СЫВОРОТКА ПРОТИВ БОЛЕЗНЕЙ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА, ВЫЗЫВАЕМЫХ ВИРУСАМИ ИНФЕКЦИОННОГО РИНОТРАХЕИТА, ПАРАГРИППА, РОТА, КОРОНА И ДИАРЕИ - БОЛЕЗНИ СЛИЗИСТЫХ, ПОЛИСПЕЦИФИЧЕСКАЯ ГИПЕРИММУННАЯ, СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ БОЛЕЗНЕЙ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА, ВЫЗЫВАЕМЫХ ВИРУСАМИ ИНФЕКЦИОННОГО РИНОТРАХЕИТА, ПАРАГРИППА, РОТА, КОРОНА И ДИАРЕИ - БОЛЕЗНИ СЛИЗИСТЫХ Российский патент 2012 года по МПК A61K39/40 A61K39/42 

Предлагаемое изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, в частности к изготовлению специфической гипериммунной сыворотки против болезней крупного рогатого скота, вызываемых вирусами инфекционного ринотрахеита, парагриппа, рота, корона и диареи - болезни слизистых, и предназначено для специфической иммунизации и пассивной профилактики смешанных форм инфекционных энтеритов и энтероколитов новорожденных телят.

В структуре заболеваемости новорожденных телят желудочно-кишечные болезни вирусной этиологии, клинически проявляющиеся диареей, занимают особое место и являются одной из основных причин гибели молодняка.

Эта группа болезней наносит хозяйствам огромный экономический ущерб, складывающийся из высокой смертности заболевших, больших затрат на лечение больных, снижения привесов и проведения общих и специфических мероприятий.

Без эффективной защиты новорожденных животных от возбудителей инфекционных болезней не представляется возможным получение здорового молодняка и биологически полноценной животноводческой продукции.

Имеющиеся в специальной литературе данные последних лет и накопленные знания и опыт свидетельствуют о том, что массовые энтериты и энтероколиты новорожденных телят с клиническими признаками диареи обуславливаются различными этиологическими факторами: если в основе возникновения незаразных болезней лежат функциональные расстройства желудочно-кишечного тракта новорожденных, тесно связные с нарушениями обмена веществ у коров-матерей вследствие неполноценного кормления и нарушения правил содержания, то при инфекционной диарее огромная роль принадлежит рота-, корона-, герпесвирусам (вирусу инфекционного ринотрахеита и т.д.), в меньшей степени - паравирусу и вирусу диареи - болезни слизистых крупного рогатого скота и т.д.

Инфекционный процесс усугубляется тем, что эти возбудители действуют на беззащитный организм новорожденного в комбинации друг с другом (вирус + вирус, вирус + бактерии и т.д.), вызывая смешанную инфекцию, приводящую к более тяжелому заболеванию часто с летальным исходом.

Диарея новорожденных телят смешанной этиологии характеризуется стационарностью, тяжелой и затяжной формой течения. Новорожденные телята заражаются в инфицированных родильных отделениях в первые минуты жизни с первым вдохом контаминированного воздуха и первым глотком инфицированного молока, и затем в течение 2-5 дней наступает их гибель на фоне прогрессивно развивающихся необратимых патологических изменений.

Возникновение и развитие инфекционного процесса обусловлены высокой концентрацией поголовья скота, латентным персистированием возбудителей в организме коров и нетелей, но вызывающих острое заболевание у новорожденных телят.

Наиболее распространенным и эффективным способом защиты новорожденных телят от возбудителей, участвующих в патогенезе смешанной инфекции, является повышение специфической резистентности их организма путем спаивания молозива от вакцинированных коров-матерей.

Разработки последних лет во многих странах мира, в том числе и в Российской Федерации, позволили создать моно-, бивалентные и ассоциированные вакцины, обуславливающие эффект невосприимчивости у телят к энтеритам. Антитела, полученные с молозивом коров, обеспечивают защиту телят от заболеваний до тех пор, пока у них не разовьются собственные механизмы иммунитета. По различным причинам некоторые телята после рождения не получают в необходимом количестве эту естественную защиту, что связано с недостаточным поступлением иммуноглобулинов с молозивом матери и недостаточным получением молозива в первые часы после рождения или нарушением механизма абсорбции иммуноглобулинов молозива кишечником новорожденных животных.

Следовательно, только антитела, введенные телятам перорально, предохраняют их от заболевания, обеспечивают полную защиту от развития клинически выраженного заболевания и прекращения экскреции вирусов и бактерий.

С учетом этого положения, с целью специфической пассивной профилактики и лечения в различных странах практикуется перорально введение гипериммунных сывороток или иммуноглобулинов, полученных от гипериммунизированных животных-продуцентов, гамма-глобулина, выделенного из молозива первого сдаивания или из сыворотки крови крупного рогатого скота.

Известен «Способ получения адгезивной и антитоксической сыворотки против эшерихиоза сельскохозяйственных животных», обеспечивающий нейтрализацию патогенного действия эшерихий у животных различных видов (1).

Однако эти биопрепараты не позволяют получить лечебно-профилактический эффект при смешанных формах инфекционных диарей новорожденных телят.

Как правило, в 75-85% случаев имеют место сочетанные инфекции, а моносыворотка не обладает специфической активностью в отношении рота-, корона-, герпесвирусов - основных возбудителей этой патологии.

Известна также полиспецифическая гипериммунная сыворотка против рота-, корона-, герпесвирусов и Е. coli (K-99, А 20) для локальной защиты и иммунотерапии смешанных форм диареи новорожденных телят.

Сыворотка содержит антитела в титрах: к ротавирусу - не менее 1:3200 (в ИФА), к коронавирусу - не менее 1:512 (в РНГА), к герпесвирусу - 1:512 (в РН), к эшерихиям, имеющим адгезины К 99 и А 20 - не менее 1:1600 (в РА), к термостабильному энтеротоксину Е. coli - не менее 1:4 (в РДП).

Полученная гипериммуннизацией волов-продуцентов поливалентным вирусным антигеном, содержащим смесь культуральных вирусных суспензий, и инактивированными антигенами Е. coli, содержащими соматические, адгезивные (K-99, А 20) антигены в физиологическом растворе, анатоксины в среде культивирования (бульон Хоттингера) при следующем соотношении их компонентов в двух различных иммуногенах (об.%):

1. Культуральные вирусные суспензии для внутривенной иммунизации:

Ротавирус крупного рогатого скота с титром 10^7,0-10^7,8 30-35 ТЦЦ 50/мл   Коронавирус крупного рогатого скота с титром 10^5,0-10^5,8 30-35 ТЦЦ 50/мл   Герпесвирус крупного рогатого скота с титром 10^7,6-10⁸ 30-35 ТЦЦ 50/мл  

2. Эшерихиозные антигены для подкожной иммунизации:

Соматические и адгезивные антигены К-99 с 23-27 концентрацией 10-15 млрд. м.к. в 1 см³   Соматические и адгезивные антигены А 20 с 23-27 концентрацией 10-15 млрд. м.к. в 1 см³   Анатоксин К-99 - А 20 Е. coli 45-52 Формалин 0,4-0,5

Для изготовления вирусных антигенов с целью гипериммунизации волов-продуцентов проводят раздельное размножение и выращивание вирусов, а полученные рота-, корона- и герпесвирусные суспензии, содержащие не менее 30-35 мг/мл специфического белка, объединяют в равных соотношениях и используют для гипериммунизации волов-продуцентов.

Способ получения эшерихиозных антигенов заключается в следующем: получают анатоксин и соматические адгезивные антигены, которые затем смешивают в равных объемных соотношениях и используют для гипериммунизации животных.

Для гипериммунизации используют полиантигены, состоящие из рота-, корона-, герпесвирусов и эшерихий коли, содержащих адгезивные антигены К 99 и К 20.

Смесь антигенов рота-, корона-, герпесвирусов вводят внутривенно четырехкратно в нарастающих дозах. Для десенсибилизации организма иммунизируемых животных за 1-1,5 ч до внутривенного введения, им подкожно инъецируют смесь вирусных антигенов в десятикратно меньшей дозе.

Эшерихиозный антиген вводят подкожно в область шеи в первый раз с неполным адъювантом Фрейнда, в последующем - без адъюванта. Пробное взятие крови проводят из яремной вены на 20-й день после последнего введения антигенов. Полученную сыворотку от каждого продуцента с помощью серологических реакций исследуют на наличие антител. Продуцентам, в сыворотке которых титры антител низкие, антиген вводят повторно в дозах согласно последнему введению, а взятие крови не производят.

Производственное крововзятие разрешается при наличии антител в сыворотке крови продуцентов к ротовирусу не ниже 1:3200 в ИФА; коронавирусу - не ниже 1:512 а РТГА; герпесвирусу - не ниже 1:256 в РН; эшерихиям - не ниже 1:1600 в РА и при условии, что температура у животных не должна превышать 39,5°С, а также после предварительной выдержки их на голодной диете в течение 12 ч при неограниченном водопое. На 20-й день после взятия крови продуцентам вводят полиантиген в дозах согласно последнему введению.

Оценку эффективности полиспецифической гипериммунной сыворотки проводят в остром опыте на новорожденных телятах.

С лечебной целью сыворотку применяют больным телятам внутривенно при выраженной интоксикации в дозе 60-80 см³, при слабой - в дозе 40-60 см³. При необходимости сыворотку вводят повторно через 24 часа подкожно в дозе 50 см³.

С профилактической целью сыворотку вводят перорально в дозе 60-80 мл на прием до первой порции молозива (первые 1-1,5 ч жизни теленка) и повторное введение не позднее 24-30 ч после первого в той же дозе (2). (Прототип.)

Известна ассоциированная вакцина против ротавируса, коронавируса телят и вирусной диареи - болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота, в которой были использованы следующие штаммы вирусов: штамм РМ (ротавирус) штамм 2-КЛ-2 (коронавирус), и штамм ВК-В1 №36 (вирус диареи - болезни слизистых). Все штаммы вирусов были изолированы от неблагополучных хозяйств. Российской Федерации и адаптированы к репродукции в различных клеточных культурах (3).

В задачу исследований входило - разработать технологию производства полиспецифической гипериммунной сыворотки против болезней крупного рогатого скота, вызываемых вирусами инфекционного ринотрахеита, парагриппа, рота-, корона- и диареи - болезни слизистых, обеспечивающей пассивный иммунитет в предельно короткие сроки, и экстренное лечение при развивающейся болезни, а также сокращение числа прививок при гипериммунизации и лечении.

Это удалось достичь благодаря тому, что гипериммунизацию волов-продуцентов проводят культуральной суспензией следующего состава при введении быкам:

Ротавирус крупного рогатого скота с титром   7,0-8,0 lg ТЦД 50/мл 30-40 Коронавирус крупного рогатого скота с титром   6,0-7,0 lg ТЦД 50/мл 30-40 Вирус инфекционного ринотрахеита   крупного рогатого скота с титром   6,5-7,0 lg ТЦД 50/мл 20-30 Вирус ПГ-3 крупного рогатого скота с титром   7,5-8,0 lg ТЦД 50/мл 20-30 Вирус диареи - болезни слизистых с титром   4,5-6,5 lg ТЦД 50/мл 30-40

Сыворотка содержит готовые антитела против вирусов инфекционного ринотрахеита, парагриппа, рота, корона и диареи - болезни слизистых и обладает профилактическим эффектом и лечебным действием, создает пассивный иммунитет, который сохраняется до трех месяцев.

Сыворотку получают из крови волов (телят на откорме или оленей), которых гипериммунизируют коммерческими вакцинами против инфекционного ринотрахеита, парагриппа, рота, корона и вируса диареи - болезни слизистых.

Биопредприятия, изготавливающие сыворотку, используют слудующие коммерческие вакцины:

1. Вакцина против парагриппа-3, инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи - болезни слизистых КРС эмульсионная инактивированная производства ФГУ ВНИИЗЖ.

2. Вакцина против рота-, коронавирусной инфекций и вирусной диареи - болезни слизистых КРС эмульсионная инактивированная производства ВНИИЗЖ.

3. Вакцина ассоциированная инактивированная против ротавирусного, коронавирусного энтеритов телят и вирусной диареи крупного рогатого скота «РОДИКОР-ВАК ВИЭВ» производства ВИЭВ.

В качестве продуцентов используют здоровых, имеющих удовлетворительную упитанность волов (телят на откорме или северных оленей) 2-5-летнего возраста, массой не ниже 300-400 кг.

Все вновь поступающие животные подлежат карантинированию и обследованию на инфекционные заболевания, согласно действующей инструкции о порядке подготовки и санитарной обработки животных, используемых для изготовления биопрепаратов.

Кормление волов-продуцентов должно быть сбалансировано по основным показателям.

После окончания карантинного периода (30 дней), если животное отвечает требованиям, приступают к гипериммунизации согласно разработанной схеме.

Схема гипериммунизации Дни иммунизации Компоненты для иммунизации Доза антигенов Способ введения 1 2 3 4 1-й день 1. Вакцина против рота-, коронавирусной инфекций и вирусной диареи - болезни слизистых КРС эмульсионная инактивированная производства ВНИИЗЖ по 10 мл с двух сторон (всего 20 мл) Подкожно в паховую складку 2. Вакцина против парагриппа-3, инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи - болезни слизистых КРС эмульсионная инактивированная производства ВНИИЗЖ по 10 мл с двух сторон (всего 20 мл) Подкожно в области предлопаточных лимфоузлов 3. (вместо 1) Вакцина ассоциированная инактивированная против ротавирусного, коронавирусного энтеритов телят и вирусной диареи крупного рогатого скота «РОДИКОР-ВАК ВИЭВ» производства ВИЭВ. (вместо 1.) по 10 мл с двух сторон (всего 20 мл) Подкожно в паховую складку 14-й день 1. Вакцина против рота-, коронавирусной инфекций и вирусной диареи - болезни слизистых КРС эмульсионная инактивированная производства ВНИИЗЖ как в 1-й день как в 1-й день 2. Вакцина против парагриппа-3, инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи - болезни слизистых КРС эмульсионная инактивированная производства ВНИИЗЖ 3. Вакцина ассоциированная инактивированная против ротавирусного, коронавирусного энтеритов телят и вирусной диареи крупного рогатого скота «РОДИКОР-ВАК ВИЭВ» производства ВИЭВ. 28-й день 1. Вакцина против рота-, коронавирусной инфекций и вирусной диареи - болезни слизистых КРС эмульсионная инактивированная производства ВНИИЗЖ как в 1-й день Подкожно 2. Вакцина против парагриппа-3, инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи - болезни слизистых КРС эмульсионная инактивированная производства ВНИИЗЖ 42-й день 1. Вакцина против рота-, коронавирусной инфекций и вирусной диареи - болезни слизистых КРС эмульсионная инактивированная производства ВНИИЗЖ как в 1-й день Подкожно 2. Вакцина против парагриппа-3, инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи - болезни слизистых КРС эмульсионная инактивированная производства ВНИИЗЖ 3. Вакцина ассоциированная инактивированная против ротавирусного, коронавирусного энтеритов телят и вирусной диареи крупного рогатого скота «РОДИКОР-ВАК ВИЭВ» производства ВИЭВ

В процессе эксплуатации особое внимание уделяют состоянию здоровья продуцентов. Ежедневно проводят клинический осмотр с измерением температуры тела животных.

Пробное крововзятие проводят из яремной вены в стерильные пробирки. Полученную сыворотку от каждого продуцента с помощью серологических реакций исследуют на наличие антител к вирусу ИРТ - в РН, ротавирусу и вирусу диареи - болезни слизистых в ИФА, к коронавирусу и вирусу ПГ-3 в РТГА.

Производственное крововзятие разрешается при наличии антител в сыворотке крови продуцентов к ротавирусу и вирусу диареи - болезни слизистых в ИФА не ниже 1:1600, вирусу ИРТ в РН не ниже 1:16, а к коронавирусу и вирусу ПГ-3 в РТГА - не ниже 1:512.

Температура тела животных при производственном крововзятии не должна превышать 39,5°С. Животных надо выдержать предварительно на голодной диете в течение 12 часов при неограниченном водопое.

Продуцентам, в сыворотке крови которых титры антител ниже указанных, взятие крови не производят.

Первое крововзятие от продуцентов по объему не должно превышать 0,6 л крови на 100 кг массы животного, а в последующие 1,6 л на 100 кг массы.

Ежегодно делают месячный перерыв в эксплуатации животных. На 30-й день отдыха продуцентам вводят полиантиген в дозах согласно последующему введению.

Продуцентов эксплуатируют в течение 3-5 лет, после чего их реализуют в установленном порядке.

Обработка крови и получение сыворотки.

Для предохранения крови от свертывания применяют антикоагулянт - 10%-ный раствор лимоннокислого натрия (С₆Н₅Na₃O₇·5H₂O, м.в. 348,17), который готовят на 5-7%-ном растворе хлористого натрия и стерилизуют атоклавированием.

Для отделения форменных элементов крови полученную центрифугированную кровь подвергают сепарированию (сепаратор марки АС-2Ж). На начальном этапе сепарирования (в течение 10-15 минут) форменные элементы крови не полностью отделяются от плазмы, и ее первая порция вытекает из сепаратора с эритроцитами. Такую плазму собирают отдельно и сепарируют повторно.

Полученную плазму дефибринируют в стерильном реакторе, добавляя в нее 30%-ный раствор хлористого кальция из расчета 1,3 см³ на 1 л плазмы.

Сыворотку консервируют 5%-ным раствором х.ч. фенола до конечной концентрации 0,5% и при помощи вакуумного насоса перекачивают в стерильные емкости, где выдерживают 2 месяца при 4-10°С.

После отстоя сыворотку фильтруют и стерилизуют через пластины с расчетом нагрузки 5 л на 1 пластину.

Каждая серия сыворотки должна на предприятии-изготовителе пройти контроль согласно действующему ТУ (или СТО).

Определяют внешний вид по цвету, наличие примесей, плесени и т.д.

Определение стерильности проводят по ГОСТ 28065.

Для проверки на безвредность смесь проб сывороток из 5 флаконов вводят подкожно в объеме 5,0 см³ 5 морским свинкам. В течение 10 суток наблюдения животные должны оставаться здоровыми.

Активность полиспецифической сыворотки с антигенами ротавируса и вируса диареи - болезни слизистых определяют в ИФА, вируса ИНР - в РН, а против коронавируса и вируса ПГ-3 - в реакции торможения гемагглютинации (РТГА).

На каждый флакон с сывороткой наклеивают этикетки с указанием: предприятия-изготовителя, его товарного знака, наименование сыворотки, количества ее во флаконе, номера серии и контроля, даты изготовления, срока годности, условий хранения и обозначения ТУ (СТО).

Порядок применения

Предложенную сыворотку применяют для лечения и специфической профилактики острых желудочно-кишечных и респираторных заболеваний телят (с момента рождения и до 9-месячного возраста), вызываемых вирусами парагриппа, инфекционного ринотрахеита, диареи - болезни слизистых, ротавируса и коронавируса крупного рогатого скота.

Для профилактики желудочно-кишечных и респираторных заболеваний теленку применяют сыворотку не позднее 2-3 часов после рождения и повторно через 24 часа. Сыворотку вводят подкожно в несколько точек из расчета 1,0 см³ на 1 кг массы животного.

В случае появления симптомов заболевания органов пищеварения или дыхания теленку вводят сыворотку в лечебной дозе (1,5 см³ на 1 кг массы) в сочетании с антибиотиками подкожно в несколько точек один раз в сутки 2-3 дня подряд.

Противопоказаний к применению сыворотки нет.

Сыворотка апробирована с положительным результатом в 20 областях Российской Федерации с 2002 по 2010 гг.

Сыворотка найдет широкое применение во всех областях Российской Федерации в животноводческих хозяйствах для профилактики и лечения желудочно-кишечных и респираторных заболеваний, вызываемых рота-, коронавирусами, вирусом диареи - болезни слизистых, вирусами ПГ-3 и ИРТ. Препарат позволит резко снизить вышеперечисленные заболевания и тем самым сохранить здоровье молодняка и получить благополучное маточное поголовье.

Источники информации

1. Патент RU №2043772, А61К, 39/42; А61К 39/40, 1995 г.

2. Патент RU №2145504, А61К 39/42, А61К 39/40, 1999 г.

3. Диссертация на соискание ученой степени кандидата вет. наук Беловой Н.Б. Антигенные и протективные свойства ассоциированной вакцины против ротавирусного, коронавирусного энтеритов телят и вирусной диареи - болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота. М., 2005, стр.40-45.

Группа изобретений относится к области ветеринарной вирусологии. Сыворотка содержит антитела в титрах: к ротавирусу, вирусу диареи - болезни слизистых - не ниже 1:1600 (в ИФА), вирусу инфекционного ринотрахеита - не ниже 1:16 (в РН), коронавирусу и вирусу парагриппа-3 не ниже 1:512 (в РТГА). Сыворотка получена гипериммунизацией волов-продуцентов поливалентным вирусным антигеном, содержащим смесь культуральных вирусных суспензий ротавируса крупного рогатого скота с титром 7,0-8,0 lg ТЦД 50/мл, коронавируса крупного рогатого скота с титром 6,0-7,0 lg ТЦД 50/мл, вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота с титром 7,5-8,0 lg ТЦД 50/мл, вируса парагриппа-3 с титром 7,5-8 lg ТЦД 50/мл, вируса диареи - болезни слизистых с титром 4,5-9,5 lg ТЦД 50/мл. С профилактической целью теленку вводят сыворотку не позднее 2-3 часов после рождения и повторно через 24 часа, подкожно в несколько точек из расчета 1,0 см³ на 1 кг массы животного. В случае появления симптомов заболевания теленку вводят сыворотку в лечебных дозах 1,5 см³ на 1 кг массы, в сочетании с антибиотиками подкожно в несколько точек 1 раз в сутки 2-3 дня подряд. Группа изобретений обеспечивает надежный пассивный иммунитет в предельно короткие сроки и сокращает число прививок. 2 н.п. ф-лы.

1. Сыворотка против болезней крупного рогатого скота, вызываемых вирусами инфекционного ринотрахеита (ИРТ), парагриппа (ПГ-3), рота, корона и диареи - болезни слизистых, полиспецифическая гипериммунная, отличающаяся тем, что она содержит антитела в титрах: к ротавирусу, вирусу диареи - болезни слизистых - не ниже 1:1600 (в ИФА), вирусу ИРТ - не ниже 1:16 (в РН), коронавирусу и вирусу ПГ-З не ниже 1:512 (в РТГА), полученная гипериммунизацией волов-продуцентов поливалентным вирусным антигеном, содержащим смесь культуральных вирусных суспензий ротавируса крупного рогатого скота с титром 7,0-8,0 lg ТЦД 50/мл, коронавируса крупного рогатого скота с титром 6,0-7,0 lg ТЦД 50/мл, вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота с титром 7,5-8,0 lg ТЦД 50/мл, вируса ПГ-З с титром 7,5-8 lg ТЦД 50/мл, вируса диареи - болезни слизистых - с титром 4,5-9,5 lg ТЦД 50/мл.

2. Способ профилактики и лечения болезней крупного рогатого скота, вызванных вирусом инфекционного ринотрахеита, парагриппа, рота, корона и диареи - болезни слизистых, отличающийся тем, что для профилактики желудочно-кишечных и респираторных заболеваний теленку вводят сыворотку, охарактеризованную по п.1, не позднее 2-3 ч после рождения и повторно через 24 ч, подкожно в несколько точек из расчета 1,0 см³ на 1 кг массы животного, а в случае появления симптомов заболевания теленку вводят сыворотку в лечебных дозах 1,5 см³ на 1 кг массы в сочетании с антибиотиками подкожно в несколько точек 1 раз в сутки 2-3 дня подряд.