АССОЦИИРОВАННАЯ ВАКЦИНА ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ЗАБОЛЕВАНИЙ ПУШНЫХ ЗВЕРЕЙ Российский патент 2002 года по МПК A61K39/295 A61K39/112 A61K39/235 A61K39/175 

Изобретение относится к области ветеринарной биотехнологии, в частности к ассоциированной вакцине для профилактики чумы, аденовирусных инфекций и сальмонеллеза пушных зверей.

В настоящее время является актуальной одновременная иммунизация пушных зверей против чумы, аденовирусных инфекций и сальмонеллеза.

Для профилактики заболеваний пушных зверей применяют ассоциированные вакцины, включающие антиген вируса чумы из штамма Distemper canine "ЭПМ" [1, 2, 3, 4], инактивированный антиген возбудителя вирусного энтерита из штамма Virus enteritis lutreo larum "Родники - 1631" [1, 2], адсорбированный на гидроокиси алюминия антиген ботулинистического анатоксина типа С - анатоксин штамма Clostridium botulinum 59 [1], инактивированные антигены возбудителя псевдомоноза из штаммов Pseu-domonas aeruginosa ДН - 0577, 381-П-06 N40, 1677-08 N63 [2], смесь антигенов сальмонелл трех штаммов Salmonella typhimurium N3, Salmonella cholerae suis N9 и Salmonella dublin N6 [3], инактивированный формалином и адсорбированный на гидроокиси алюминия антиген аденовируса из штамма Adenovirus canis - 2 "Ада" [4], сорбит-желатозный стабилизатор и раствор Хенкса [1, 2, 3, 4].

Использование известных ассоциированных вакцин не позволяет добиться одномоментного желаемого эффекта, так как отсутствие в вакцине в первом случае аденовирусного антигена [3] и сальмонеллезного - в другом [1, 2, 4] требует дополнительных мероприятий по вакцинации животных моновакцинами, а это растягивает сроки иммунизации животных, способствует возникновению стрессов и осложнений.

Совмещение ассоциированных вакцин с моновакцинами в одном шприце для одновременной иммунизации приводит к инактивации живых аттенуированных штаммов чумы и сальмонелл формальдегидом, входящим в состав инактивированных вакцин против аденовирусных инфекций и к инактивации сальмонелл антибиотиками, используемыми при изготовлении противовирусных вакцин. При несбалансированном соотношении введенных антигенов эффективность вакцинации оказывается недостаточной ввиду их конкурентного воздействия на иммунную систему животного.

Целью изобретения является ассоциированная вакцина для профилактики чумы, аденовирусных инфекций и сальмонеллеза у пушных зверей, обладающая высокой иммуногенной активностью, безвредностью, с высоким защитным эффектом.

Цель достигается тем, что в вакцину включены сбалансированные в антигенном и иммуногенном отношении вирусные антигены (аттенуированный штамм Distemper canine "ЭПМ", инактивированный штамм Adenovirus canis - 2 "Ада") и дополнительно бактериальные антигены (смесь антигенов трех штаммов сальмонелл: Salmonella typhimurium N3, Salmonella cholerae suis N9 и Salmonella dublin N6, взятых в равном соотношении, в концентрации 10 млрд м. к./см³), при следующем соотношении компонентов об.%:
Антиген вируса чумы из штамма Distemper саnine "ЭПМ" 12,5-15,0;
Инактивированный формалином и адсорбированный на гидроокиси алюминия антиген аденовируса из штамма Adenovirus canis - 2 "Ада" 0,15-0,30;
Смесь антигенов сальмонелл трех штаммов: Salmonella typhimurium N3, Salmonella cholerae suis N9 и Salmonella dublin N6, взятых в равном соотношении в концентрации 10 млрд. м. к./см³ 12,5-15,0;
Сорбит-желатозный стабилизатор 20,0-25,0;
Раствор Хенкса - остальное.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами:
Пример 1.

Антиген вируса чумы плотоядных получают из штамма Distemper canine "ЭПМ" в первично-трипсинизированной культуре клеток эмбрионов японских перепелов в ростовой среде, состоящей из 0,5%-ного ГЛА на растворе Хенкса, 25-30% среды 199 и 8-10% сыворотки крупного рогатого скота с добавлением антибиотиков (гентамицин 0,1 мг на 1 см³ среды). Вирус вносят в суспензию клеток и выращивают роллерным способом при 37^oС. Через 46 часов ростовую среду сливают, а культивирование продолжают в поддерживающей среде, включающей 60-70% среды 199 и 30-40% 0,5%-ного ГЛА на растворе Эрла с добавлением антибиотиков (гентамицин 0,1 мг на 1 см³ среды). После полного развития ЦПД вируссодержащую культуральную жидкость сливают, замораживают при температуре минус 10-20^oС, оттаивают при комнатной температуре.

Штаммы сальмонелл Salm. typhimurium N3, Salm. cholerae suis N9, Salm. dublin N6 выращивают раздельно в отдельных реакторах на бульоне Хоттингера в течение 10-12 часов при температуре 37+0,5^oС с постоянным перемешиванием и непрерывной аэрацией. Культивирование прекращают в начале стационарной фазы роста, когда концентрация микробов перестает заметно увеличиваться. Выращенные культуры охлаждают до температуры 6-8^oС и подвергают проверке. После чего их концентрируют на суперцентрифуге типа СГО 100/750 или ОТР-101К. Бактериальную массу разводят стерильным физиологическим раствором до концентрации 10 млрд. микробных клеток в 1 см³ по оптическому стандарту ГИСК им. Тарасевича и тщательно перемешивают.

Бактериальные массы Salm. typhimurium N3, Salm. cholerae suis N9, Salm. dublin N6, разведенные до концентрации 10 млрд. микробных клеток в 1 см³ соединяют в равных объемах и тщательно смешивают.

К смешанной бактериальной массе сальмонеллезных антигенов добавляют антиген вируса чумы плотоядных, содержащий не менее 10³- 10⁴ТЦД_50/0,5см ³
После тщательного перемешивания антигенов добавляют сорбит-желатозный стабилизатор в количестве 10-25% и снова перемешивают.

Полученную массу расфасовывают при непрерывном перемешивании в стерильные ампулы или флаконы и лиофилизируют.

Антиген аденовируса получают из штамма Adenovirus canis - 2 "Ада" на первичной культуре клеток почки щенка собаки. В качестве ростовой среды применяют среду, содержащую гидролизат лактоальбумина - 50%, среду Игла с глутамином - 20%, среду 199 - 20%, сыворотку крови крупного рогатого скота - 10% и антибиотики (гентамицин 0,1 мг на 1 см³среды).

Культуру клеток заражают на сформированный монослой. В качестве поддерживающей используют среду, содержащую те же компоненты, что и ростовая, но без добавления сыворотки. После полного развития ЦПД вируссодержащую культуральную посуду замораживают при температуре минус 10-20^oС, оттаивают при комнатной температуре. Культуральную жидкость сливают. Вирусный сбор с титром от 10^4,5 ТЦД_50/0см ³ до 10^5,5 ТЦД_50/0см ³ инактивируют формалином (0,2% к общему объему) и добавляют к 9 частям инактивированного вируса 1 часть 3-6% гидроокиси алюминия. Остаточный формальдегид и антибиотики устраняют путем отстоя гидроокиси алюминия с адсорбированным на нем аденовирусным антигеном и 2-3-кратной замены надосадочной части препарата раствором Хенкса. Полученный антиген расфасовывают в стерильные флаконы.

Ассоциированную вакцину получают путем разведения сухого компонента, содержащего антиген вируса чумы и смесь сальмонеллезных антигенов, равным объемом жидкого компонента, содержащего антиген аденовируса.

Получают три серии ассоциированной вакцины для профилактики чумы, аденовирусных инфекций и сальмонеллеза пушных зверей (таблица 1).

Готовая вакцина представляет собой по внешнему виду жидкость желтовато-розового цвета с рыхлым осадком, легко разбивающимся при встряхивании в гомогенную взвесь.

Пример 2.

Безвредность ассоциированной вакцины проверяют на лабораторных животных (морских свинках 300-400 г и мышах 14 -16 г) и естественно восприимчивых животных (песцах, лисах, тхорзофретках, собаках 2-4 месячного возраста).

Вакцину вводят подопытным животным в соответствующей дозе (см. таблицу 2) и проводят наблюдение в течение 21 дня.

Из таблицы 2 видно, что вакцина является безвредной. За период наблюдения воспалительной реакции на месте введения препарата и случаев заболевания животных не отмечают.

Пример 3.

Оценку иммунологической эффективности вакцины проводят методом экспериментального заражения вакцинированных восприимчивых животных (тхорзофретки, морские свинки, собаки) вирулентными штаммами возбудителей чумы плотоядных, сальмонеллеза и аденовирусного гепатита плотоядных.

Контроль иммуногенности вакцины против чумы плотоядных проводят на тхорзофретках. Подопытных животных прививают ассоциированной вакциной против чумы, сальмонеллеза и инфекционного гепатита плотоядных внутримышечно по 1 см³. Заражение проводят через 21 день после вакцинации вирулентным штаммом вируса чумы Sneider Hyll в дозе 10³ЛД_50/см ³. Результаты опыта представлены в таблице 3. Как видно из таблицы, ассоциированная вакцина вызывает формирование устойчивого иммунитета к вирусу чумы плотоядных.

Иммуногенную активность ассоциированного препарата по отношению к аденовирусам плотоядных проверяют в остром опыте на собаках. Щенков собак вакцинируют внутримышечно или подкожно по 1 см³. Через 21 день после введения ассоциированной вакцины заражают возбудителем инфекционного гепатита плотоядных. Штамм ВГНКИ вводят внутрибрюшинно по 10²ИД_50/см ³ (см. таблицу 4).

Как видно из таблицы 4, ассоциированная вакцина вызывает формирование устойчивого иммунитета к аденовирусу плотоядных.

Контроль иммуногенности вакцины против сальмонеллеза проводят на морских свинках. Ассоциированную вакцину вводят морским свинкам подкожно в область паха в дозе 1 см³. Контрольное заражение подопытных животных проводят через 21 день после иммунизации вирулентными штаммами (см. таблицу 5) соответствующих возбудителей в дозе 1,5 млрд. микробных тел.

Из таблицы 5 видно, что у морских свинок при введении ассоциированной вакцины формируется определенная иммунологическая устойчивость к контрольному заражению вирулентными штаммами культур возбудителя сальмонеллеза. Результаты опытов свидетельствуют, что наиболее эффективной и целесообразной для применения является вакцина серии 2, 3.

Пример 4.

Антигенную активность ассоциированной вакцины определяют в опытах на 2-4 месячных песцах. Животных вакцинируют внутримышечно или подкожно по 1 см³ и через 7, 14 и 21 день проводят взятие крови для определения уровня индуцированных вакциной гуморальных антител.

Антитела к вирусу чумы плотоядных определяют в РНГА с использованием "Набора эритроцитарных диагностикумов для выявления антител к вирусу чумы плотоядных" (ТУ 9384-001-00008064-96), к аденовирусам плотоядных в РТГА со штаммом "Ада" аденовируса собак 2 типа, к сальмонеллам в РА с гомологичными антигенами.

Вакцина обладает антигенной активностью, так как титр антител в сыворотке крови привитых песцов к вирусу чумы плотоядных в РНГА, к аденовирусу плотоядных в РТГА и к сальмонеллам в РА возрастает в 2 - 4 и более раз.

По данным таблицы 6 видно, что возрастание уровня антител ко всем антигенам, входящим в вакцину, наиболее выражено через две недели после вакцинации.

Пример 5
Ассоциированную вакцину для профилактики чумы, аденовирусных инфекций и сальмонеллеза вводят пушным зверям внутримышечно или подкожно в дозе 1 см³. Молодых животных вакцинируют двукратно интервалом 10-14 дней начиная с 50-60 дневного возраста. Взрослых зверей основного стада прививают однократно в декабре - январе, перед гоном.

В течение 1 месяца наблюдения воспалительной реакции в месте введения препарата, снижения аппетита, случаев заболевания и смерти животных не отмечают.

Видовой состав и количество пушных зверей из основного стада, привитых в 2000 г. ассоциированной вакциной против чумы, аденовирусных инфекций и сальмонеллеза пушных зверей в зверосовхозе "Вятка", показаны в таблице 7.

Использование "Ассоциированной вакцины для профилактики чумы, аденовирусных инфекций и сальмонеллеза пушных зверей" в производственных условиях позволит в короткий срок создать у животных иммунитет высокой напряженности к возбудителям чумы, аденовирусных инфекций и сальмонеллеза, до минимума снизить материальный ущерб, наносимый зверохозяйствам указанными инфекциями.

Источники информации
1. RU 1615919 А1, 24.05.1989.

2. SU 1792548 А3, 11.04.1990.

3. RU 2166329 С1, 11.02.1999.

4. RU 2030917 С1, 28.06.1991 - прототип.

Изобретение относится к области ветеринарной биотехнологии, вирусологии и микробиологии. Ассоциированная вакцина содержит сбалансированные в антигенном и иммуногенном отношении вирусные и бактериальные антигены: в качестве антигена вируса чумы плотоядных - культуральную вирусную суспензию живого аттенуированного штамма Distemper canine "ЭПМ", в качестве сальмонеллезных антигенов - живые аттенуированные штаммы: Salm. typhimurium N3, Salm. cholerae suis N9, Salm. dublin N6, в качестве антигена аденовируса плотоядных - инактивированную формалином и осажденную на гидроокиси алюминия культуральную вирусную суспензию штамма Adenovirus canis - 2 "Ада". Ассоциированная вакцина содержит также сорбит-желатозный стабилизатор и раствор Хенкса. Использование ассоциированной вакцины в производственных условиях позволяет в короткий срок создать у животных иммунитет высокой напряженности к возбудителям чумы, аденовирусных инфекций и сальмонеллеза, до минимума снизить материальный ущерб, наносимый зверохозяйствам указанными инфекциями. 7 табл.

Ассоциированная вакцина для профилактики заболеваний пушных зверей, включающая антиген вируса чумы из штамма Distemper canine "ЭПМ", инактивированный формалином и адсорбированный на гидроокиси алюминия антиген аденовируса из штамма Adenovirus canis-2 "Ада", сорбит-желатозный стабилизатор и раствор Хенкса, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит смесь антигенов сальмонелл трех штаммов Salm. Typhimurium N3, Salm. Cholerae suis N9, Salm. Dublin N6, взятых в равном соотношении в концентрации 10 млрд. м. К. /см³, при следующем соотношении компонентов, об. %:
Антиген вируса чумы из штамма Distemper саnine "ЭПМ" - 12,5-15,0
Инактивированный формалином и адсорбированный на гидроокиси алюминия антиген аденовируса из штамма Adenovirus canis-2 "Ада" - 0,15-0,30
Смесь антигенов сальмонелл трех штаммов Salm. Typhimurium N3, Salm. Cholerae suis N9 и Salm. Dublin N6, взятых в равном соотношении в концентрации 10 млрд. м. K. /см³ - 12,5-15,0
Сорбит-желатозный стабилизатор - 20,0-25,0
Раствор Хенкса - Остальное