АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫЙ, ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫЙ ПРЕПАРАТ Российский патент 1995 года по МПК A61K31/19 

Изобретение относится к медицине, производству лекарственных средств, а именно к средству, которое может быть использовано для лечения острых и хронических тонзиллитов и других воспалений различной этиологии; как антибактериальный агент, а также в качестве средства для лечения дисбактериозов.

Известно, что воспалительные процессы в ротоглотке, в частности, ангины, хронические тонзиллиты, фарингиты характеризуются определенной совокупностью признаков, определяемых клиническими и клинико-инструментальными методами. В частности, отмечаются проявления общей интоксикации (повышенная температура, озноб и др. ), наличие болевого синдрома (боль при глотании, болезненность регионарных лимфоузлов и т.д.), патологические изменения состояния слизистой глотки и миндалин (гиперемия и отек слизистой миндалин, дужек, задней стенки, иногда инфильтрация миндалин, инъекция сосудов). Часто отмечается кровоточивость слизистой, налеты на миндалинах (фолликулы, эрозии, иногда абсцессы). Цитологическое обследование выявляет воспалительную картину, в частности, дистрофические изменения слизистой. Клеточный состав воспалительного инфильтрата представлен обычно нейтрофилами, в меньшей степени лимфо-моноцитарными формами.

ГЖХ-анализ слюны показывает значительное снижение в слюне концентрации летучих жирных кислот (ЛЖК), что указывает на подавление облигатной сахаролитической микрофлоры и глубокие нарушения нормального микробного ценоза ротоглотки. На этом фоне бактериологическое обследование часто выявляет присутствие β-гемолитических стрептококков, в частности, streptococcus pyogenes (цепочки и скопления).

Известны препараты, относящиеся к классу антибиотиков β-лактамного ряда, широко применяемые для лечения различных форм ангин. Они эффективны для терапии тяжелых форм и рекомендуются как препараты выбора. Однако они инициируют рост β-лактамазной микрофлоры, стимулируют возникновение резистентных L-форм, что снижает эффективность дальнейшего применения; снижают антителообразование и местный иммунитет, провоцируют возникновение грибковых заболеваний (кандидозов), вызывают дисбиотические сдвиги, в частности, дисбактериозы кишечника.

Известны бактерицидные препараты нитрофуранового ряда, применяемые местно в виде полосканий. К недостаткам этих препаратов следует отнести недостаточную эффективность и неспецифичность. Они оказывают действие как на патогенную, так и на индигенную микрофлору.

Известно, что смесь ацетата натрия и пропионата натрия используют в качестве противошокового средства.

Целью настоящего изобретения является повышение терапевтической противовоспалительной эффективности в сочетании с антибактериальным эффектом, нормализацией местной микрофлоры и увеличением резистентности слизистой.

Поставленная цель достигается антибактериальным, противовоспалительным препаратом, содержащим смесь ацетата натрия, пропионата натрия и бутирата натрия при следующем соотношении компонентов, мас. ацетат натрия 0,5-35,0; пропионат натрия 36,5-96,5; бутират натрия 2,8-29,0.

Проверка заявленного технического решения на соответствие его критерию изобретательский уровень показала, что ни в научной, ни в патентной литературе, не выявлено совокупности признаков, указанной в отличительной части формулы изобретения.

Состав получают путем нейтрализации смеси предварительно перегнанных уксусной, пропионовой и масляной кислот гидроксидом натрия. К водному раствору кислот, взятых в определенном отношении, прибавляют эквимолярное количество едкого натра в воде (50% раствор). После короткого перемешивания растворитель удаляется в вакууме, сухой остаток сушат до постоянного веса при 140^оС. Состав технологически воспроизводим при граничных и усредненных значениях ингредиентов.

Ниже приводится технология получения препарата по примеру 4. В 3-х литровый стеклянный аппарат, снабженный мешалкой и змеевиковым холодильником, загружают 16,4 г уксусной кислоты. 672 г пропионовой кислоты, 275 г масляной кислоты. Затем при вращающейся мешалке в течение 15 мин добавляется 388 г едкого натра в виде водного 50%-ного раствора. При этом температура раствора повышается до 85^оС. После окончания реакции раствор переводят в выпарной аппарат, откуда отгоняют половину объема растворителя. Затем горячий раствор переводят в вакуум-сушильный шкаф, где в течение 5 часов происходит удаление остатка воды и доведение продукта до постоянного веса при 110-120^оС и остаточном давлении 2-5 мм рт.ст. Образовавшийся белый порошок представляет собой комплекс натриевых солей уксусной, пропионовой и масляной кислот в массовых долях 1,7; 69,8 и 28,5 соответственно. Затем препарат размалывается и фасуется. Препарат представляет собой белый порошок, хорошо растворимый в воде, физиологическом растворе и водном растворе поваренной соли. Может храниться при комнатной температуре в течение 2 лет. Аналогично получают составы, приведенные в примерах 1-12.

Ниже приводятся примеры составов, обладающих антибактериальными и противовоспалительными свойствами (примеры 1-5), и примеры составов, выходящих за границы защищаемого диапазона.

П р и м е р 1. Компонент, мас. Ацетат натрия 0,5 Пропионат натрия 86,3 Бутират натрия 13,2
П р и м е р 2. Компонент, мас. Ацетат натрия 1,0 Пропионат натрия 96,2 Бутират натрия 2,8
П р и м е р 3. Компонент, мас. Ацетат натрия 34,9 Пропионат натрия 36,9 Бутират натрия 28,2
П р и м е р 4. Компонент, мас. Ацетат натрия 1,7 Пропионат натрия 69,8 Бутират натрия 28,5
П р и м е р 5. Компонент, мас. Ацетат натрия 16,3 Пропионат натрия 57,4 Бутират натрия 26,3
П р и м е р 6. Компонент, мас. Ацетат натрия 40,3 Пропионат натрия 23,6 Бутират натрия 36,1
П р и м е р 7. Компонент, мас. Ацетат натрия 0,1 Пропионат натрия 86,5 Бутират натрия 13,4
П р и м е р 8. Компонент, мас. Ацетат натрия 82,2 Пропионат натрия 1,7 Бутират натрия 16,1
П р и м е р 9. Компонент, мас. Ацетат натрия 34,2 Пропионат натрия 20,0 Бутират натрия 45,8
П р и м е р 10. Компонент, мас. Ацетат натрия 50,0 Пропионат натрия 38,9 Бутират натрия 11,1
П р и м е р 11. Компонент, мас. Ацетат натрия 20,2 Пропионат натрия 47,3 Бутират натрия 32,5
П р и м е р 12. Компонент, мас. Ацетат натрия 66,9 Пропионат натрия 31,3 Бутират натрия 1,8
Острую токсичность и переносимость исследуют на мышах и крысах. Опыты проводят на мышах линии С₅₇В1/6 и крысах Вистар, путем однократного внутрибрюшинного введения составов в различных дозах в 0,9% растворе NaCl объемом 0,5 мл (мыши) и 2 мл (крысы). Показано, что состав, введенный в терапевтической дозе (6 мг/кг) и в дозах, превышающих терапевтическую в 20, 30 и 50 раз (120, 180 и 300 мг/кг), соответственно не оказывает негативного влияния на общее состояние, поведенческие реакции животных и массу тела животных, ЛД₅₀ для мышей составляет 3900-5100 мг/кг, для крыс 1800-2400 мг/мг. Не было обнаружено признаков местно-раздражающего действия препарата на слизистые ротоглотки, желудка и брюшину. Отсутствовали гиперемия, отек, изъязвления и некрозы. Исследованные органы (печень, почки, надпочечники, лимфоидная система, сердце, легкие) были без особенностей. В опытах по изучению хронической токсичности состава также не было выявлено их отрицательное влияние на животных.

Бактериостатическое действие препарата.

Бактериостатическое действие препарата оценивают по его эффекту на патогенный β-гемолитический стрептококк гр.А (Str.pyogenes), являющийся одним из основных возбудителей ангин, острых стрептококковых фарингитов, скарлатины и др.

Культуру S. pyogenes тип М 28 в matt-форме (штамм D 33/11 N 62/59 Пражская коллекция) выращивают в течение 18 ч при 37^оС в пробирках с 10 мл Тодд-Хевитт бульона (Difco, США) до плотности инокулята 1,0˙10⁷ КОЕ/мл, в присутствии предлагае- мого состава, растворенного в физиологическом растворе ("опыт") и без него ("контроль"). При этом препарат берут в такой дозе, чтобы конечная концентрация соответствовала составам по примерам 1-10.

Полное исключение одного из компонентов системы или снижение концентрации ниже указанных в формуле изобретения концентраций значительно снижало эффект, а в некоторых случаях приводило к стимулированию роста культуры патогена.

Для оценки ингибирования проводят измерения оптической плотности бактериальных суспензий на спектрофотометре Perkin Elmer в стандартной кювете на длине волны 450 нм.

Антимикробная активность.

Антимикробную активность препарата оценивают препарата оценивают в опытах in vivo на мышах С 57 (Black), зараженных внутрибрюшинным введением дозой Str.pyogenes, равной LD₅₀ (0,5-1,0˙10⁷ КОЕ/мл) в объеме 0,5 мл. Через 20 мин после введения суспензии стрептококка мышам опытной группы внутрибрюшинно вводят по 0,5 мл 40 мг препарата в физиологическом растворе. Мышам контрольной группы вводят 0,5 мл физиологического раствора. Результаты суммированы в табл.2.

Препарат уменьшает вирулентность патогенной микрофлоры. Это проявляется, в частности, в снижении гидрофобности бактериальных клеток (на примере S. pyogenes), снижении адгезии S.pyogenes к эпителиальным клеткам и фибронектину.

Оценка гидрофобности клеток производят путем спектрофотометрического изучения оптической плотности клеточных суспензий на длине волны 450 нм (Perkin Elmer). Исследуют 18-часовые культуры стрептококка, выращенные на Todd Hewitt бульоне при 37^оС. Гидрофобность культуры измеряют по разности оптических плотностей суспензии клеток, отнесенной к исходной в в 0,01 М натрий-фосфатном буфере с 0,15 М NaCl до и после встряхивания с гексадеканом при 6000-7000 g в течение 1 мин на Vovtex'e. Данные по изменениям гидрофобности сведены в табл.3.

Из табл.3 следует, что предложенный состав снижает гидрофобность патогенного стрептококка. Напротив, выход концентраций компонентов за указанные в формуле изобретения пределы или попадание концентрации бутирата натрия в "особую точку" (около 10 мм) приводит к увеличению гидрофобности, т.е. к увеличению адгезивных свойств патогена. Добавление препарата к культуре низкогидрофобного непатогенного вида S.salivarius приводит к росту его гидрофобности.

Снижение адгезивных свойств патогенного Str.pyogenes обнаруживается также в модельных экспериментах на суспензиях буннального эпителия. Клетки с внутренней поверхности щек соскабливаются деревянным шпателем, помещают в забуференный физиологический раствор (ЗФР) при рН 7,2-7,4, отмывают от индигенной микрофлоры центрифугированием при 1000 g. Отмытый эпителий инкубируют 10 мин при 37^оС с культурой Str.pyogenes и составом по примерам 1-9. Затем эпителиальные клетки отмывают и после фиксации и окрашивания просматривают под световым микроскопом. Визуально подсчитывают количество инфицированных клеток (% ), среднее количество бактерий на одну клетку (), индекс адгезии (ИА) произведение доли инфицированных клеток на , а также показатель эффективности ингибирования адгезии по формуле:
ЭИ ·100% где (ИА)_к индекс адгезии в контроле;
(ИА)_о индекс адгезии в опыте.

Исследования адгезии проиллюстрированы для различных примеров состава и суммированы в табл. 4.

Нормализация микробного ценоза, увеличение резистентности слизистой.

Состав нормализует инфраструктуру микробного ценоза ротоглотки в целом. Основу микроэкологической системы ротоглотки составляют сахаролитические анаэробы, отщепляющие моносахариды от гликопротеинов слюны и гликокалипса и сбраживающие их до летучих жирных кислот (ЛЖК), то есть уксусной, пропионовой и масляной. При ангине и хроническом тонзиллите происходит снижение общей концентрации ЛЖК в слюне, а также изменение их профиля. Это является указанием на глубокое изменение инфраструктуры микроценоза за счет подавления сахаролитических анаэробов. Применение препарата при хроническом тонзиллите позволяет нормализовать концентрацию и профиль ЛЖК в слюне.

Содержание и профиль ЛОЖК в слюне определяют методом ГЖХ на хроматографе "Хром-41" с пламенно-ионизационным детектором, насадочной колонкой из нержавеющей стали и неподвижной жидкой фазой 15% Carbowax 20 М, модифицированный 1,5% терефталевой кислотой. Твердая фаза Chromaton N-AW.

Образцы слюны собирают утром натощак, с предварительной чисткой зубов накануне вечером. Для терапии использовался состав по примеру 5. В табл. 5 приведены результаты исследования.

Состав оказывает слабое стимулирующее действие на рост характерного представителя непатогенной ауто-микрофлоры стрептококка гр. D-Str.salivarius. Оценку проводят спектрофотометрическим методом, используя штамм Str. salivarius К 28. Результаты измерений приведены в табл. 6.

Препарат усиливает секрецию, трофику и резистентность слизистой, что подтверждается усилением синтеза секреторного компонента иммуноглобулина А (S I_gA).

В табл.7 представлены средние цифры, полученные при лечении 10 волонтеров с обострением хронического тонзиллита, составом по примеру 3.

Содержание S I_gA в слюне определяют путем использования антисывороток к тяжелой Н-цепи и S-компоненту.

Противовоспалительное действие.

Состав (по примерам 1, 3, 5) обладает противовоспалительным эффектом, что показали предварительные испытания его терапевтической активности на 30 волонтерах с обострением хронического тонзиллита. Препарат применяют в виде полосканий горла в течение 3-х дней по 6 раз в день (≈ 1000 мг препарата в 100 мл воды на одно полоскание).

В результате лечения за 2-3 дня у больных исчезали проявления интоксикации (повышенная температура тела, головная боль, озноб).

Отмечалась ликвидация местных признаков воспаления: гиперемии различных отделов, кровоточивости, уменьшалось количество нейтрофилов в инфильтрате при цитологическом обследовании.

Таким образом, проведенное испытание состава показывает, что он обладает антибактериальной активностью по отношению грамположительной кокковой микрофлоре, препятствует срабатыванию ее аппарата вирулентности, не оказывая при этом токсического действия на непатогенную аутофлору.

Состав физиологичен, совершенно нетоксичен, не оказывает побочных эффектов на организм экспериментальных животных, так как представляет собой сочетание естественных низкомолекулярных метаболитов сахаролитической аутофлоры, получаемое химическим путем. Состав активирует механизмы местного иммунитета и улучшает трофику эпителия слизистой.

Предварительные клинические испытания показывают хорошую терапевтическую эффективность состава, выражающуюся в исчезновении воспалительной симптоматики при использовании состава по поводу обострения хронического тонзиллита, что подтверждается клиническими и цитологическими данными. Он хорошо растворим в воде, удобен при транспортировке, допускает различные формы введения, стабилен при хранении в течение 2 лет.

Использование: медицина, антибактериальный противовоспалительный лекарственный препарат для лечения острых и хронических тонзиллитов и других воспалений различной этиологии, а также для лечения дисбактериозов. Сущность: антибактериальный, противовоспалительный препарат включает в себя смесь ацетата, проционата и бутирата натрия при следующем соотношении компонентов, мас. цветат натрия 0,5 35,0; пропионат натрия 36,5 96,5; бутират натрия 2,6 29,0. Предложенный лекарственный препарат нетоксичен, хорошо растворим в воде, устойчив при хранении, показывает высокий терапевтический эффект, не вызывает побочных действий. 8 табл.

АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫЙ, ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫЙ ПРЕПАРАТ, отличающийся тем, что он содержит смесь ацетата, пропионата, бутирата натрия при следующем соотношении компонентов, мас.

Ацетат натрия 0,5 35,0
Пропионат натрия 36,5 96,5
Бутират натрия 2,8 29,0