественным соотношением компонентов, а именно молоки лососевых рыб: вода: трипсин, как 40:59,78:0,22.

Выход готовой продукции составляет 17,0-18,0% от количества используемого сырья, при содержании ДНК в готовой продукции не менее 65,0%.

Сравнительные данные по выходу готовой продукции и содержанию в ней основного вещества (ДНК) в зависимости от соотношения компонентов реакционной смеси (молоки лососевых рыб: вода: трипсин) приведены в таблице.

Номер примера Соотношение компонентов реакционной смеси (молоки лососевых рыб: вода: трипсин) Выход готовой продукции, %, не менее Содержание ДНК в готовой продукции, %, не менее 1. 40:59,88:0,12 16,0-18,0 65,0 2. 40:59,96:0,04 14,0-16,0 64,0 3. 40:59,8:0,20 17,0-18,0 65,0 4. 40:59,98:0,02 10,0-14,0 62,0 5. 40:59,78:0,22 17,0-18,0 65,0

Таким образом, увеличение добавления фермента трипсина свыше 0,22 масс.% не приводит к увеличению выхода готовой продукции и содержанию в ней основного вещества и, следовательно, экономически нецелесообразно.

Источники информации, приятные во внимание при экспертизе.

1. Патент RU №2041885 С1, C07H 21/04, C12N 15/10, 20.08.1995

2. Патент RU №2232768 С2, C07H 21/04, 20.07.2004

3. Патент RU №2122856 С1, A61K 35/60, 10.12.1998

4. Патент RU №2017496, A61K 35/60, C07H 21/04, 15.08.1998

5. Патент RU №2005724 C1, C07H 21/04, C12P 19/34, C12M 3/00,

15.01.1994 (прототип)

Изобретение относится к области биохимии. Дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) выделяют из молок лососевых рыб. Размораживают и измельчают используемое сырье. Обрабатывают его водным раствором трипсина в течение 3 ч при 45°С при содержании компонентов (масс.%): молоки лососевых рыб - 40,0, трипсин - 0,02-0,22, вода - остальное. Центрифугируют полученный гидролизат и фильтруют его через бельтинг-ткань. Проводят лиофильное или распылительное высушивание. Выход готовой продукции из молок лососевых рыб составляет 10,0-18,0% от количества исходного сырья при содержании ДНК в целевом продукте не менее 62-65%. Изобретение позволяет увеличить выход получаемой ДНК в 2,2-2,4 раза. 1 табл., 5 пр.

Способ получения ДНК из молок лососевых рыб, включающий размораживание, измельчение используемого сырья, обработку его водным раствором трипсина с последующим центрифугированием полученного гидролизата, фильтрацией через бельтинг-ткань, лиофильным или распылительным высушиванием, при этом обработку водным раствором трипсина проводят в течение 3 ч при 45°С при содержании компонентов, мас.%: молоки лососевых рыб 40,0, трипсин 0,02-0,22, вода остальное.