СПОСОБ ОЧИСТКИ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ ИЗ ТОНКОГО КИШЕЧНИКА ТЮЛЕНЯ Российский патент 1995 года по МПК C12N9/16 

Изобретение относится к биотехнологии и препаративной биохимии и касается очистки щелочной фосфатазы, которая может быть использована в иммуноферментном анализе.

Известен способ получения очищенной щелочной фосфатазы с помощью биоспецифических сорбентов, содержащих в качестве стационарного лиганда группировки бензилфосфоновой кислоты [1] Сорбция фермента проводится при нейтральных рН, а десорбция осуществляется добавлением в элюент 10-150 мМ Na₂HPO₄, являющегося конкурентным ингибитором фосфатаз.

Недостатками данного способа являются: сложный и многостадийный синтез самого лиганда, что существенно влияет на стоимость сорбента, низкая емкость сорбента, необходимость удаления из элюата фосфата натрия, что не всегда удается провести полностью.

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности является способ очистки щелочной фосфатазы из тонкого кишечника тюленя с использованием иммобилизованного конканавалина А (Биохимия, т. 53, 1988, с. 974-978). В качестве аффинного сорбента была использована сефароза 6В с иммобилизованным конканавалином А, уравновешенная трис-HCl буфером, содержащим ионы магния, цинка и хлористый натрий. Элюция фермента достигалась ступенчатым градиентом 50 мМ α -метил-Д-маннопиранозидом, растворенным в стартовом буфере. Активные фракции диализовали против трис-HCl буфера с хлористым магнием и хранили в растворе при 4^оС. Удельная активность очищенного таким способом фермента достигала 1500 ед, на 1 мг белка.

Однако для данного способа характерны недостаточная химическая и микробиологическая стойкость сефарозной матрицы, высокая стоимость импортной конканавалин А-сефарозы 6В, а также невысокая удельная активность получаемой фосфатазы.

Целью изобретения является упрощение и удешевление процесса с одновременным повышением степени очистки фермента.

Указанная цель достигается тем, что в качестве сорбента используют аминопропилированный кремнезем с диаметрами пор 500-3000 с ковалентно присоединенным N-сульфосукцинатом хитозана в количестве 0,5-50 мг на 1 мл сорбента. Исходя из химического строения этого стационарного лиганда, его взаимодействие со щелочной фосфатазой не является очевидным. Возможно, что вклад во взаимодействие вносят близко расположенные кислотные группировки (SO^-₃, COO^-) модифицированного хитозана. Не исключено также влияние полисахаридной матрицы на взаимодействие, так как щелочная фосфатаза из кишечника гренландского тюленя является гликопротеином. Тем не менее сорбент проявляет неожиданно высокую селективность по отношению к фосфатазе, которую нельзя однозначно ожидать из его химического строения. N-сульфосукцинат хитозана получают сульфатированием предварительно малеилированного хитозана пирсульфатом натрия.

Нижняя граница содержания лиганда N-сульфосукцината хитозана 0,5 мг обусловлена тем, что при более низком содержании лиганда существенную роль начинает играть неспецифическое взаимодействие белков разделяемой смеси с матрицей силикогеля, ввиду чего снижается селективность сорбента. В результате понижается степень очистки фермента и выход по активности (пример 6).

Верхняя граница содержания лиганда 50 мг на мл сорбента обусловлена тем, что при ее превышении наблюдается уменьшение удельной активности и выхода щелочной фосфатазы. Вероятно при слишком большом содержании лиганда между ферментом и группами лиганда возникает многоточечное связывание, что может привести к структурным изменениям и частичной инактивации фермента (пример 7).

Нижняя граница диаметра пор силикагеля обусловлена тем, что при меньшем размере пор носителя доступность молекул фермента в поры сорбента затруднена, из-за чего снижается эффективная поверхность сорбента. В результате этого заметно снижается выход по активности фермента (пример 8).

Верхняя граница диаметра пор 3000 обусловлена отсутствием коммерчески доступных силикагелей с большим размером пор.

Способ осуществляется следующим образом.

Колонку, содержащую 1-10 мл аминопропилированного кремнезема с ковалентно присоединенным N-сульфосукцинатом хитозана (0,5-50 мг на 1 мл сорбента), уравновешивают 0,05 М трис-HCl буфером, содержащим 5-50 мМ хлористого магния при рН 7,0-8,0. На уравновешанную колонку наносят 15-150 тыс. единиц активности щелочной фосфатазы в том же буфере. После окончания нанесения раствора фосфатазы колонку промывают уравновешивающим буфером до отсутствия поглощения при λ280 нм, затем проводят элюцию либо линейным градиентом хлористого натрия от 0 до 1 М, либо ступенчатым градиентом 0,2, 0,5 и 1 М. Элюирование щелочной фосфатазы происходит при 0,2 М хлористого натрия.

П р и м е р 1. Стеклянную колонку (10 х 1,2 см) заполняют 10 мл аминопропилированного силохрома с 80 (d пор 500 ) с ковалентно присоединенным N-сульфосукцинатом хитозана (0,5 мг на 1 мл сорбента). Последовательно промывают 1 М хлористым натрием (50 мл), водой (150 мл) и уравновешивают 0,5 М трис-HCl буфером, содержащим 5 мМ хлористого магния при рН 7,0 со скоростью 50 мл/ч в течение 3 ч. На уравновешанную колонку наносят 150000 единиц активности щелочной фосфатазы с удельной активностью 100 ед/мг в трис-HCl буфере при рН 7,0, содержащего 5 мМ хлористого магния и имеющего электропроводность не выше уравновешивающего буфера. Затем колонку промывают уравновешивающим буфером до отсутствия поглощения при λ280 нм и проводят элюцию линейным градиентом (0-1 М) хлористого натрия. Максимум фосфатазной активности элюируется при 0,2 М хлористого натрия. Фракцию, содержащую около 70% нанесенной фосфатазной активности, контролируют с помощью электрофореза в ПААГ в денатурирующих условиях. Выделенной фосфатазе соответствует белковая зона с молекулярной массой около 70000 Да, удельная активность 5000 единиц на 1 мг белка. За единицу активности принимают количество фермента, катализирующее расщепление 1 мкМ р-нитрофенилфосфата за 1 мин при 37^оС в 1 М диэтаноламине, содержащем 10 мМ MgCl₂, при рН 9,0.

П р и м е р 2. Аналогичен примеру 1, но было взято 10 мл аминопропилированного силохрома СХ-1 (d пор 3000 ) с ковалентно присоединенным N-сульфосукцинатом хитозана (50 мг на мл сорбента). Был получен фермент с удельной активностью 4000 ед/мг и выходом 80%
П р и м е р 3. Аналогичен примеру 1, но был взят 1 мл аминопропилированного силикагеля МСА-750 (d пор 750 ), содержащего 25 мл N-сульфосукцината хитозана на 1 мл сорбента. Было нанесено 15000 единиц фермента и получен фермент с удельной активностью 4500 ед/мг и выходом 75%
П р и м е р 4. Аналогичен примеру 1, но было взято 5 мл аминопропилированного силохрома СХ-2 (d пор 1300 ), содержащего 25 мл N-сульфосукцината хитозана на 1 мл сорбента. Нанесено 75000 единиц фермента и был получен фермент 4500 ед/мг с выходом 75%
П р и м е р 5. Аналогичен примеру 1, но было взято 5 мл аминопропилированного силохрома СХ-2 (d пор 1300 ), содержащего 25 мг N-сцльфосукцината хитозана на 1 мл сорбента. Нанесено 75 000 единиц фермента и был получен фермент с удельной активностью 4700 ед/мг с выходом 70%
П р и м е р 6. Аналогичен примеру 1, но уравновешивающий и рабочий буферы имели рН 8,0. Была получена щелочная фосфатаза с удельной активностью 4300 ед/мг с выходом 75%
П р и м е р 7. Аналогичен примеру 1, но количество ковалентно присоединенного N-сульфосукцината хитозана составляет 0,3 мг на мл сорбента. Получен фермент с удельной активностью 2000 ед/мг белка с выходом по активности 40%
П р и м е р 8. Аналогичен примеру 1, но количество ковалентно присоединенного N-сульфосукцината хитозана составляет 55 мг на мл сорбента. Получен препарат фермента с удельной активностью 3800 ед/мг белка с выходом по активности 60%
П р и м е р 9. Аналогичен примеру 1, но диаметр пор силикагеля 3000 . Получен фермент с удельной активностью 4500 ед/мг белка с выходом по активности 40%
Технико-экономический эффект предлагаемого изобретения заключается в получении высокоочищенной (удельная активность 4000-5000 единиц на 1 мг белка) щелочной фосфатазы из тонкого кишечника гренландского тюленя. Фермент с такой активностью пригоден в качестве маркера в высокочувствительном иммуноферментном анализе. Используемые носители намного дешевле конканавалин А-сефарозы 6В. Они могут быть промыты при регенерации щелочами, кислотами, детергентами и органическими растворителями, что затруднительно сделать с аффинными сорбентами на основе сефарозы 6В. Достигаемая высокая селективность при очистке не вытекает из анализа химической структуры используемого сорбента. Жесткая природа исходной матрицы позволяет использовать его в крупномасштабной очистке щелочной фосфатазы.

Использование: биотехнология, препаративная биохимия и области иммуноферментного анализа. Сущность изобретения: очистку щелочной фосфатазы осуществляют нанесением экстракта на хроматографический сорбент, уравновешенный буферным раствором солянокислого триса и магния хлористого, в качестве сорбента используют аминопропилированный кремнезем с диаметром пор 500 - 3000 с ковалентно присоединенным N-сульфосукцинатом хитозана в количестве 0,5 - 50 мг на 1 мл сорбента с последующей элюцией ступенчатым градиентом, созданным добавлением в исходный буферный раствор 0,2 М хлористого натрия. Получают щелочную фосфатазу с удельной активностью 4000 - 5000 ед/мг белка. Продукт пригоден в качестве фермента маркера в высокочувствительном иммуноферментном анализе.

СПОСОБ ОЧИСТКИ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ ИЗ ТОНКОГО КИШЕЧНИКА ТЮЛЕНЯ, предусматривающий нанесение экстракта на хроматографический сорбент, уравновешенный буферным раствором солянокислого триса и хлористого магния, и элюцию ступенчатым градиентом, отличающийся тем, что в качестве сорбента используют аминопропилированный кремнезем с диаметром пор с ковалентно присоединенным N-сульфосукцинатом хитозана в количестве 0,5 50,0 мг на 1 мл сорбента, а ступенчатый градиент создают добавлением в исходный буферный раствор 0,2М хлористого натрия.