СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СЫВОРОТКИ ПРОТИВ ВИРУСНОГО ЭНТЕРИТА НОРОК Российский патент 1995 года по МПК A61K39/23 

Изобретение относится к биотехнологии и касается способа получения сыворотки против вирусного энтерита норок.

Вирусный энтерит острое инфекционное заболевание норок, характеризующееся поражениями желудочно-кишечного тракта, селезенки, лимфатических узлов, тимуса, костного мозга и т.д.

Не разработан специфический метод лечения. Применение антибиотиков широкого спектра действия, препаратов нитрафуранового ряда, сульфиниламидных препаратов и других лечебных медикаментозных средств способствуют более легкому течению заболевания вследствие влияния на развитие секундарной бактериальной микрофлоры.

Известны сыворотки, полученные для серологической диагностики вирусного энтерита норок (Р.Г.Дубовая, 1972; А.К.Кириллов, 1974). Сыворотки получены путем гипериммунизации норок, кроликов и лошадей. Предложенные сыворотки использовались для диагностики вирусного энтерита норок в реакции диффузионной преципитации (РДП) и обладали неспецифичностью, так как для гипериммунизации использовали недостаточно очищенный тканевой антиген, выделенный из проб кала и желудочно-кишечного тракта. Кроме того, при постановке РДП очень часто выявлялись двойные-тройные линии преципитации. Сыворотки не годились для использования в реакции торможения гемагглютинации (РТГА). Лечебные свойства предложенных сывороток не было изучено.

Целью изобретения является повышение диагностических свойств и лечебно-профилактической активности сыворотки против вирусного энтерита норок.

Цель достигается тем, что для гипериммунизации продуцентов (коз) используется очищенный и концентрированный штамм "Родники" virus enteritis lutreo larum с изменением схемы введения антигена и применением на определенном этапе полного адъюванта Фрейнда.

П р и м е р 1. Для гипериммунизации животных используют вирус энтерита норок штамм "Родники", культивируемый в первично-трипсинизированной культуре клеток почки котенка. После получения суспензии клеток вносят вирус в соотношении 1:5 и в течение 1-2 ч при 37±0,5^оС. Затем суспензию клеток вместо с вирусом разводят до концентрации 600-800 тысяч клеток в 1 см³ питательной средой, состоящей из 45-50% 0,5%-ного гидролизата лактальбумина на растворе Хенкса, 25-30% среды 199, 10-15% среды Игла и 8-10% сыворотки крови эмбрионов крупного рогатого скота (фетальная сыворотка телячья) с добавлением антибиотиков и разливают в 1,5-литровые матрасы. Температура культивирования (37 ±0,5)^оС. Через 2-4 сут после полного образования монослоя питательную среду сливают (I слив) и добавляют поддерживающую среду, состоящую из равных объемов, 0,5%-ного гидролизата лактальбумина и среды 199.

Через 9-11 сут культивирования матрасы с вирусом и клетками замораживают при температуре минус 40^оС и размораживают при комнатной температуре. Эту процедуру повторяют 2-3 раза и объединяют (II слив).

До этого I слив вируссодержащей жидкости, содержащей много балластных веществ, ультрафильтруют через систему "Милипор" размером пор 0,22-0,45 мкм, очищают хлороформом. После проведения обработок I слив объединяют со II сливом. Берут пробы для определения инфекционной и гемагглютинирующей активности, которая должна быть не ниже 10^4,5 ИД_50/см³ и 1:128 ГАЕ/см³ соответственно. Дополнительную очистку и концентрацию вируса проводят хроматографическим методом. Кроме того, концентрацию вируса можно проводить полиэтиленгликолем.

Для гипериммунизации продуцентов используют вирусный антиген с активностью 10⁶ ИД_50/см³ для культуры клеток и 1:4096 ГАЕ/см³. Вводят животным в первый раз внутривенно в объеме 4-5 см³, через неделю внутримышечно в объеме 5-6 см³, через 14-15 дней внутривенно в объеме 5-6 см³, через 21-23 сутки подкожно с равным объемом полного адьюванта Фрейнда 10-12 см³ и через 49-53 сутки после первого введения внутривенно в объеме 10-12 см³. После 10-14 сут у коз берут пробы крови по 4-5 см³ для определения активности сыворотки. Полученная сыворотка имеет активность в РДП 1:256 и в РТГА 1:2048.

Через 20-24 сут после последнего введения антигена осуществляют забор крови у продуцентов. Кровь берут из яремной вены перед кормлением животных (до этого в течение суток не кормят при обильном кормлении). Полученную кровь ставят на 30-45 мин в термостат с температурой (37±0,5)^оС, затем в холодильную камеру при температуре (4±2)^оС в течение 10-12 ч, после чего осторожно, соблюдая стерильность, отсасывают сыворотку (I слив). Оставшуюся часть крови центрифугируют при 2000-3000 об/мин и снова отсасывают сыворотку (II слив), объединяют I и II сливы, фильтруют через систему "Милипор" и добавляют консерванты (фенол или мертиолят).

П р и м е р 2. Полученную сыворотку проверяют по физическим и биологическим свойствам.

По внешнему виду сыворотка представляет собой прозрачную жидкость, светло-желтого цвета без наличия посторонних примесей, неразбивающихся хлопьев.

Сыворотка должна быть не контаминированной бактериальной и грибковой микрофлорой. Для изучения безвредности сыворотки для животных вводят белым мышам подкожно по 0,5 см³, морским свинкам по 1,0 см³ и норкам 2,0 см³. Животные должны оставаться живыми в течение 10 сут наблюдения.

П р и м е р 3. Диагностические исследования препарата проводят в РДП и РТГА. Для этого берут изоляты вируса, выделенных из проб кала от зверей в хозяйствах во время вспышки вирусного энтерита среди норок. В качестве контрольного антигена берут вирус энтерита норок штамм "Родники" и сыворотку гипериммунную, полученную от этого штамма. Установлено, что изоляты вируса из хозяйств, неблагополучных по вирусному энтериту, в серологических реакциях дают аналогичные результаты как и контрольные антиген и сыворотка в РДП 1:32-1:128, в РТГА 1:512-1:2048.

П р и м е р 4. Изучение лечебных свойств предложенной сыворотки проводят на норках. Для этого за 24 ч до заражения зверям вводят сыворотку внутримышечно в объемах 0,5, 1,0, 2,0 и 3,0 см³ и животных заражают вирулентным вирусом энтерита норок штамм "Родники" в дозе 10⁶ ИД_50/см³. Результаты исследований приведены в табл. 1.

Данные табл. 1 свидетельствуют, что предложенная сыворотка в объеме 2,0 см³ предохраняет норок от заболевания и гибели вирусным энтеритом.

Для выяснения сроков введения сыворотки в лечебных целях вводят ее норкам в разные сроки до заражения и после заражения вирулентным вирусом энтерита норок. Результаты исследований приведены в табл. 2.

По результатам исследований установлено, что предложенная гипериммунная сыворотка обладает лечебными свойствами.

Использование: биотехнология, ветеринарная вирусология. Сущность изобретения: для гипериммунизации продуцентов используется очищенный и концентрированный штамм "Родники" Virus enteritis lutreo larum с биологической активностью 10⁶ИД₅₀/см³ и активностью 1:4096 ГАЕ/см³ который вводят козам по 5-12 см³ с интервалом между инъекциями 7 10 сут, а затем через 28 - 30 сут. Через 20 24 сут после последнего введения антигена осуществляют забор крови с последующим получением сыворотки, обладающей высокой диагностической и лечебно-профилактической активностью. 2 табл.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СЫВОРОТКИ ПРОТИВ ВИРУСНОГО ЭНТЕРИТА НОРОК, включающий гиперимунизацию животных антигеном с последующим забором крови и отделением целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве антигена используют очищенный и концентрированный штамм Virus enteritis lutreo larum "Родники" с биологической активностью 10^6ъ,0 и гемагглютинирующей активностью 1 4096 ГАЕ / см³, из животных используют козу, а гепериммунизацию проводят введением по 5 12 см³ антигена последовательно с интервалом между инъекциями 7 10 суток внутривенно, внутримышечно, внутривенно, подкожно с полным адьювантом Фрейнда, а затем через 28 30 суток внутривенно.