АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫЙ ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫЙ ПРЕПАРАТ Российский патент 1995 года по МПК A61K31/19 

Изобретение относится к производству лекарственных средств для ветеринарии.

Известно, молодняк домашних животных и птицы, чувствителен к кишечной инфекции, приводящей к возникновению энтероколитов, диарее и, как следствие, понижению сохранности и приростов в раннем неонатальном периоде, когда имеется высокая энергозависимость организма из-за отсутствия отлаженной системы терморегуляции. В частности, это характерно для поросят и цыплят. Отмечается также гиперчувствительность поросят-сосунов к антителам корма.

Известны препараты, относящиеся к классу антибиотиков ряда тетрациклинов, например, биомицин, широко использующийся для лечения и профилактики энтероколитов у поросят и цыплят-бройлеров.

К недостаткам этих препаратов относятся многочисленные побочные явления, связанные с поражениями слизистых оболочек, подавлением местного иммунитета, факторов неспецифической резистентности, возникновение кандидозов.

Известны препараты, относящиеся к классу аминогликозидов, например, колимицин, применяемый в лечении гастроэн- теритов у поросят. К недостаткам этого препарата относится высокая ото-, нефротоксичность, провоцирование дисбактериозов.

Известны препараты нитрофуранового ряда, применяемые в лечении сальмонеллезов у поросят, в частности фуразолидон. К недостаткам этого класса препаратов относится их недостаточная эффективность, гепатотоксичность, частые аллергические реакции.

Известны антимикробные препараты (в основном в виде лосьона или геля), содержащие соли жирных кислот С₅-С₁₂. Недостаток этих препаратов заключается в том, что они являются ксенобиотиками, обладают сравнительно узким спектром антимикробного действия и невысокой биологической активностью.

Целью изобретения является повышение терапевтической эффективности, в сочетании с антибактериальным эффектом, нормализацией инфраструктуры аутофлоры и увеличением резистентности слизистой оболочки.

Поставленная цель достигается антибактериальным противовоспалительным препаратом, представляющим собой смесь натриевых солей короткоцепочечных монокарбоновых кислот при следующих соотношениях компонентов, мас. Формиат натрия 0,5-44,7 Ацетат натрия 34,8-43,6 Пропионат натрия 6,3-36,7 Бутират натрия 5,1-28,0
Проверка заявленного технического решения на соответствие его критерию изобретательский уровень показала, что ни в научной, ни в патентной литературе не выявлено совокупности признаков, указанной в отличительной части формулы изобретения. Состав представляет собой набор метаболитов сахаролитической анаэробной аутофлоры животных, но в данном случае получаемый химическим путем.

Состав получают путем нейтрализации предварительно перегнанной смеси муравьиной, уксусной, пропионовой и масляной кислот, гидрооксидом натрия. К водному раствору кислот, взятых в определенных массовых долях прибавляют эквимолярное количество едкого натра в воде (50%-й раствор). После непродолжительного перемешивания растворитель удаляется в вакууме, сухой остаток сушится до постоянного веса при 140^оС. Состав технологически воспроизводим при граничных и усредненных значениях исходных компонентов.

Ниже приводится технология получения препарата по примеру 4.

П р и м е р. В 5 л стеклянную емкость, снабженную мешалкой и змеевиковым холодильником, загружают 401 г муравьиной кислоты, 440 г уксусной кислоты, 102 г пропионовой кислоты и 61 г масляной кислоты. Затем при вращающейся мешалке в течение 15-20 мин добавляют 724 г едкого натра в виде водного 50%-ного раствора. При этом температура раствора повышается до 70-85^оС. По окончании перемешивания раствор переводят в выпарной аппарат и при нагревании в вакууме удаляется половина объема воды. Затем горячий раствор помещают в вакуум-сушильный шкаф, где при 110-120^оС и давлении 2-5 мм рт.ст. в течение 3-5 ч происходит удаление остатка растворителя и доведение продукта до постоянного веса. Образовавшийся белый остаток измельчают и перемалывают. Продукт содержит смесь формиата, ацетата, пропионата и бутирата натрия в массовых долях 42,8, 43,2, 8,9, 5,1, соответственно.

Аналогичным образом получают составы, приведенные в примерах NN 1-12.

Препарат представляет собой белый или светло-желтый порошок, хорошо растворимый в воде, физиологическом растворе и водном растворе поваренной соли. Препарат может храниться в полиэтиленовой упаковке при комнатной температуре в течение 2 лет.

Острая и хроническая токсичность состава исследована на мышах линии С₅₇Bl/6 и крысах Вистар. Препарат вводился внутрибрюшинно в дозах 6-300 мг/кг (т. е. в терапевтической и а 20-и и 30-и 50-и кратном избытке). Было установлено, что состав за исключением примера N 5 не оказывает влияния на общее состояние животных и их поведенческие реакции.

Патоморфологическое исследование внутренних органов и анализ биохимических показателей сыворотки крови подтвердили отсутствие патогенных воздействий. Отмечается прирост массы тела. LD₅₀ для мышей составил 4980 мг/кг, для крыс 4432 мг/кг. Для состава по примеру 5 были получены величины 1866 и 1521 мг/кг соответственно, в связи с чем эта композиция не включалась в защищаемый диапазон. При пероральном введении было установлено, что препарат не дает признаков местно-раздражающего действия (отсутствие гиперемии, отека, изъязвлений и некрозов слизистой).

Было проведено также исследование специфической токсичности состава, в частности, его мутагенной активности, эмбриотоксичности, изучение аллергенных свойств.

Исследование мутагенной активности было проведено методами учета рецессивных, сцепленных с полом, летальных мутаций у Dr. melanogaster и доминантных летальных мутаций в зародышевых клетках мышей. Было установлено, что состав при пероральном введении в диапазоне доз 6-2490 мг/кг не обладает мутагенными свойствами.

Исключением оказался состав по примеру 9, который обнаружил достоверную повышенную долю хромосом с летательными рецессивными мутациями (0,58 ± 0,18 при 0,19 ± 0,12 в контроле). В связи с выявленным обстоятельством состав N 9 не включен в защищаемый диапазон. При исследовании аллергенной активности было проведено изучение реакций активной кожной анафилаксии, системной анафилаксии, иммунных комплексов, гиперчувствительности замедленного типа и дегрануляции тучных клеток. Информация, полученная при системной оценке аллергенных свойств состава свидетельствует об отсутствии в изученных дозах 6-60 мг/кг аллергизирующего действия. Было также установлено отсутствие у состава эмбриотоксических и тератогенных свойств.

Ниже приводятся примеры составов, обладающих антибактериальными и противовоспалительными свойствами (примеры 1-4) и примеры составов, выходящих за границы защищаемого диапазона.

П р и м е р 1.

Компонент, мас. Формиат натрия 0,5 Ацетат натрия 34,8 Пропионат натрия 36,7 Бутират натрия 28,0
П р и м е р 2.

Компонент, мас. Формиат натрия 44,7 Ацетат натрия 43,6 Пропионат натрия 6,3 Бутират натрия 5,4
П р и м е р 3.

Компонент, мас. Формиат натрия 22,4 Ацетат натрия 39,2 Пропионат натрия 24,7 Бутират натрия 13,7
П р и м е р 4.

Компонент, мас. Формиат натрия 42,8 Ацетат натрия 43,2 Пропионат натрия 8,9 Бутират натрия 5,1
П р и м е р 5.

Компонент, мас. Формиат натрия 45,0 Ацетат натрия 38,8 Пропионат натрия 10,6 Бутират натрия 5,6
П р и м е р 6.

Компонент, мас. Формиат натрия 0,4 Ацетат натрия 42,0 Пропионат натрия 36,0 Бутират натрия 21,6
П р и м е р 7.

Компонент, мас. Формиат натрия 39,2 Ацетат натрия 34,0 Пропионат натрия 16,5 Бутират натрия 10,3
П р и м е р 8.

Компонент, мас. Формиат натрия 21,1 Ацетат натрия 45,0 Пропионат натрия 26,4 Бутират натрия 7,5
П р и м е р 9.

Компонент, мас. Формиат натрия 1,9 Ацетат натрия 35,6 Пропионат натрия 33,5 Бутират натрия 29,0
П р и м е р 10.

Компонент, мас. Формиат натрия 28,2 Ацетат натрия 36,7 Пропионат натрия 30,6 Бутират натрия 4,5
П р и м е р 11.

Компонент, мас. Формиат натрия 20,2 Ацетат натрия 36,1 Пропионат натрия 38,0 Бутират натрия 5,7
П р и м е р 12.

Компонент, мас. Формиат натрия 43,6 Ацетат натрия 42,9 Пропионат натрия 6,0 Бутират натрия 7,5
Сальмонеллезы (паратиф) одна из широко распространенных инфекционных болезней поросят отъемышей. Вызывается бактериями паратифозной группы сальмонеллами [1b] В связи с этим была проведена оценка бактериостатического действия состава in vitro по его эффекту на Salmonella.

Культура S.enteritidis выращивалась в течение 18 ч при 37^оС в пробирках с 10 мл бульона (Todd-Hewitt) до плотности инокулята 1˙10⁹КоЕ/мл в присутствии исследуемого состава ("опыт") или без него ("контроль"). При этом препарат берется в такой дозе, чтобы конечная концентрация соответствовала составам примеров. Оценка эффектов проводилась путем измерения оптической плотности (OD) бактеральных суспензий на спектрофотометре Perkin-Elmer в стандартной кювете при длине волны 450 нм. Процент ингибирования вычисляется по формуле:
инг. (1)
Из данных табл.1 видно, что составы 2, 4, 5 с высоким содержанием формиата натрия обладают довольно значительным ингибирующим эффектом по отношению к S. enteritidis, у состава 4 с высоким содержанием формиата и пропионата эффект максимален. Состав 1, не содержащий формиата натрия, сравнительно менее эффективен, а состав, с содержанием формиата, выходящий за пределы диапазона, даже стимулирует рост сальмонелл (N 6). В связи с этим, состав по примеру 6 не включен в защищаемый диапазон.

Бактериостатическое действие состава оценивают также по его влиянию на патогенный β -гемолитический стрептококк гр.А (Str. pyogenes), являющийся как известно, этиологическим агентом различных заболеваний респираторного, желудочно-кишечного трактов, кожных заболеваний, системных артритов, и т.д. и у людей и животных. В связи с этим бактериостатическое действие состава оценивалось по его воздействию на музейные и естественные штаммы стрептококков гр.А и гр.В.

Культуру S-pyogenes тип-М29 в matt-форме (штамм D33/11 N 62/59, Пражская коллекция) выращивали аналогично предыдущему примеру. Таким же образом проводилась оценка ингибирования роста.

Из данных таблицы 2 видно, что эффективность ингибирования в значительной степени определяется долей пропионата в составе. В частности, при содержании этого компонента менее 6,3% в составе происходит резкое снижение ингибирующего эффекта (пример 12). Состав по примеру 12 в защищаемый диапазон не включается.

Госпитальный штамм Str. agalactiae (Str.B) выращивался как указано выше и аналогичным образом проводилось изучение ингибирующего влияния препарата.

Примеры 1,4 показывают, что различные варианты состава обладают способностью ингибировать рост стрептококка В в культуре. При этом, более эффективным оказывается состав содержащий формиат (табл.3).

Антимикробная активность состава оценивалась путем исследования его воздействия на факторы вирулентности типичных патогенного Str. pyogenes и непатогенного стрептококков Str. salivarius, соответственно. Было изучено влияние состава на гидрофобность и адгезивные свойства.

Оценку гидрофобности культуры производят путем спектрофотометрического изучения оптической плотности клеточных суспензий на длине волны 450 нм (спектрофотометр Perkin-Elmer). Исследуют 18-часовые культуры стрептококка, выращенные на Todd-Hewitt бульоне при 37^оС. Гидрофобность культуры измеряют по разности оптических плотностей суспензий клеток, отнесенной к исходной (% ), в 0,01 М натрий-фосфатном буфере с 0,15 М NaCl до и после встряхивания с гексадеканом, при 6000-7000 д в течение 1 мин на Vortex'e.

Из данных табл.4 видно, что состав по примерам 1, 4 снижает исходную гидрофобность патогенного стрептококка. Как известно, гидрофобность Str. pyogenes определяется в основном содержанием и экспонированием в клеточной стенке одного из основных факторов вирулентности-М-белка. Полученный результат может рассматриваться как свидетельство снижения вирулентности патогенной культуры.

Напротив, состав по примеру 8 при его воздействии на культуру S. pyogenes обнаруживает способность увеличивать гидрофобность клеток патогенного стрептококка. Состав по примеру 8 в защищаемый диапазон не включается.

Воздействие на непатогенный S. salivarius приводит к некоторому увеличению его гидрофобности, т.е. способности к адгезии.

Снижение адгезивных свойств β -гемолитического стрептококка проявляется также в модельных экспериментах на суспензиях буккального эпителия поросят. Клетки с внутренней поверхности щек соскабливают деревянным шпателем, помещают в забуференный физиологический раствор (ЗФР) при рН 7,2-7,4, отмывают от индигенной микрофлоры центрифугированием при 1000 g. Отмытый эпителий инкубируют 10 мин при 87^о с культурой Salmonella enteritidis, в присутствии антибактериального состава или без него. Затем эпителиальные клетки отмывают и после фиксации и окрашивания просматривают под световым микроскопом. Визуально подсвечивают долю инфицированных клеток, среднее количество бактерий на одну клетку (x), индекс адгезии (1А), равный произведению доли инфицированных клеток на х, а также показатель эффективности адгезии по формуле
E₁= ×100% где IА_k индекс адгезии в растворе;
IА_о индекс адгезии в присутствии состава.

Таким образом составы заметно препятствуют адгезии патогенного стрептококка к суспензии буккального эпителия, исключая состав по примеру 8, эффективность которого по этому показателю заметно ниже (табл.4).

Антимикробную активность состава оценивают также in vivo на мышах линии С57 Black, зараженным путем внутрибрюшинного введения суспензии патогенного стрептококка (табл. 6). Используют дозу Str. pyogenes равную LD₅₀(0,5-1,0 х 10⁷ коЕ/мл) в объеме 0,5 мл. Через 20 мин после введения суспензии стрептококка мышам опытной группы также внутрибрюшинно вводят 0,5 мл физиологического раствора состава в дозе 40 мг. Мышам контрольной группы вводят 0,5 мл физиологического раствора. По окончании опыта выживших животных забивают и оценивают патологические изменения внутренних органов.

Были сформированы три группы поросят по три гнезда (10 сосунов) в каждой. Одна группа служила контролем. Поросятам первой опытной группы скармливают состав по примеру 1, второй группы по примеру 4, третьей по примеру 10.

В разных гнездах каждой из трех групп применялись различные схемы введения. В одном из гнезд препарат скармливался орально с 6 дневного возраста, в остальных двух с начала подкормки, результаты усреднялись. Общая схема кормления была стандартной. Доза препарата во всех случаях была одинакова 1,5 г состава в 10 мл воды ежедневно. Продолжительность введения 20 дней. Динамика живой массы поросят-сосунов представлена в табл.7.

Таким образом, поросята-сосуны, получавшие в доотъемный период препарат в дозе 577-91 мг/кг обнаруживают заметный прирост.

Проведено колоноскопическое исследование с биопсией поросят всех 4-х групп по одному из каждой группы. Эндоскопическая картина представителей 3-х опытных групп без особенностей, в контрольной группе отмечалась гиперплазия крипт, смазывание сосудистого рисунка и некоторая нейтрофильная инфильтрация lamina propria. Эти признаки могут рассматриваться как проявление местной гиперчувствительности на антигены прикорма, характерные для ранних сроков прикорма [3] Так как эта реакция находится под контролем секреторного иммуноглобулина А (S-lgA) было проведено исследование его количество в кишечном содержимом методом Манчини с использованием диагностического набора для секреторных иммуноглобулинов производства "Биомед". Результаты определения приведены в таблице 8, в условиях динамики.

Сразу после отъема все поросята контрольной группы заболели диареей. В посевах были обнаружены энтеропатогенные штаммы E.coli. Колоноскопическое обследование показало значительное усиление нейтрофильной инфильтрации слизистой. Отмечались и другие признаки воспаления, в частности, гиперемия слизистых и гиперплазия крипт.

Анализ секреторного s-lgA в кишечном содержимом показал, что при воспалении происходит снижение доли s-lgA по сравнению с lgA.

Напротив в опытных группах диарея не возникала, цитологическое обследование не обнаруживало нейтрофильной инфильтрации, а отношение [lgAl/[s-lgA] оставалось меньше 1, исчезали гиперемические явления, нормализовался сосудистый рисунок, гиперплазия крипт практически не отмечалась (табл.8).

Таким образом, состав обнаруживает способность усиливать местный иммунитет за счет выработки протективных иммуноглобулинов, снабженных защитным гликопротеидом, а также противовоспалительную активность, препятствуя "незаконной" инфильтрации слизистой и собственной пластики нейтрофилами, способствуя ликвидации эндоскопических признаков воспаления.

Исключение составляет состав по примеру 10, у которого эта способность выражена в меньшей степени, в частности, в группе обнаружено 6 случаев возникновения диареи. Состав в защищаемый диапазон не включается.

Применение к подвергшимся заболеванию диареей поросятам контрольной группы и группы по примеру 10 составов по примерам 1 и 4 в дозах 1,5 г/день соответственно позволило вылечить животных в течение 3-дней.

На птицефабрике "Красногорская" исследовалось влияние составов по примерам 2, 3, 7, 11 на сохранность и привес цыплят раннего возраста. Было сформировано 8 групп птиц (4 опытных и 4 контрольных) по 200 голов в каждой с одинаковым количеством петушков и несушек. Составы вводили ежедневно в стандартный рацион ПК-4М молодняка птицы в первые 10 дней жизни сразу по поступлении с инкубаторской фабрики в дозе 50 мг на голову. Т.о. первоначальная доза составляла около 2,5 г/кг.

Результаты опыта представлены в табл.9. Из данных таблицы видно, что составы по примерам 2 и 3 заметно увеличивают привес у петушков, но в меньшей степени у молодок. Состав по примеру 2 значительно увеличивает сохранность молодок, состав по примеру 3 напротив в большей степени влияет на сохранность петушков. Причиной отхода в большинстве случаев явился колибактериоз. В целом -группе, оба состава обеспечивают значительный (33-35%) прирост биомассы. Составы по примерам 7 и 11 вообще не обеспечивают суммарного эффекта по группе, причем выявляется тенденция снижения сохранности у молодок. В связи с этим, оба состава не включались в защищаемый диапазон.

Таким образом проведенные исследования состава показали, что он обладает антибактериальной активностью как по отношению к грамположительной, так и грамотрицательной микрофлоре, ингибирует ее адгезию к эпителию, он обладает также противовоспалительным эффектом, усиливает местный иммунитет.

Состав не обладает ни общей ни специфической токсичностью, не оказывает побочных эффектов на организм экспериментальных животных, поросят-сосунков, молодняка птицы, так как представляет собой совокупность естественных метаболитов, в норме продуцируемых сахаролитическими анаэробами. В рамках данного технического решения эта совокупность метаболитов получается химическим путем.

Состав хорошо растворим в воде, удобен при транспортировке, стабилен в течение 2-х лет, может вводиться в организм животного в виде раствора, таблеток, капсул и применяться как с наполнителем, так непосредственно.

Изобретение относится к составам антибактериальных, противовоспалительных препаратов, в частности используемым в ветеринарии. Состав содержит: смесь формиата, ацетата, пропионата и бутирата натрия при следующих соотношениях компонентов, мас. формиат натрия 0,5-44,7; ацетат натрия 34,8-43,6; пропионат натрия 6,3-36,7; бутират натрия 5,1-2,8; 9 табл.

АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫЙ ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫЙ ПРЕПАРАТ, содержащий соли жирных кислот, отличающийся тем, что в качестве солей жирных кислот он содержит формиат натрия, ацетат натрия, пропионат натрия и бутират натрия при следующем соотношении компонентов, мас.

Формиат натрия 0,5 44,7
Ацетат натрия 34,8 43,6
Пропионат натрия 6,3 36,7
Бутират натрия 2,8 5,1