СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СУЛЬФАТИРОВАННОГО ХИТОЗАНА Российский патент 1995 года по МПК C08B37/08 

Изобретение относится к области получения высокомолекулярных биологически активных соединений, а именно к способу получения сульфатированных производных хитозана.

Известно, что как природные (гепарин, хондроитинсульфат), так и полусинтетические (декстрансульфат, сульфат хитозана и др.), сульфополисахариды обладают способностью специфического взаимодействия с липопротеинами низкой и очень низкой плотности (ЛНП и ЛОНП) крови, что позволяют использовать их в качестве аффинных лигандов при создании сорбентов для профилактики и лечения атеросклероза, ишемической болезни сердца, гиперхолестеренемии и т. п.

Использование указанных сульфополисахаридов вызывает, однако, ряд трудностей и ограничений, связанных со следующими факторами: а) нестандартность структуры и свойств природных сульфополисахаридов, обусловленная их природой и условиями выделения, а также ограниченность их сырьевой базы и дороговизна, б) сложность известных способов сульфатирования полисахаридов, низкая селективность этих реакций, что ограничивает возможность их дальнейшей направленной модификации. Это объясняет необходимость поиска путей получения новых представителей этого класса сульфополисахаридов, сочетающих высокую эффективность в качестве аффинных лигандов для связывания атерогенных липопротеинов с достаточно технологичными способами их получения. Одним из них могут быть сульфопроизводные хитозана, известного своим гиполипидемическим действием.

Известен способ сульфатирования аминополисахаридов, согласно которому деацетилированный хитин хитозан предварительно активируют, затем сульфатируют, используя комплекс пиридина с хлорсульфоновой кислотой или смесь двухокиси или трехокиси серы [1] В работе отмечается решающее значение для получения полностью растворимого продукта процедуры активации хитозана, которая включает переосаждение полимера, последовательное промывание полученного осадка различными органическими растворителями (абсорбютированный этанол, эфир, пиридин, т. п. причем имеется в виду применение растворителей с высокой степенью обезвоживания).

Известен также способ в соответствии с которым процесс сульфатирования проводят в гетерогенных условиях с использованием также смеси двуокиси серы, хлорсульфоновой кислоты или дымящей серной кислоты. Реакцию предварительно активированного хитозана со смесью двуокиси и трехокиси серы проводят в герметичном сосуде под давлением при -10-0^оС в течение 10-24 ч. В случае же использования смеси пиридина с хлорусульфоновой кислотой реакционную смесь нагревают при 150^оС в течение 6,5 ч [2]
Недостатками изложенных способов сульфатирования являются:
1. Необходимость предварительной активации хитозана для получения мелкодисперсного, реакционноспособного осадка полимера, что усложняет технологический процесс в целом и связи с необходимостью работы с большими объемами дисперсионной воды, затрудненностью фильтрации осадка и т. п.

2. Жесткие условия реакции и длительность обработки, а также необходимость применения агрессивных и высокотоксичных реагентов (пиридин, хлорсульфоновая кислота, дымящая серная кислота).

3. Гетерогенные условия реакции, что может приводить к продуктам с неодинаковой степенью замещения и невоспроизводимыми свойствами.

Наиболее близким техническим решением, выбранным в качестве объекта сравнения, является способ селективного сульфатирования аминогрупп хитозана, при котором к суспензии хитозана в воде добавляют конц. HCl до получения раствора полимера, затем получают осадок хитозана путем добавления 30% NaOH и к полученной суспензии хитозана в щелочи добавляют небольшими порциями пятикратный избыток комплекса пиридин-трехокись серы. Реакцию сульфатирования проводят в течение 20 ч, поддерживая рН суспензии при 9-10, причем до 50% степени замещения она протекает в гетерогенных условиях, а далее система переходит в раствор, который упаривают, диализуют, вновь упаривают, высаживают и сушат [3]
Данный способ получения N-сульфата хитозана обладает практически всеми указанными недостатками, к тому же он трудно реализуем в производстве из-за технологических осложнений, обусловленных:
а) необходимостью переосаждения полимера,
б) длительностью процесса (20 ч),
в) необходимостью применения малоустойчивого и высокотоксичного комплекса пиридин-трехокись серы,
г) неконтролируемым переходом частично сульфатированного продукта из твердого состояния в раствор.

Задачей изобретения является ускорение, упрощение и повышение технологичности процесса получения сульфатированного производного хитозана, обладающего высокой специфичностью к ЛНП и ЛНОП, за счет применения на всех стадиях гомогенных условий модификации полимера доступными и нетоксичными реагентами и сокращения длительности процесса.

Поставленная задача достигается тем, что в способе получения сульфатированного хитозана, включающем обработку хитозана сульфатирующим агентом в водной среде с последующим удалением низкомолекулярных примесей из реакционной смеси и выделением целевого продукта, используют N-малеилированный хитозан с молекулярной массой (3-350)˙10³, а в качестве сульфатирующего агента пиросульфит натрия, и обработку проводят при молярном соотношении N-малеилированный хитозан: пиросульфит натрия, равном 1:1,0-9,0, рН 3,5-6,5, температуре 30-75^оС в течение 0,5-5,5 ч. Малеированный хитозан получают ацилированием хитозана малеиновым ангидридом при двукратном избытке последнего сначала в кислом, а затем в щелочном растворе в течение 1 ч, при комнатной температуре в соответствии с известным способом [4]
Раствор после сульфатирования очищают от низкомолекулярных солей и непрореагировавшего сульфатирующего агента путем диализа против воды или ультрафильтрации. Полученный продукт хорошо растворим в водно-солевых, кислых и щелочных средах.

Способ получения N-сульфосукцината хитозана иллюстрируют следующие примеры.

П р и м е р 1. 1 г хитозана с характеристической вязкостью 3,4 дл/г растворяют в 100 мл 0,2 М ацетатного буфера с рН 5,0 и при интенсивном перемешивании добавляют 0,57 г малеинового ангидрида (МА), растворенного в 2 мл диоксана в течение 15 мин. Образующийся мелкодисперсный осадок частично малеилированного хитозана переводят в раствор добавлением 1 н. раствора до рн 8,5 и к полученному раствору при перемешивании прибавляют раствор МА (0,57 г в 2 мл) в диоксане. Хитозан домалеилируют в течение 1 ч, поддерживая рН среды путем добавления раствора щелочи (1 н. NaOH). После этого проводят сульфатирование полученного продукта путем добавления в реакционную среду небольшими порциями при перемешивании 1,88 г пиросульфата натрия (молярное соотношение МА: пиросульфит натрия 1:4). Реакцию проводят при 50^оС в течение 3 ч, поддерживая рН среды при 4,5 добавлением 0,5 н.серной кислоты. По окончании реакции смесь охлаждают до комнатной температуры, очищают от низкомолекулярных солей ультрафильтрацией до отрицательной реакции на сульфат ионы с использованием водного раствора бария хлорида (10%). Очищенный раствор высаживают в абсолютированный этанол при соотношении раствор осадитель 1:4 по объему, промывают на фильтре этанолом, эфиром и сушат в вакуумном шкафу при 60^оС до постоянной массы. Молекулярная масса и содержание серы N-сульфосукцината хитозана составляет 250 кД и 6,8 мас. соответственно. Аналогично описанному примеру получают N-сульфосукцинат хитозана в других условиях (таблица). Способность полученного сульфата хитозана эффективно связывать ЛНП подтверждается примерами 14 и 15.

П р и м е р 14. К 1 г макропористого стекла с диаметром пор 200 нм модифицированного γ-глицидоксипропилтриоксисиланом добавляют 10 мл 3%-ного раствора N-сульфосукцинат хитозана (мол. м. 70 кД, содержание серы -7,5%) в 0,1 М фосфатном буфере, рН 7,4, перемешивают в течение 6 ч при комнатной температуре, реакционную смесь фильтруют, промывают водой, 10%-ным раствором хлористого натрия, водой и сушат. Содержание иммобилизованного N-сульфосукцината хитозана составляет 0,012 г на 1 г сорбента.

П р и м е р 15. Кровь перфузируют через колонку объемом 1 см³ с адсорбентом, полученным по примеру 3, по замкнутому контуру со скоростью 1 мл/мин в течение 45 мин при соотношении кровь: адсорбент 1:6 по объему. В плазме крови, содержащей 300 мг/дл общего холестерина, после сорбции определяют концентрацию холестерина ЛНР и ЛОНП. Снижение концентрации холестерина после сорбции составляет 70%

Использование: в медицине, в качестве аффинных лигандов при создании сорбентов, для профилактики и лечения атеросклероза, ишемической болезни сердца, гиперхолестеринемии и т.п. Сущность изобретения: N-малеилированный хитозан с мол. м. (3-350)·10³ обрабатывают пиросульфитом натрия при молярном соотношении соответственно 1 1 9, в водном растворе, при рН 3,5 - 6,5, 30 75°С, 0,5 5,5 ч. Низкомолекулярные примеси удаляют, выделяют целевой продукт. 1 табл.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СУЛЬФАТИРОВАННОГО ХИТОЗАНА, включающий обработку хитозана сульфатирующим агентом в водной среде с последующим удалением низкомолекулярных примесей из реакционной смеси и выделением целевого продукта, отличающийся тем, что используют N-малеилированный хитозан с мол.м. (3 350) · 10³, а в качестве сульфатирующего агента пиросульфит натрия и обработку проводят при молярном соотношении N-малеилированный хитозан пиросульфит натрия 1 1,0 9,0, рН 3,5 6,5, температуре 30 75^oС в течение 0,5 5,5 ч.