СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ БИФИДОБАКТЕРИЙ Российский патент 1996 года по МПК C12N1/20 

Изобретение относится к микробиологической, медицинской, ветеринарной промышленности и может быть использовано при производстве лечебных бакпрепаратов, а также ветеринарных пробиотиков.

Основным назначением культур бифидобактерий является их использование в составе лечебных и лечебно-профилактических препаратов против дисбактериозов человека и животных.

Известен способ глубинного культивирования бифидобактерий [1] оптимизирующий процесс выращивания Bif. bifidum в реакторе, определяющий оптимальный возраст посевной культуры и устанавливающий оптимальную продолжительность процесса выращивания, которая соответствует выходу популяции в стационарную фазу роста по оптической концентрации клеток.

Однако приведенные условия выращивания не обеспечивали стабильной воспроизводимости физиологического состояния получаемых культур из-за отсутствия "гибкого" критерия завершения процесса, что в итоге приводило к значительному разбросу величины жизнеспособных клеток в сухих препаратах (10⁸-10⁹ кл/мл).

Подобными недостатками характеризуется также способ культивирования бифидобактерий, в котором процесс вели без контроля величины окислительно-восстановительного потенциала (ОВП) и с фиксированной продолжительностью [2] Максимальный выход жизнеспособных клеток в этом случае составлял 1,4·10⁹ кл/мл.

Наиболее близким к предлагаемому является способ культивирования бифидобактерий в ферментере на средах на основе ферментативных гидролизатов обрата молока при пониженном окислительно-восстановительном потенциале среды и в течение заданной длительности времени [3]
Недостатком этого способа является отсутствие контроля за величиной снижения уровня ОВП, большой интервал изменения уровня pH, фиксированная продолжительность процесса и, вследствие этого, большая дисперсия физиологического состояния популяции клеток. Все это приводит к существенному непостоянству результатов выращивания как по выходу живых клеток, так и по их сохраняемости в препаратах. Другим недостатком является большая продолжительность процесса культивирования, низкие выходы биомассы и низкая устойчивость клеток к высушиванию.

Задача изобретения разработка способа культивирования бифидобактерий, позволяющего сократить продолжительность процесса выращивания культуры, увеличить выход биомассы и повысить устойчивость клеток к высушиванию.

Задача решается тем, что после внесения посевного материала величину ОВП ростовой среды снижают до минус (100-150) мВ внесением 5%-ного раствора аскорбиновой кислоты и процесс культивирования завершают через 1-3 ч после прекращения кислотообразования, регистрируемого по изменению величины pH в культуральной жидкости.

П р и м е р 1. Культивирование Bifidobakterium bifidum шт. 1 ГИСК. Для проведения глубинного выращивания готовят лабораторный ферментер, оборудованный автоматическими системами термостатирования, перемешивания и поддержания уровня pH.

Готовят среду следующего состава, г/л: Панкреатический гидро- лизат казеина (N аминный) 1,5 Экстракт пекарских дрож- жей 5,0 Глюкоза 20,0 MgSO · 7H₂O 0,2 MnSO ·4H₂O 0,05 Цистин солянокислый 0,2 Вода до 1 лит-
ра pH среды 7,0
В стерильный аппарат вносят асептически простерилизованную среду. Далее вносят посевной материал, выращенный в колбах на среде аналогичного состава в количестве 10% от рабочего объема аппарата и добавляют 5%-ный раствор аскорбиновой кислоты до достижения величины ОВП не выше минус 100 мВ. Культивируют при 37^оС и постоянном перемешивании (250 об/мин) без продувки воздуха в течение 16 ч. Величину pH поддерживают добавлением 25%-ного раствора аммиака при снижении уровня pH ниже 6,8 в автоматическом режиме. Для повышения устойчивости клеток к высушиванию процесс выращивания завершают через 1 ч после прекращения кислотообразования, которое контролируется по прекращению снижения величины pH культурой. Выращенную культуру подвергали контактно-сорбционному высушиванию. Для сравнения использовали регламентный способ культивирования [3] но на указанной выше среде. Сравнительные результаты представлены в таблице.

П р и м е р 2. Культивирование Bifidobakterium globosum шт. БФ-4. Процесс выращивания ведут на оборудовании и на ростовой среде по прописи, указанной в примере 1, вносят 10% посевного материала и доводят ОВП культуральной жидкости до величины не выше минус 150 мВ 5%-ным раствором аскорбиновой кислоты. Культивируют при 37^оС и постоянном перемешивании (250 об/мин) без продувки воздухом в течение 10 ч. Величину pH поддерживают добавлением 25% -ного раствора аммиака при снижении уровня pH ниже 6,8 в автоматическом режиме. Для повышения устойчивости клеток к высушиванию процесс выращивания завершают через 2 ч после прекращения кислотообразования, которое контролируется по снижению величины pH культурой. Выращенную культуру подвергали контактно-сорбционной сушке. Для сравнения использовали регламентный способ культивирования [3] но на питательной среде указанной в примере 1. Сравнительные результаты представлены в таблице.

Анализ представленных результатов показывает, что предлагаемый способ глубинного культивирования бифидобактерий позволяет сократить в 2-3 раза продолжительность процесса, увеличить в 3-5 раз выход жизнеспособных клеток, а также в 1,5-2 раза их устойчивость к высушиванию.

Использование: в способах культивирования бифидобактерий. Сущность изобретения: способ глубинного культивирования бифидобактерий на питательных средах на основе гидролизата казеина с корректировкой окислительно-восстановительного потенциала среды и контролем завершения процесса по заданному алгоритму. Указанный способ позволяет сократить продолжительность процесса, увеличить выход жизнеспособных клеток и их устойчивость к высушиванию. Область применения: производство бакпрепаратов медицинского и ветеринарного назначения. 1 табл.

СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ БИФИДОБАКТЕРИЙ путем посева инокулята в питательную среду на основе гидролизата казеина при термостатировании, поддерживании уровня рН и непрерывном перемешивании, отличающийся тем, что после внесения в ферментер инокулята величину окислительно-восстановительного потенциала снижают до минус 100 - 150 мВ добавлением аскорбиновой кислоты и процесс культивирования завершают через 1 - 3 ч после прекращения кислотообразования, регистрируемого по изменению величины рН в культуральной жидкости.