СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ БАЦИЛЛ Российский патент 1996 года по МПК C12N1/20 C12N1/20 C12R1/07 

Изобретение относится к медицинской биотехнологии, в частности к получению биомассы микроорганизмов рода Bacillus.

Известны способы глубинного культивирования бацилл в жидких питательных средах, содержащих гидролизат казеина и дрожжевой экстракт, а также дрожжи, углеводы и соли.

Недостатками этих методов являются длительность культивирования и низкий выход биомассы бацилл.

Цель изобретения повышение выхода биомассы бацилл и сохранение нативной морфологии микробных клеток.

Цель достигается тем, что выращивание микроорганизмов рода Bacillus осуществляют при pH 7,3-7,4 в жидкой питательной среде следующего состава, Солянокислый гидроли- зат казеина 0,5-1,4 Экстракт кормовых дрож- жей 0,15-0,30 MgSO₄ ·7H₂O 0,005-0,020 NaCl^- 0,4-0,6 (NH₄)₆Mo₇O₂₄ · 4H₂O 0,05-0,20 Перфтордекалин 5-15 об. Дистиллированная вода до 100 мл.

Коррекцию рН при культивировании проводят 10%-ным раствором глюкозы в питательной среде.

На фиг. 1 показаны клетки Bac. anthracis СТИ, выращенные по способу-прототипу; на фиг. 2 клетки Bac. anthracis СТИ, выращенные по предлагаемому способу; на фиг. 3 то же, после 24 ч выращивания по оптимальной технологии.

Выход биомассы бацилл в предлагаемом способе составляет 50-60 млрд м. к. с 1 мл среды, что на два порядка выше, чем по способу-прототипу. Кроме того, морфология клеток, полученных разработанным способом, находится в пределах нормы (фиг. 2).

Таким образом, предлагаемый способ позволяет получить большее по сравнению с прототипом количество морфологически полноценных клеток бацилл, что обеспечивает изобретательский уровень предлагаемого решения.

П р и м е р 1 (оптимальный). Выращивание микроорганизмов рода Bacillus (например, Bac. anthracis, Bac. cereus, Bac. thuringiensis) осуществляют на среде с оптимальной концентрацией ингредиентов следующего состава, Солянокислый гидроли- зат казеина 0,7 Экстракт кормовых дрож- жей 0,2 MgSO₄ · 7H₂O 0,01 NaCl 0,5 (NH₄)₆Mo₇O₂₄ · 4H₂O 0,1 Дистиллированная вода до 100 мл
pH среды устанавливают в пределах 7,3-7,4. Среду стерилизуют при 0,5 атм в течение 20 мин. Перед культивированием в стерильных условиях в среду добавляют перфтордекалин из расчета 10 от объема. В ферментационный сосуд заливают приготовленную среду в количестве 400 мл. 18-24-часовую культуру микроорганизмов рода Bacillus, выращенную при 37^оС в пробирке со скошенным агаром, смывают 0,15 М раствором хлорида натрия. Полученную суспензию засевают в ферментер из расчета 10⁶ м. к. на 1 мл среды.

Глубинное культивирование осуществляют при 37^о при аэрации с расходом воздуха 2500 см³ в 1 мин на 1 л среды. pH поддерживают на уровне 7,3 путем добавления 10-ного раствора глюкозы в питательной среде. Контроль за ростом культуры проводят путем отбора проб и определения концентрации биомассы по оптическому стандарту мутности, а также макрокультуральным методом на плотных питательных средах.

Через 12 ч культивирования биомассу бацилл обеззараживают добавлением формалина до 1% концентрации и используют для получения диагностических препаратов. Предлагаемый способ позволяет получить 50-60 млрд м. к. с 1 мл питательной среды.

П р и м е р 2 (минимальный). Культивирование микроорганизмов рода Bacillus осуществляют по технологии, описанной в примере 1, на питательной среде при следующем соотношении ингредиентов
Солянокислый гидролизат казеина 0,5 Экстракт кормовых дрож- жей 0,15 MgSO₄ · 7H₂O 0,005 NaCl 0,4 (NH₄)₆Mo₇O₂₄ · 4H₂O 0,05 Перфтордекалин 15 об.

Дистиллированная вода до 100 мл
Выход биомассы в среде с минимальной границей концентрации ингредиентов снижается на 50% и составляет 30 млрд м. е. с 1 мл среды.

П р и м е р 3 (максимальный). Выращивание бацилл осуществляют по технологии, изложенной в примере 1, используя максимальную границу концентрации ингредиентов,
Солянокислый гидроли- зат казеина 1,4 Экстракт кормовых дрож- жей 0,3 MgSO₄ · 7H₂O 0,02 NaCl 0,1 (NH₄)₆Mo₇O₂₄ · 4H₂O 0,2 Перфтордекалин 15 об.

Рост и размножение бацилл в указанных условиях проходят так же быстро, как и в способе с оптимальной концентрацией ингредиентов, однако применение среды с максимальной границей состава нерентабельно и ведет к удорожанию технологии.

П р и м е р 4.

Культивирование бацилл по оптимальной технологии (пример 1) в питательной среде, не содержащей молибденовокислый аммоний, приводит к снижению выхода биомассы на 50%
П р и м е р 5. При выращивании микроорганизмов рода Bacillus в отсутствие в питательной среде перфтордекалина рост клеток замедляется, а урожайность снижается на 58
П р и м е р 6. При культивировании бацилл по примеру 1 в течение 24 ч выход биомассы не снижается, однако морфология клеток изменена (фиг. 3).

П р и м е р 7. Выращивание бацилл осуществляют по оптимальной технологии, изложенной в примере 1, не проводя коррекцию pH в процессе культивирования 10-ным раствором глюкозы в питательной среде. При этом выход биомассы составляет 14 млрд м. к. с 1 мл среды, т. е. снижается на 77%
П р и м е р 8. Поверхностное культивирование микроорганизмов рода Bacillus на питательной среде с оптимальным соотношением ингредиентов без аэрации и коррекции pH ведет к снижению урожайности на два порядка, выход биомассы в этом случае составляет 500 млн м. е. с 1 мл среды.

Сводные данные по выходу биомассы бацилл в описанных выше примерах представлены в таблице.

Таким образом, использование предлагаемого способа культивирования бацилл обеспечивает значительное повышение урожайности микроорганизмов рода Bacillus, а также сохранение нативной морфологии полученных клеток.При этом достигается хорошая воспроизводимость при выращивании различных видов рода Bacillus. Экономический эффект применения предлагаемого способа превышает аналогичную величину способа-прототипа в 20 раз (с учетом стоимости сред).

Использование: в биотехнологии, при получении биомассы микрооганизмов рода Bacillus. Сущность изобретения: выращивание микроорганизмов рода Bacillus осуществляют при рН 7,3 - 7,4 в жидкой питательной среде следующего состава, мас. %: солянокислый гидролизат казеина 0,5 - 1,4; экстракт кормовых дрожжей 0,15 - 0,3; MgSO₄ • H₂O 0,005 - 0,020; NaCl 0,4 - 0,6; (NH₄)₆ Mo₇O_2 4 • 4H₂O 0,05 - 0,20; перфтордекалин 5 - 15 об.%; дистиллированная вода - до 100 мл. Коррекцию рН при культивировании проводят 10%-ным раствором глюкозы в питательной среде. Способ обеспечивает значительное повышение урожайности бацилл, а также сохранение нативной морфологии полученных клеток. При этом достигается хорошая воспроизводимость при выращивании различных видов рода. 3 ил., 1 табл.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ БАЦИЛЛ путем глубинного культивирования микроорганизмов рода Bacillus в жидкой питательной среде в условиях аэрации до максимального накопления биомассы, отличающийся тем, что культивирование осуществляют при величине рН 7,3 - 7,4, поддерживаемой путем добавления 10%-ного раствора глюкозы, в питательной среде, содержащей, мас.%:
Солянокислый гидролизат казеина - 0,5 - 1,4
Экстракт кормовых дрожжей - 0,15 - 0,30
MgSO₄ • 7H₂O - 0,005 - 0,020
NaCl - 0,4 - 0,6
(NH₄)₆Mo₇O_2 4 • 4H₂O - 0,05 - 0,2
Перфтордекалин, об.% - 5 - 15
Дистиллированная вода, мл - До 100