СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ХОНДРОИТИНСУЛЬФАТА А Российский патент 1997 года по МПК C08B37/08 

Изобретение относится к химии полисахаридов, конкретно, к способу получения хондроитинсульфата А, который используется для профилактики послеоперационных глубоких венозных тромбозов, атеросклероза и инфаркта миокарда.

Известны способы получения хондроитинсульфата из морских иглокожих, например, голотурий (заявка Японии 63-10601, 1988 г. МКИ: С 08 В 37/08) или хрящей животных ("Scand. Arch. Physrol." 1989. V.I, p.210-215), однако при этом получают неочищенные препараты, содержащие значительное количество примесей других полисахаридов и белков.

Согласно наиболее близкому, принятому за прототип техническому решению, описанному в заявке Франции 2491475 (1982 г. МКИ: С 08 В 37/08; А 61 К 31/725), при получении хондроитинсульфата А измельченные бычьи трахеи гидролизуют 1,25%-ным водным раствором пепсина при рH 4,5 и температуре 50^oC в течение 12 ч, фермент инактивируют при 80-90^oC, осадок отделяют центрифугированием, промывают горячей водой, промывные воды и надосадочную жидкость объединяют и последовательно обрабатывают сначала при рH 9-10, а затем при рH 6,5, нагревают до кипения, охлаждают, осадок отделяют, надосачную жидкость обрабатывают 5% -ным раствором цетилпиридинийхлорида, осадок отделяют, промывают метанолом, растворяют в воде, центрифугируют и осадок высушивают.

Недостаток известного способа заключается в низком выходе хондроитинсульфата А, составляющем 47-56 мг/кг сырья, в многостадийности, а также в необходимости использовать высотоксичный метанол.

Изобретение решает задачу повышения выхода хондроитинсульфата А при уменьшении числа стадий и исключении метанола.

Цель достигается благодаря тому, что в способе получения хондроитинсульфата А, включающем ферментативный гидролиз бычьих трахей пепсином, инактивацию фермента при 80-90% отделение гидролизата центрифугированием, осаждение цетилпиридинийхлоридом, растворение осадка в воде и его сушку, гидролиз проводят 2-3 объемами 0,5-1%-ного раствора пепсина при 38-40^oС и рH 1,5-2,0 в течение 4-6 ч, цетилпиридинийхлорид используют в количестве 2-4 г/л раствора, при этом перед осаждением гидролизат хроматографируют на колонке с диэтиламиноэтилцеллюлозой при использовании 1-2%-ной HCl в качестве элюента, а после растворения осадка в воде продукт высаливают хлоридом натрия из расчета 20-30 г/л при 2-4^oС и целевой продукт получают обессоливанием диализом против воды при течение 12-16 ч.

Способ позволяет получать очищенный хондроитинсульфат А, выход которого примерно в 3 раза выше, чем по известному способу.

Пример 1. 100 г бычьих трахей измельчают на мясорубке, заливают 200 мл (2 объема) 0,5%-ного водного раствора пепсина (активность 15 ЕД/мг) и гидролизуют при рH 1,5 и 38^oС в течение 4 ч, фермент инактивируют нагреванием до 80^oС, смесь центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15 мин, надосадочную жидкость (150 мл) пропускают через колонку размером 2 х 35 см с диэтиламиноэтилцеллюлозой, элюцию ведут со скоростью 10 мл/мин 300 мл I%-ного раствора HCl, к 280 мл элюата добавляют 0,56 г цетилпиринийхлорида (2 г/л), осадок отфильтровывают, растворяют в 50 мл воды, добавляют I г NaCl (20 г/л), охлаждают до 2^oС, осадок отделяют фильтрованием, растворяют в 50 мл воды, диализируют против воды при 4^oC в течение 12 ч, диализат сушат сублимацией и получают 15 мг хондроитинсульфата А (выход 150 мг/кг сырья).

Пример 2. 100 г измельченных бычьих трахей заливают 250 мл (2,5 объема) 0,75%-ного водного раствора пепсина (активность 15 ЕД/мг ) и гидролизуют при рH 1,75 и 39^oС в течение 5 ч, фермент инактивируют нагреванием до 85^oС, смесь центрифугируют, надосадочную жидкость в объеме 200 мл пропускают через колонку размером 2 х 35 см, заполненную диэтиламиноэтилцеллюлозой, элюируют 300 мл 1,5%-ного раствора HCl со скоростью 10 мл/мин, к 280 мл элюата прибавляют 0,84 г цетилпиридинийхлорида (3 г/л), осадок отфильтровывают, растворяют в 50 мл воды, прибавляют 1,25 г NaCl (25 г/л), охлаждают до 3^oС, образовавшийся осадок отделяют на фильтре, растворяют в 50 мл воды, диализируют против воды при 5^oС в течение 14 ч, диализат сушат сублимацией и получают 16 мг хондроитинсульфата А (выход 160 мг/кг сырья).

Пример 3. 100 г измельченных бычьих трахей заливают 300 мл (3 объема) 1% -ного водного раствора пепсина (активность 15 ЕД/мг), гидролизуют при рH 2,0 и 40^oС в течение 6 ч, фермент инактивируют нагреванием до 90^oС, смесь центрифугируют, надосадочную жидкость в объеме 250 мл пропускают через колонку размером 2 х 35 см, заполненную диэтиламиноэтилцеллюлозой, элюируют 300 мл 2%-ного раствора HCl со скоростью 10 мл/мин, к 280 мл элюата прибавляют 1,12 г цетилпиридинийхлорида (4 г/л), осадок отделяют на фильтре, растворяют в 50 мл воды, добавляют 1,5 г NaCl (30 г/л), охлаждают до 4^oС, образующийся осадок отделяют на фильтре, растворяют в 50 мл воды, диализируют против воды при 6^oС в течение 16 ч, диализат сушат сублимацией и получают 17 мг хондроитинсульфата А (выход 170 мг/кл сырья).

Таким образом, выход хондроитинсульфата в заявленном способе составляет 150-170 мг/кг против 47-56 мг/кг в известном, при этом по физико-химическим характеристикам (удельному оптическому вращению, элементному анализу, поведению при хроматографировании на бумаге в системе пропиловый спирт 0,2 М борная кислота) образцы хондроитинсульфата А практически не различались.

Использование: получение хондроитинсульфата А. Сущность изобретения: ферментативный гидролиз бычьих трахей 2-3 объемами 0,5-1%-ного раствора пепсина при 38-40^oС и рH 1,5-2, инактивация пепсина, отделение образовавшегося осадка с последующим растворением образовавшегося осадка в воде, перед осаждением гидролизат хроматографируют на колонке с диэтиламиноэтилцеллюлозой при использовании в качестве элюирующего раствора 1-2%-ной HCl, для высушивания используют диализованный водный раствор целевого продукта.

Способ получения хондроитинсульфата А, включающий ферментативный гидролиз бычьих трахей пепсином, инактивацию пепсина при 80 90^oС, отделение образовавшегося осадка с последующим растворением отделенного осадка в воде и высушиванием водного раствора, отличающийся тем, что ферментативный гидролиз бычьих трахей пепсином проводят 2 3 объемами 0,5 1,0%-ного раствора пепсина при 38 40^oС и рН 1,5 2,0 в течение 4 6 ч, перед обработкой надосадочной жидкости цетилпиридиний хлоридом надосадочную жидкость дополнительно хроматографируют на колонке с диэтиламиноэтилцеллюлозой при использовании в качестве элюирующего раствора 1 2%-ного HCl, обработку хроматографически очищенной надосадочной жидкости проводят цетилпиридиний хлоридом в количестве 2 4 г/л, после отделения образовавшегося осадка и растворения отделенного осадка в воде полученный раствор высаливают хлоридом натрия в количестве 20 30 г/л раствора, при 2 4^oС, полученный осадок отделяют и растворяют в воде, а вновь полученный раствор обессоливают диализом против воды при 4 6^oС в течение 12 16 ч, для высушивания используют диализованный водный раствор целевого продукта.