БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЙ ПРЕПАРАТ ДЛЯ КУР И СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ВИРУСНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ КУР Российский патент 1995 года по МПК A61K38/21 A61K35/14 

Изобретение относится к ветеринарии, в частности к биологически активным препаратам, обладающим противовирусной активностью, способам их получения и применения, предназначенным для профилактики и лечения инфекционных и незаразных болезней, повышения продуктивности кур.

Известны биопрепараты, способы их получения и применения, обладающие противовирусной активностью и обеспечивающие повышение сохранности и продуктивности птиц. Это вакцины, гипериммунные сыворотки, препараты иммуноглобулинов, интерферонов.

В качестве аналогов наиболее предпочтительными по сути изобретения являются препараты интерферона, способы его получения и применения [1,2]
Недостатком известных способов получения и применения препаратов интерферонов является низкая активность (титр 1:256-1:512), что требует существенного повышения производства при широком применении в птицеводстве. Технология получения препаратов интерферонов (лейкоцитарных) не позволяет получить препараты с активностью более 1:10³.

Целью изобретения является обеспечение повышения противовирусной активности препарата и увеличение эффективности его производства и применения.

Поставленная цель достигается определением эффективной композиции препарата, высокоэкономичной и производительной технологией изготовления и оптимальной схемой применения.

Сущность изобретения заключается в следующем. Биологически активный препарат для кур состоит из продуктов культивирования индуцированных лимфоидных клеток кур при следующем соотношении компонентов (в сухом препарате), мас. белки 10,0-60,0; аминокислоты 1,9-5,0; жирные кислоты 0,10-15,5; сахара 2,5-30,0; аскорбиновая кислота 0,9-10,0; вода 1-5; соли до 100. Противовирусная активность препарата (титр) составляет 1:500-1:10⁸.

Препарат получают при культивировании в течение 12-70 ч лимфоидных клеток кур в присутствии вирусного (вирус болезни Ньюкастла, вирус Сендай) и невирусных (лектины, энтеротоксины и др.) индукторов с последующим концентрированием белков и внесением жирных кислот и сахаров и объединением фракций неконцентрированных в концентрированных продуктов в соотношении 1:1-10000:1 с добавлением наполнителей. Получаемый таким образом препарат с охарактеризованными свойствами (по противовирусной активности) эффективен по применению в лечебных и профилактических дозах (соответственно 10⁵ и 4х10² ед.) при парентеральном, интраназальном или пероральном введении цыплятам или курам.

П р и м е р 1 (оптимальный вариант). Биологически активный препарат получают следующим образом.

1 стадия. Культивируют лимфоидные клетки (селезенки, крови, лимфоузлов) кур (5-6 млн.клеток/см³) при добавлении последовательно лейкоцитарного интерферона кур (50-300 ед/см³), инсулина (0,0020 ед/см³, невирусных индукторов (например, конканавалин А (Кон А 0,5-1 мг/л); фитогемагглютинин (ФГА 20-30 мг/л; энтеротоксины (липополисахариды) 0,05-0,1 мг/л; левамизол, другие производные тиазола 0,1 мг/см³ или другие) и/или вирусных индукторов (например, вирус Сендай 10-30 ТЦД_50/см3 на клетку, вирус болезни Ньюкастла 30-100 ТЦД_50/см3 на клетку). Продукты культивирования индуцированных клеток (режим биосинтеза 12-70 ч при 36,5-37,5^оС, концентрация клеток 1-10 млн. клеток/см³ в перемешивающейся суспензии, питательные среды типа 199, РПМИ-1640) центрифугируют. В случае применения вирусных индукторов центрифугат подкисляют до рН 2,5 и выдерживают не менее 72 ч, затем рН выравнивают до 6,0-6,5 добавлением раствора КОН или NaOH. Далее фильтруют стерилизующие фильтры и часть фильтрата (1-10%) лиофилизуют.

2 стадия. Лиофилизованный полупродукт растворяют в буферном (боратном) растворе (10 мг/см³) и вносят в соотношении 1:10 в раствор поверхностно-активных веществ, например 0,2-0,4 М раствор аэрозоля ОТ (натриевая соль ди-2-этилгексилового эфира сульфоянтарной кислоты), а затем добавляют раствор жирной кислоты, например пальмитиновая, стеариновая, 10-1000 мкг и насыщенный раствор сахаров, например, глюкоза, сорбит и др. в количестве 2-15 мг. Далее к системе добавляют избыточное количество (1-5-кратное) ацетона и выпавший осадок промывают 3-5 раз ацетоном. Последний удаляют испарением.

3 стадия. Объединяют часть препарата, полученного на 1 стадии и растворенную в физиологическом растворе (буфер) часть препарата, полученную на 2 стадии в соотношении 2:1-1:1 (соотношение белковой фракции в частях 1:1-10000:1), добавляют желатину или белки плазмы крови до конечной концентрации 0,1-1% аскорбиновую кислоту (до конечной концентрации 0,03-0,3%) и используют либо в жидком виде, либо в лиофилизованном виде.

Состав композиции следующий, мас. Белки 10,0-60,0 Аминокислоты 1,9-5,0 Жирные кислоты 0,10-15,5 Сахар 2,5-30,0
Аскорбиновая кислота 0,9-10 Вода 1-5 Соли До 100
Противовирусная активность (титр)- 1:500-1:1000000000 (500-1 млрд. ед.).

П р и м е р 2 (отрицательный вариант, пример 2 по таблице).

Препарат получают таким образом, как описано в примере 1, но используют только процедуры, изложенные в 1 стадии.

Противовирусная активность препарата в этом случае не превышает (титр) 1:500-1:1000 (500-1000 ед.). В составе препарата нет жирных кислот, сахаров, аскорбиновой кислоты.

П р и м е р 3 (недостаточно эффективный вариант, пример 3 по таблице).

Препарат получают так как описано в примере 1, но используют только процедуры, изложенные в стадиях 1 и 2 (без третьей стадии).

Противовирусная активность препарата составляет 10⁶-10⁷ ед./мг. В составе препарата отсутствует 50-70% белка,100% аскорбиновой кислоты. Получаемый препарат в 10-100 раз менее активен, чем при изготовлении по технологии, изложенной в примере 1. Еще один недостаток препарат можно расфасовывать только в сухом виде, что технологически крайне сложно.

П р и м е р 4 (см.таблицу).

П р и м е р 5. Препарат получают, как описано в примере 1, но содержание белка менее 10,0% В этом случае не достигается необходимой активности препарата (10⁴-10⁸ ед.) из-за потери противовирусной активности в процессе изготовления препарата потеря активности в 100-1000 раз. При повышении концентрации белка свыше 60,0 в препарате технологический процесс получения препарата является экономически нецелесообразным в этом случае время лиофилизации превышает 72 ч, что приводит к большим энергетическим затратам.

П р и м е р 6. Препарат получают, как описано в примере 1, но содержание жирных кислот менее 0,10% В этом случае не достигается получения активности препарата выше 1000 ед. что не обеспечивает необходимой активности препарата (10⁴-10⁸ ед. ). При повышении концентрации жирных кислот выше 15,5% в препарате наблюдается снижение активности препарата в 100 раз и более.

П р и м е р 7. Препарат получают, как описано в примере 1, но содержание сахаров (например глюкоза, манноза, сорбит и др.) менее 2,5% При этом получаемый на 2 стадии полупродукт является малорастворимым, что не обеспечивает получение препарата с активностью выше 1000 ед. При повышении концентрации сахара свыше 30% наблюдается снижение активности препарата в 10 раз и более (очевидно, за счет блокирования мембрано-активных противовирусных компонентов препарата).

П р и м е р 8. Препарат получают, как описано в примере 1, но содержание аскорбиновой кислоты менее 0,9% В этом случае при хранении продукта свыше 1 месяца наблюдается постепенное снижение активности препарата в 10 раз и более. При повышении концентрации аскорбиновой кислоты свыше 10% наблюдается снижение активности препарата в 15-20 раз и более.

П р и м е р 9. Препарат под названием галливирэкс с активностью (противовирусной, титр) 1000-100000 ед. применяют с целью повышения уровня неспецифического иммунитета, стимуляции роста и развития, профилактики и лечения инфекционных и незаразных болезней кур (болезни органов дыхания, желудочно-кишечного тракта, например грипп, инфекционный бронхит, ларинготрахеит, ринит, псевдочума, чума и др.) путем интраназального, перорального или парентерального введения в дозе 0,2-1,0 мл в течение 2-3 дней иди двукратно через 48 ч или через 48 ч после вакцинаций кур в дозе 1 мл.

При снижении активности препарата менее 1000 ед. применение его по указанной схеме является менее эффективным. В этом случае сохранность цыплят повышается более, чем на 4% а прирост массы тела на 3% (экономическая нецелесообразность).

При повышении активности препарата (галливирэкса) свыше 10⁵ ед. применение его с профилактической целью является экономически нецелесообразным (из-за повышенного расхода препарата).

П р и м е р 10. Препарат под названием галливирэкс-вак с активностью (противовирусной, титр) 10⁵-10⁸ ед. применяют для лечения болезней кур (перечислены в описании примера 9) в комплексе с антибиотиками, витаминами и другими препаратами путем интраназального, перорального или парентерального введения в дозе 0,2-1,0 мл два раза в сутки в течение 3-4 дней.

При снижении активности препарата менее 10⁵ ед. применение его по указанной схеме является менее эффективным. В этом случае не обеспечивается повышение сохранности цыплят свыше 15% при, например, гриппе, инфекционном ларинготрахеите (экономическая нецелесообразность). А применение по этой же схеме галливирэкс-вака с активностью свыше 10⁸ ед. для лечебных целей является экономически нецелесообразным (из-за повышенного расхода препарата).

Предлагаемый препарат, нормативно-техническая документация по его изготовлению, контролю и применению утверждена Главным управлением ветеринарии Министеpства сельского хозяйства и продовольствия СССР (ТУ 10.07.190-91 галливирэкс; ТУ 10.07.191-91 галливирэкс-вак, наставление по применению галливирэкса и галливирэкс-вака). Препараты испытаны с положительной оценкой в птицеводческих хозяйствах России и Украины.

Использование: в ветеринарии, в частности в биологически активных препаратах для профилактики и лечения вирусных заболеваний у кур. Сущность изобретения: препарат содержит,мас.%: белки 10-60; аминокислоты 1,9-5; жирные кислоты 0,1-15,5; сахара 2,5-30; аскорбиновая кислота 0,9-10, вода 1-5; соли минеральных кислот - остальное. Препарат получают культивированием вирус- и/или невирус-индуцированных лимфоидных клеток кур с последующей фильтрацией. Далее одну часть фильтрата лиофилизируют, растворяют в буферном растворе и вносят (1: 10) в раствор аэрозоля ОТ добавляют жирные кислоты (10-1000 мкг), сахара (5-20 мг) и смешивают с 1-5-кратным раствором ацетона. Полученный осадок растворяют в физиологическом растворе, смешивают второй частью фильтрата и леофилизируют. Препарат с активностью 10 тыс. ед. для профилактики болезней вводят 2-3-кратно инт раназально, перорально или парентерально в дозе 0,2-1 мл, а для лечения с активностью 1 млн. ед. вводят 3-4-кратно в дозе 0,2-1 мл. 3 с. и 2 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЙ ПРЕПАРАТ ДЛЯ КУР И СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ВИРУСНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ КУР, включающий видоспецифический белок, отличающийся тем, что в качестве видоспецифического белка он содержит продукты культивирования индуцированных лимфоидных клеток кур белки, аминокислоты, соли минеральных кислот и дополнительно жирные кислоты, сахара, аскорбиновую кислоту, воду при следующем соотношении компонентов, мас.

Белки 10,0-60,0
Аминокислоты 1,9-5,0
Жирные кислоты 0,10-15,5
Сахара 2,5-30,0
Аскорбиновая кислота 0,9-10,0
Вода 1,0-5,0
Соли минеральных кислот Остальное
2. Способ получения биологически активного препарата для кур из сырья животного происхождения, включающий инкубирование его в питательной среде с индуктором с последующим выделением, отличающийся тем, что в качестве сырья животного происхождения используют лимфоидные клетки кур, которые культивируют в присутствии индукторов как вирусных, так и невирусных в течение 12-70 ч, полученную суспензию центрифугируют, фильтруют через стерилизующие фильтры, фильтрат разделяют на две части:одну часть лиофилизуют, растворяют в буферном растворе из расчета 10 мг/см³ и вносят в соотношении 1:10 в 0,2-0,4 М раствор аэрозоля натриевой соли ди-2-этилгексилового эфира сульфоянтарной кислоты, добавляют 10-1000 мкг жирной кислоты, 5-20 мг сахара и осаждают 2-5-кратным количеством ацетона, полученный осадок, растворенный в физиологическом растворе, смешивают с другой частью фильтрата в соотношении 1:1-2, добавляют белки плазмы крови и/или желатину до конечной концентрации 0,1-1,0% аскорбиновую кислоту до конечной концентрации 0,03-0,3% и лиофилизуют.