СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТЕТРОДОТОКСИНА Российский патент 2016 года по МПК C12P17/18 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам получения тетродотоксина. Этот препарат может использоваться в медицине в комплексной терапии лечения онкологических заболеваний в качестве обезболивающего средства.

Известен способ получения тетродотоксина, в котором в качестве ТТХ-содержащих носителей используют ткани яичников, печени, кишечника и кожи рыбы фугу Fugu obscurus. Для этого из органов животного-носителя выделяют бактерии, и определяют наличие токсичных штаммов, определяют их принадлежность до рода. Используют ТТХ-продуцирующий штамм Bacillus W-3, изолированный из яичников рыбы фугу Fugu obscurus. После культивирования токсин экстрагируют из жидкой среды и определяют его присутствие с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), газовой хроматомасс-спектрометрии, количественная оценка проводится с помощью биологического метода на мышах (Wang J., Fan Y. Isolation and characterization of a Bacillus species capable of producing tetrodotoxin from the puffer fish Fugu obscures. World J Microbiol Biotechnol. 2010. 26. P. 1755-1760).

К недостаткам известного способа следует отнести:

- использование жидких питательных сред для выращивания бактерий приводит к синтезу ТТХ в окружающую среду, а дальнейшее выделение токсина из большого объема питательной среды влечет дополнительные затраты на выделение ТТХ;

- выделение ТТХ методами ВЭЖХ: дорогостоящий и нерентабельный метод в масштабах производства. Сам процесс выделения токсина является длительным с невысоким выходом конечного продукта, прибор и расходные материалы (колонки, наполнители для колонок, стандарты ТТХ) являются дорогостоящими;

- в основе предложенного метода в качестве источника ТТХ используют бактерий в вегетативной стадии развития, что приводит к уменьшению выхода целевого продукта;

- способ усложняется тем, что используются бактерии в вегетативной стадии, а значит, требуется наработка значительного количества реактивов, питательных сред;

- авторы указывают на чрезвычайно низкую токсичность в изолированном штамме Bacillus W-3, однако авторы не приводят количественные данные: концентрацию бактерий, взятых для выделения ТТХ, и концентрацию токсина в бактериальной культуре;

- поиск ТТХ-содержащих бактерий среди всех выделенных штаммов с помощью биологических методов оценки на мышах является негуманным, требует наработки большого количества экстракта бактерий и, соответственно, значительного количества трудозатрат.

Известен способ получения тетродотоксина, в котором в качестве тетродотоксин-несущего животного используют ткани печени, кишечника и кожи рыбы фугу Arothron hispidus. Для этого ткани гомогенизируют, суспендируют и высеивают на твердую питательную среду, выращивают до получения чистой культуры, каждую отдельную колонию субкультивируют до получения дискретных колоний и проводят идентификацию по микробной идентификационной системе. Переносят каждую отдельную колонию в жидкую питательную среду, с последующим культивированием. Из жидкой питательной среды с бактериями проводят экстракцию тетродотоксина, полученные токсичные фракции подвергали дальнейшему биоанализу токсичности. (Bragadeeswaran S., Therasa D., Prabhu K., Kathiresan K. Biomedical and pharmacological potential of tetrodotoxin - producing bacteria isolated from marine pufferfish arothron hispidus (Muller, 1841), The jornal of Venomous animals and toxins including tropical diseases, 2010, v. 16, №3, p. 421-431)

Недостатками известного способа являются:

- в основе предложенного метода в качестве источника ТТХ используют бактерии в вегетативной стадии развития, что приводит к уменьшению продукции токсина;

- способ усложняется тем, что используются бактерии в вегетативной стадии, а значит, требуется наработка значительного количества реактивов, питательных сред;

- использование жидких питательных сред для выращивания бактерий приводит к синтезу ТТХ в окружающую среду, а дальнейшее выделение токсина из большого объема питательной среды влечет дополнительные затраты на выделение ТТХ;

- поиск ТТХ-содержащих бактерий среди всех выделенных штаммов с помощью биологических методов оценки на мышах является негуманным, требует наработки большого количества экстракта бактерий и, соответственно, значительного количества трудозатрат.

Все вышеперечисленные аналоги обладают еще одним общим недостатком, они рассматривают проблему получения ТТХ с научной точки зрения и очень далеки от решения задачи - наработки целевого продукта ТТХ.

Наиболее близким к заявленному техническому решению по достигаемому результату является способ получения тетродотоксина, в котором в качестве тетродотоксин-несущего животного используют рыбу фугу (печень). Для этого ткани гомогенизируют, тщательно перемешивают в морской воде и высеивают на твердую питательную среду, выращивают до получения чистой культуры, которую определяют на основании морфологии колоний, переносят каждую отдельную колонию Bacillus в жидкую питательную среду, с последующим культивированием. Получают экстракты из бактерий и методом биоанализа на мышах выявляют экстракты, обладающие токсичным эффектом, обнаружение ТТХ проводят химическими способами: жидкостной хроматографией/флуоресцентной детекцией (ЖХ/FLD), жидкостной хроматографией/масс-спектрометрией (ЖХ/МС), жидкостной хроматографией/тандемной масс-спектрометрии (ЖХ/МС/МС). (Lu Y., Yi R., Bacillus horikoshii, a tetrodotoxinprodusing bacterium isolated from the liver of puffer fish, Annals of microbiology, 2009, 59 (3), p. 453-458)

В качестве недостатков данного способа следует отметить следующее:

- в основе предложенного метода в качестве источника ТТХ используют бактерии в вегетативной стадии развития, что приводит к уменьшению выхода целевой продукции - токсина;

- способ усложняется тем, что используются бактерии в вегетативной стадии, а значит, требуется наработка значительного количества реактивов, питательных сред;

- использование жидких питательных сред для культивирования бактерий рода Bacillus приводит к синтезу ТТХ в окружающую среду, а дальнейшее выделение токсина из большого объема питательной среды влечет дополнительные затраты на выделение ТТХ;

- выделение ТТХ методами хроматографии и масс-спектрометрии: дорогостоящие и нерентабельные методы в масштабах производства. Сам процесс выделения токсина является длительным, с невысоким выходом конечного продукта, прибор и расходные материалы (колонки, наполнители для колонок, стандарты ТТХ) являются дорогостоящими;

- поиск ТТХ-содержащих бактерий среди всех выделенных штаммов с помощью биологических методов оценки на мышах является негуманным, требует наработки большого количества экстракта бактерий и, соответственно, ведет к усложнению процесса выделения ТТХ и повышению количества трудозатрат.

Задачей заявляемого технического решения является повышение степени накопления ТТХ и упрощение способа выделения ТТХ за счет использования в качестве сырья для производства тетродотоксина свободных спор или эндоспор бактерий рода Bacillus.

Поставленная задача решается тем, что в способе получения тетродотоксина, включающем подготовку образцов тетродотоксин-несущих животных, гомогенизацию тканей образцов тетродотоксин-несущих животных, тщательное перемешивание с растворителем, помещение на питательную среду и выращивание до получения одинаковых по морфологии колоний бактерий, перенос каждой отдельной колонии бактерий рода Bacillus на питательную среду, с последующим их культивированием; экстрагирование тетродотоксина, согласно изобретению, после получения одинаковых по морфологии колоний бактерий проводят отбор грамположительных штаммов рода Bacillus, способных накапливать ТТХ, переносят их на твердую или жидкую питательную среду, а последующее культивирование отобранных штаммов рода Bacillus на питательной среде ведут до стадии спороношения в условиях индуцирующих спорообразование, затем из полученных эндоспор и/или свободных спор экстрагируют тетродотоксин.

В качестве тетродотоксин-несущих животных (организмов-хозяев) могут быть использованы тетродотоксин-несущие животные, включая плоских червей, немертин, брюхоногих, осьминогов, морских звезд, морских ежей, крабов, бычков, лягушек, тритонов и рыбу фугу либо морской грунт. В качестве источника тетродотоксина рекомендуется использовать любые тетродотоксин-продуцирующие бактериальные штаммы Bacillus sp.

Однако экспериментально установлено, что из бактерий рода Bacillus, максимально продуцирующих ТТХ, являются штаммы: Bacillus sp. KF444411, Bacillus sp. KF444412, Bacillus sp. KF444413, Bacillus sp. KF444414, Bacillus sp. KF444415, Bacillus sp. KF444416.

Заявителем впервые установлено, что накопление тетродотоксина происходит в эндоспорах и в свободных спорах бактерий рода Bacillus (Magarlamov T.Y., Beleneva I.A., Chernyshev A.V., Kuhlevsky A.D. Tetrodotoxin-producing Bacillus sp. from the ribbon worm (Nemertea) Cephalothrix simula (Iwata, 1952). Toxicon. 2014; v. 85, pp. 46-51).

Отбор грамположительных штаммов рода Bacillus, способных накапливать ТТХ, после получения одинаковых по морфологии колоний бактерий, и использование для последующего культивирования именно этих штаммов позволяет значительно повысить выход целевого продукта.

Под действием неблагоприятных условий грамположительные прокариоты из сем. Bacillaceae и Actinomycetaceae могут давать особую генерацию защищенных от неблагоприятных условий клеток, именуемых спорами. У бактерий рода Bacillus споры формируются внутри материнской клетки, и такие споры называют эндоспорами. Через небольшой инкубационный период эндоспоры выходят наружу, становясь свободной спорой. Остальные представители спорогенных семейств формируют споры путем отпочковывания от материнской клетки дочерней клетки, именуемой экзоспорой.

Ведение процесса культивирования до стадии спороношения обеспечивает получение культуры продуцента-тетродотоксина с высоким содержанием эндоспор и свободных спор. Эндоспоры накапливают большие количества токсина, что позволяет концентрировать ТТХ в спороносящих клетках и в свободных спорах. В связи с накоплением тетродотоксина в эндоспорах и в свободных спорах в заявленном способе отпадает необходимость дополнительной отчистки токсина от питательной среды, что не только значительно упрощает процесс получения тетродотоксина, но и удешевляет его производство.

Преимуществом использования бактерий рода Bacillus также является то, что бактерии рода Bacillus не теряют способность продуцировать ТТХ в течение длительного времени (не менее 3 лет), это позволяет использовать эти микроорганизмы в качестве «культурных» штаммов (то есть штаммов, которые в лабораторных условиях способны длительно культивироваться).

Для выращивания бацилл используются как жидкие, так и твердые питательные среды. В качестве жидких питательных сред можно использовать грм-бульон, мясо-пептонный бульон, бульон Хоттингера, Nutrient Broth М002, жидкая среда L-B (Luria-Bertani). В качестве твердых питательных сред используют грм-агар, мясо-пептонный агар, агар хоттингера, Nutrient Agar М001, среду Эбоши, твердую среду L-B (Luria-Bertani), среду Хорикоши I, среду Хорикоши II.

Использование твердых питательных сред является целесообразным, поскольку это упрощает способ получения эндоспор и свободных спор бактерий и, соответственно, увеличивает конечный выход тетродотоксина. Сбор спор с поверхности твердой питательной среды упрощает биотехнологический процесс, так как не требуется дополнительных очисток от самой культуральной среды. Для выделения чистых ТТХ-продуцирующих штаммов бацилл используют только твердые питательные среды.

Использование жидких сред является более трудоемким процессом по сравнению с использованием твердых питательных сред, для этого требуется дополнительный процесс стимулирования спор и последующая очистка микроорганизмов от питательной среды. Однако выход тетродотоксина в жидкой среде выше за счет увеличения объемов используемой среды: от 1 до 10 литров. В то время как культивирование бактерий на твердой питательной среде возможно на чашках Петри с полезной площадью 78, 54 см², максимальная концентрация бактерий на чашке Петри может быть 10×10¹¹, что соответствует количеству бактерий в 100 мл жидкой среды, хотя нужно отметить, что и в твердых средах бациллы легко извлечь по сравнению с прототипом, поскольку нет выхода ТТХ в среду.

Использование условий, индуцирующих процесс спорообразования, приводит к активации процесса формирования спор у бактерий и в дальнейшем увеличивает концентрацию эндоспор и свободных спор в бактериальной культуре. Повышение количества эндоспор и свободных спор увеличивает концентрацию тетродотоксина на каждый грамм бактериальной культуры. Бактериальные культуры рода Bacillus при многократных пересевах не теряют способность продуцировать споры и накапливать тетродотоксин внутри эндоспор. Для выращивания бацилл каких-либо факторов роста хозяина не требуется. Отказ от необходимости в процессе культивирования бактерий использования гомогенатов, полученных от хозяина, приводит к упрощению и удешевлению способа.

Для создания условий, индуцирующих спорообразование на жидкой питательной среде, используют среду-стимулятор спорообразования. В качестве среды, стимулирующей спорообразование, могут использоваться любые бактериальные среды, подходящие для выращивания бактерий из рода Bacillus, с минимальным содержанием моно- и дисахаридов, в частности, глюкоза, галактоза, фруктоза, моноза, лактоза, сахароза, мальтоза, лактоза.

Также в качестве условий, индуцирующих спорообразование на твердых или жидких питательных средах, используют термический шок. Термический шок заключается в непродолжительном культивировании бактерий при повышенной температуре. Диапазон температур и времени, используемый для активации образования спор, составляет 50-95°С и 15-120 минут соответственно.

Выдержка меньше 50°С и менее 15 минут недостаточна, а выше 95°С и более 120 минут может вызвать необратимые изменения в жизненном цикле бактерий (к гибели бактерий или их неспособности формировать споры).

Оптимальными условиями индукции спорообразования у бактерий рода Bacillus являются: инкубирование микроорганизмов 30 минут при температуре 80°С.

Для создания условий, индуцирующих спорообразование на твердой питательной среде, также используют прием длительного культивирования. С течением времени количество питательных веществ в бактериальной среде сокращается, это является сигналом к формированию бактериями спор в качестве защитной реакции для переживания неблагоприятных условий. Процесс формирования спор при использовании длительного культивирования представлен на фиг. 3. Через 12 часов после начала культивирования бактерии не формируют эндоспоры или свободные споры (Фиг. 3А); через 24 часа после начала культивирования культура формирует 29% эндоспор (Фиг. 3В); через трое суток после начала культивирования культура содержит 35% эндоспор и 30% свободных спор (Фиг. 3С); на шестые сутки после начала культивирования более 72% культуры представлено свободными спорами и 3% эндоспоры (Фиг. 3D). При внесении в среду культивирования большого количества бактерий объем питательных веществ резко сокращается уже через двое суток, что приводит к резкому и порой синхронному формированию эндоспор.

Еще одним способом создания условий, индуцирующих спорообразование, является дополнительное внесение в питательную среду соединений, содержащих или «спорулирующую» соль, или нуклеозиды, или лизаты бактерий, или переносят бактерии в дистиллированную воду.

Под термином «спорулирующая» соль понимают соли, стимулирующие формирование спор у бацилл и содержащие в своем составе ионы марганца (Mn²⁺), магния (Mg²⁺), кальция (Са²⁺) или железа (Fe²⁺), или комплекса этих ионов, состоящего из двух и более солей. Так для активации образования спор в любую культуральную среду добавляют 1-2 мл «спорулирующей» соли. К «спорулирующей» соли можно отнести, например, CaCl₂, или MnSO₄, или FeSO₄, или смесь MgCl₂ и MnCl₂, или смесь CaCl₂ и FeSO₄, или смесь MnCl₂, CaCl₂, MgCl₂. В качестве примеров питательных сред, содержащих «спорулирующие» соли, могут быть среды следующего состава:

- питательная споруляционная среда (NSM; 0.8% питательный бульон, 0.05 mM MnCl₂, 0.7 mM CaCl₂, 1.0 mM MgCl₂);

- MgCl₂,6H₂O (0.5 mM); MnCl₂,4H₂O (0.01 mM); FeCl₃,6H₂O (0.05 mM); ZnCl₂ (0.05 mM); CaCl₂,6H₂O (0.2 mM); KH₂PO₄ (13 mM); K₂HPO₄ (26 mM); глутамин (20mg/л); кислый гидролизат козеина (1 г/л); ферментативный гидролизат казеина (1 г/л); ферментативный дрожжевой экстракт (0.4 г/л) и глицерол (0.6 г/л);

- difco питательный бульон, 8.0; KCl, 1.0; MgSO₄, 7H₂O, 0.25; MnCl₂, 4H₂O, 0.002. После доведения до pH 7.0 и автоклавирования, добавляют стерильный раствор CaCl₂(5×10^-4 М) и FeSO₄(1×10^-6 М);

- питательная споруляционная среда (NSM), содержащая 0.5% пептона, 0.3% говяжьей пасты, 0.7 mmol of CaCl₂, 0.05 mmol MnCl₂, 1.0 mmol of MgCl₂, pH 7.0;

- 0.05% MgSO₄×7H₂O, 0.2% KCl, 1.6% Difco питательный бульон, 0.1% глюкозы, 0.0001 mM FeSO₄, 0.1 mM MnCl₂×H₂O, 1 mM Ca(NO₃)₂.

В качестве лизатов используют тот же вид бактерий, культивированных в течение 2-8 дней. В качестве нуклеозида можно использовать инозин. Так показано, что 0.005-0.025 mM инозина увеличивает спорообразование в 4-5 раз (Sekar V., Wilson S.P. and Hageman J.H. Induction of Bacillus subtilis sporulation by nucleosides: inosine appears to be sporogen // J. Bacteriol. 1981. V. 145(1). p. 489-493). Если перенести вегетативные клетки бацилл, находящиеся на стадии активного роста, в дистиллированную воду, то бактерии начинают формировать споры.

Заявленный способ демонстрируется следующими фигурами:

На фиг. 1А и 1Б представлена флуоресцентная микроскопия общей культуры бактерий рода Bacillus, окрашенных антителами против тетродотоксина, где на фиг. 1А - фото с увеличением в 1000 раз, а на фиг. 1 В - фото с увеличением в 2500 раз.

На фиг. 2А и 2Б представлена микрофотография электронной иммуноцитохимии бактерий Bacillus sp. 1839 (KF444411-KF444413), окрашенных антителами против тетродотоксина, где на фиг. 2А - материнская клетка с эндоспорой внутри, а на фиг. 2В - свободная спора. Стрелки указывают тетродотоксиновую метку.

На фиг. 3 представлено фото культивирования бактерий Bacillus sp.1839/1 (KF444413-KF444416) в динамике на твердой питательной среде Морской агар, где А - 12 часов после начала культивирования; В - 24 часа после начала культивирования; С - 3-е суток после начала культивирования; D - 6 суток после начала культивирования. Черные стрелки указывают на эндоспоры, белые стрелки - свободные споры.

Для осуществления заявленного способа получения необходимо произвести подготовку образцов, включающих следующие стадии:

1. Сбор биоматериала: сбор организмов, содержащих тетродотоксин, в частности, на территории залива Петра Великого были отобраны немертины: Cephalothrix simula, Lineus alborostratus, Hubrechtella juliae, Ouasitetrastemma stimpsoni. Сбор ведут известными методами.

2. Затем собранные морские организмы подготавливают для вовлечения в процесс получения ТТХ (тетродотоксина). Предварительная подготовка образцов включает: взвешивание, тщательную промывку животных стерильной морской водой для удаления микроорганизмов с их поверхности.

Пример 1.

Берут подготовленный образец немертин Cephalothrix simula, предварительно обработанных, тщательно растирают до гомогенного состояния в стерильном ручном гомогенизаторе.

Затем отбирают 0.1 мл гомогента, переносят в стерильную пробирку и доводят до 1 мл стерильным физиологическим раствором NaCl (ФР), тщательно перемешивают и наносят на питательную среду. В качестве питательной среды берут твердую питательную среду - TCBS агар (состав: протеозопептон - 10,00; дрожжевой экстракт - 5,00; натрия тиосульфат - 10,00; натрия цитрат - 10,00; oxgall (препарат из бычьей желчи) - 8,00; сахароза - 20,00; натрия хлорид - 10,00; железа цитрат - 1,00, бромтимоловый синий - 0,04; тимоловый голубой - 0,04; агар-агар - 15,00; конечное значение pH (при 25°c) 8,6±0,2). Посевы культивируют при температуре +23°C двое суток. Используя световой микроскоп, определяют разные типы колоний и с каждого типа колонии делают скол (берут образец). Полученный образец растворяют в 100 мкл ФР и наносят на новую среду. Процесс повторяют еще 2 раза, до получения на чашках чистых, одинаковых по морфологии колоний, определяют принадлежность колонии к роду. Чистоту колоний определяют, используя тесты на реакцию по Грамму, подвижность, цитохромоксидазу, утилизацию источников углерода, образование кислых продуктов из углеводов, устойчивость к антибиотикам, потребность в ионах Na⁺, рост при различных температурах, значениях pH и солености среды (Beleneva I.A., Kukhlevsky A.D., Kharchenko U.V. Antimicrobial activity of heterotrophic bacterial strains of marine origin // Jundishapur Journal of Microbiology. 2013. V. 6, no. 2. P. 166-175J). Проведенные цитологические и биохимические анализы каждого изолята позволяют идентифицировать бактерии до рода. Для дальнейшей работы берут только грамположительные изоляты из рода Bacillus.

Наличие ТТХ в спорах определяют иммунофлюорисцентными методами. Бактериальные клетки смывают с поверхности агара стерильной морской водой в микропробирки и мягко осаждают на центрифуге (minispin, Eppendorf) при 3000 об/мин в течение 10 мин. К осадку добавляют 4% параформальдегид на фосфатном буфере (ФБ) (NaCl (137 мМ), KCl (2.7 мМ), Na₂HPO₄ (6.4 мМ), KH₂PO₄ (1.2 мМ), pH 7.4) и инкубируют в течение 1 часа. Бактерии отмывают 3 раза ФБ, обезвоживают в возрастающей концентрации спиртов (10%, 30%, 50%, 80%) и помещают на 2-е суток в водорастворимую смолу (LR White) (EMS) при +4°C. Затем образцы перемещают в свежую смолу и ставят в термостат на 1 сутки при +62°C для полимеризации. Полутонкие срезы толщиной 0.9 µm получают на ультра-кате (Ultracat Е) (Reichert, Germany) и переносят на предметные стекла. Полутонкие среды пермобилизируют в течение 1 часа 1% тритоном Х-100 (Aldreach) на ФБ, затем отмывают ФБ и в течение часа инкубируют в блокирующем растворе, содержащем 1% БСА и 10% нормальную сыворотку козы (Invitrogen) на ФБ. Для выявления тетродотоксина срезы инкубируют в течение 2-х суток при +4°C в растворе первичных антител против тетродотоксина (поликлональные антитела кролика, разведение 1:25) (Abnova) на ФБ, содержащем 1% БСА, затем отмывают ФБ и инкубируют в растворе вторичных антивидовых антител, меченых Alexa 488, (Invitrogen, USA) в концентрации 1:800 на ФБ в течение 2 часов при комнатной температуре. Срезы отмывают ФБ и заключают в Moviol (Aldrich). Препараты анализируются на флюоресцентном микроскопе. Наличие положительного флуоресцентного свечения в эндоспорах указывает на способность бактерий накапливать ТТХ (см. Фиг. 1А и 1В).

Смесь бацилл сеют на TCBS агар. Наращивание спор производят по известной методике (Holt S.C., Gauthier J.J., Tipper DJ. Ultrastructural studies of sporulation in bacillus sphaericus. J Bacteriol. 1975; 122(3):1322-38). Для этого суточные колонии бактерий, выращенные на твердой питательной среде при +23°C, подвергают кратковременному термальному шоку. Термальный шок вызывают помещением бактериальных штаммов в термостат +80°C и выдерживают в течение 30 минут. Через 6,5 часа более 70% бактерий формируют споры. Споры бацилл смывают фосфатным буфером, мягко осаждают на центрифуге (minispin, Eppendorf) при 3000 об/мин в течение 10 минут.

Полученный бактериальный осадок гомогенизируют ультразвуковым дезагрегатором (Фирма) с частотой 20 кГц и амплитуде 30 мкм в течение 30 минут. К полученному гомогенату добавляют ацетатный буфер (1% уксусная кислота в 80% метанола) в соотношении 1:4 (1 часть гомогената и 3 части ацетатного буфера) и нагревают до 80°C на водяной бане в течение 20 минут. Центрифугируют 15 минут при 3000 g и отбирают надосадочную жидкость, в которой содержится токсин. Надосадочную жидкость в количестве 10 мкл вносят в 1 мл фосфатного буфера.

Определение концентрации ТТХ в образцах ведут методом иммуноферментного анализа (ИФА). Для этого используют тест-системы (Model №НЕ 12009), разработанные биотехнологической фирмой Huaan Magnech Bio-Tech Co., Ltd. (КНР). Определение концентрации проводят согласно следующей схеме: в каждую лунку планшета вносят 50 мкл исследуемого образца, 50 мкл фермента-коньюгата и 50 мкл антител против ТТХ. Планшеты инкубируют в течение 30 минут при комнатной температуре. После инкубации лунки промывают три раза раствором фосфатного буфера по 10-30 минут и вносят по 100 мкм субстрата, содержащего смесь свободных спор и эндоспор (в отношении 1:1). Планшеты инкубируют 30 минут при комнатной температуре, после чего реакцию останавливают блокирующим раствором, содержащим 2% серную кислоту. Количественную оценку производят на иммуноферментном ридере (Bio-Rad, США).

Выход ТТХ составляет 0,79 мг/л.

Процесс выращивания бацилл является циклическим: после наращивания бактериальной массы производят последующие пересевы на чистые среды.

Пример 2.

Берут подготовленный образец немертин Lineus alborostratus, предварительно обработанных, тщательно растирают до гомогенного состояния в стерильном ручном гомогенизаторе.

Выращивание общей бактериальной культуры из гомогената немертины выполняют аналогично примеру один, однако используют твердую среду Йошимицу-Кимура (среда Y-K) следующего состава: пептон - 5 г; дрожжевой экстракт - 2.5 г; глюкоза - 1 г; K₂HPO₄ - 0,2 г; MgSO₄*7H₂O - 0,1 г; агар - 12-15 г; вода дистиллированная - 500 мл; вода морская - 500 мл pH среды 7.8-8.0. Стерилизация при 1.1 атм - 25 минут.

Из общей бактериальной культуры выделяют разные штаммы бацилл, относящиеся к бактериям рода Bacillus, преимущественно используют смесь бактериальных штаммов Bacillus sp. KF444411, Bacillus sp. KF444412, Bacillus sp. KF444413, Bacillus sp. KF444414, Bacillus sp. KF444415, Bacillus sp. KF444416. Использование штаммов Bacillus для получения ТТХ, выращивание штамма на среде производили аналогично примеру 1.

Исследуемые штаммы бацилл сеют на твердую среду Y-K и культивируют при температуре +23°С в течение 6 суток для индуцирования спорообразования и наращивания высокой концентрации свободных спор. Определение свободных спор бацилл на содержание ТТХ и получение гомогената из спор производили аналогично примеру 1.

Подсчет концентрации ТТХ в гомогенате производили аналогично примеру 1. Выход ТТХ составляет 0,7 мг/л.

Пример 2а.

Осуществляют аналогично примеру 2. Однако для индуцирования спорообразования и наращивания высокой концентрации свободных спор штаммы бацилл культивируют в жидкой питательной среде, содержащей нуклеозид инозин в количестве 0.01 mM. Выход ТТХ составляет 0,65 мг/л.

Пример 3.

Берут подготовленный образец хобот немертины Hubrechtella juliae, предварительно обработанный, тщательно растирают до гомогенного состояния в стерильном ручном гомогенизаторе.

Выращивание общей бактериальной культуры из гомогената немертины выполняли аналогично примеру 1, однако в качестве твердой среды использовали Морской агар (МА 2216) (ZoBell, 1946). Состав: старая морская вода - 1000 мл, актопептон - 5 г, фосфат Fe - 0.1 г, бактоагар - 15 г, 120 °С, 20 мин, pH=7.5-7.6. Выделение разных штаммов бацилл производят аналогично примеру 1. Получают смесь бактерий, содержащую преимущественно штамм Bacillus sp. KF444412. Используют Bacillus sp. KF444412 для получения ТТХ, выращивание штамма на среде производят аналогично примеру 1.

Исследуемые штаммы бацилл сеют на среду Хорикоши I (жидкая среда) со сниженным содержанием глюкозы: глюкозы 1,0 г/л, петона 5,0 г/л, дрожжевого экстракта 5,0 г/л, KH₂PO₄ 1.0 г/л, MgSO₄*7H₂O 0.2 г/л; Na₂CO₃ 10.0 г/л; выращивают при +23°C. Низкое содержание глюкозы индуцирует спорообразование в колонии бацилл уже через 24 часа после посева. К 48 часам большая часть бактерий в культуре содержит эндоспоры.

Определение эндоспор бацилл на содержание ТТХ и получение гомогената из спор производят аналогично примеру 1.

Подсчет концентрации ТТХ в гомогенате производили аналогично примеру 1. Выход ТТХ составляет 0,79 мг/л.

Пример 3а.

Осуществляют аналогично примеру 3. Однако для индуцирования спорообразования и наращивания высокой концентрации свободных спор штаммы бацилл культивируют в мясопептонном бульоне (жидкая среда), содержащем лизат бактерий Bacillus sp. 1839 (KF444411- KF444413). Выход ТТХ составляет 0,6 мг/л.

Пример 3б.

Осуществляют аналогично примеру 3. Однако для индуцирования спорообразования и наращивания высокой концентрации свободных спор штаммы бацилл культивируют в жидкой питательной среде с последующим переносом в дистиллированную воду. Вегетативные клетки бактерий Bacillus sp. (KF444411-KF444413) переносят во флакон со 100 мл дистиллированной воды. Через 4 часа раствор центрифугируют 15 мин 200 g для мягкого осаждения клеточной культуры, надосадочную жидкость сливают, из осадка получают гомогенат спор аналогично примеру 1. Выход ТТХ составляет 0,67 мг/л.

Пример 4.

Продолжение биосинтеза ТТХ из оживленных, ранее замороженных бактерий.

Бактериальный штамм Bacillus sp. (KF444411-KF444413) сохраняли в криопробирках при - 85°C на морской воде с добавлением 30% глицерина, 1% пептона (Difco) и MgSO₄(3-5 g/l).

Берут 0,01 г замороженного вышеуказанного бактериального штамма, размораживают, согревая при 4-8°C, и затем порцию бактерий переносят на чашку Петри, содержащую свежую питательную среду следующего состава: питательная споруляционная среда (NSM), содержащая 0.5% пептона, 0.3% говяжьей пасты, 0.7 mmol CaCl₂, 0.05 mmol MnCl₂, 1.0 mmol MgCl₂. Бактерии культивируют при комнатной температуре при 20-24°C в течение 24-48 часов. После определения бактериальной активности определяют способность бактерий продуцировать ТТХ (согласно методу, описанному в примере 1), часть бактерий переносится на Морской агар (твердая питательная среда). Для ускорения наступления сроков спорообразования культуру бактерий дополнительно подвергают кратковременному термальному шоку. Термальный шок вызывают помещением бактериальных штаммов в термостат +50°C и выдерживают в течение 120 минут. Через 6 часов более 70% бактерий формируют споры. Споры бацилл смывают фосфатным буфером, мягко осаждают на центрифуге (minispin, Eppendorf) при 3000 об/мин в течение 10 минут. Процедура повторяется для постоянного получения ТТХ.

Получение гомогената из спор и подсчет концентрации ТТХ в гомогенате производят аналогично примеру 1. Выход ТТХ составляет 0,63 мг/л.

Пример 5.

Берут подготовленный образец немертин Quasitetrastemma stimpsoni, предварительно обработанных, тщательно растирают до гомогенного состояния в стерильном ручном гомогенизаторе.

Выращивание общей бактериальной культуры из гомогената немертины выполняют аналогично примеру 1, однако используют среду Йошимицу-Кимура следующего состава: пептон - 5 г; дрожжевой экстракт - 2,5 г; глюкоза - 1 г; K₂HPO₄ - 0,2 г; MgSO₄*7H₂O - 0,1 г; агар 12 г; вода дистиллированная - 500 мл; вода морская - 500 мл (твердая среда), pH среды 7.8-8.0. Стерилизация при 1,1 атм. - 25 минут.

После выделения разных штаммов бацилл преимущественно используют бактериальные штаммы Bacillus sp. 1839/1 (KF444414 - KF444416). Использование штаммов Bacillus для получения ТТХ, выращивание штамма на среде производили аналогично примеру 1.

Определение спор бацилл на содержание ТТХ и получение гомогената из спор производили аналогично примеру 1.

Исследуемые штаммы бацилл сеют на жидкую среду Йошимицу-Кимура пептон - 5 г; дрожжевой экстракт - 2,5 г; глюкоза - 1 г; K₂HPO₄ - 0,2 г; MgSO₄*7H₂O - 0,1 г; вода дистиллированная - 500 мл; вода морская - 500 мл, pH среды 7,8-8,0 и культивируют при температуре +23°C в течение суток. Для индуцирования спорообразования и наращивания высокой концентрации спор в среду добавляют 0.05 mM MnCl₂.

Подсчет концентрации ТТХ в гомогенате производили согласно методике, описанной в примере 1. Выход ТТХ составил 0,6 мг/л культуральной среды после 7 дней культивирования.

Пример 6.

Берут подготовленный образец печени рыбы фугу Takifugu rubriceps, для этого свежевыловленную живую рыбу трижды промывают стерильной морской водой, затем в асептических условиях осторожно разрезают и выделяют печень, тщательно растирают до гомогенного состояния в стерильном ручном гомогенизаторе.

Затем отбирают 0.1 мл гомогената, переносят в стерильную пробирку и доводят до 1 мл стерильным физиологическим раствором NaCl (ФР), тщательно перемешивают и наносят на питательную среду. В качестве питательной среды берут твердую питательную среду Морской агар (МА 2216) (ZoBell, 1946). Используя световой микроскоп, определяют разные типы колоний и с каждого типа колонии делают скол (берут образец). Полученный образец растворяют в 100 мкл ФР и наносят на новую среду. Процесс повторяют еще 2 раза, до получения на чашках чистых, одинаковых по морфологии колоний, определяют принадлежность колонии к роду. Чистоту колоний определяют, используя окрашивание по Граму, тесты на подвижность, цитохромоксидазу, утилизацию источников углерода, образование кислых продуктов из углеводов, устойчивость к антибиотикам, потребность в ионах Na⁺, рост при различных температурах, значениях pH и солености среды (Beleneva I.A., Kukhlevsky A.D., Kharchenko U.V. Antimicrobial activity of heterotrophic bacterial strains of marine origin // Jundishapur Journal of Microbiology. 2013. V. 6, no. 2. P. 166-175). Проведенные цитологические и биохимические анализы каждого изолята позволяют идентифицировать бактерии до рода. Для дальнейшей работы берут только грамположительные изоляты из рода Bacillus.

Каждый исследуемый штамм бацилл сеют на твердую среду Йошимицу-Кимура. Иммунофлуорисцентными методами выявляли те штаммы бацилл, споры которых способны накапливать ТТХ. Определение спор бацилл на содержание ТТХ производили аналогично примеру 1.

Исследуемые штаммы бацилл, продуцирующие тетродотоксин, сеют на жидкую среду Йошимицу-Кимура и культивируют до наращивания биомассы. В качестве индуктора спорообразования используют дистиллированную воду (Powell, J.F., Hunter, J.R. Sporulation in distilled water / J.F. Powell, J.R. Hunter // J Gen Physiol. - 1953 - Vol. 36, №5. - P. 601-606). Для этого клетки мягко осаждали на центрифуге (minispin, Eppendorf) при 1500 об/мин в течение 5 минут. Надосадочную жидкость сливали, а к осадку добавляли по 1000 мкл исследуемого раствора. Содержимое пробирки тщательно пипетировали, а затем культивировали в течение 24 часов. Полученные споры бацилл смывают фосфатным буфером, мягко осаждают на центрифуге (minispin, Eppendorf) при 3000 об/мин в течение 10 минут. Получение гомогената из спор производили аналогично примеру 1.

Подсчет концентрации ТТХ в гомогенате производили согласно методике, описанной в примере 1. Выход ТТХ составляет 0,72 мг/л.

Пример 7.

Берут подготовленный образец печени рыбы фугу Takifugu chinensis, для этого свежевыловленную живую рыбу трижды промывают стерильной морской водой, затем в асептических условиях осторожно разрезают и выделяют печень, тщательно растирают до гомогенного состояния в стерильном ручном гомогенизаторе.

Исследуемые штаммы бацилл, продуцирующие тетродотоксин, сеют на твердую среду Y-K и культивируют при температуре +23°C в течение 2 суток для индуцирования спорообразования и наращивания высокой концентрации свободных спор.

Остальное делали как в примере 6. Выход ТТХ составляет 0,5 мг/л.

Пример 8.

Берут мягкие ткани моллюска Babylonia sp., промывают стерильной морской водой, затем тщательно растирают до гомогенного состояния в стерильном ручном гомогенизаторе.

Затем отбирают 0.1 мл гомогената, переносят в стерильную пробирку и доводят до 1 мл стерильным физиологическим раствором NaCl (ФР), тщательно перемешивают и наносят на питательную среду. В качестве питательной среды берут твердую питательную среду Морской агар (МА 2216) (ZoBell, 1946). Используя световой микроскоп, определяют разные типы колоний и с каждого типа колонии делают скол (берут образец). Полученный образец растворяют в 100 мкл ФР и наносят на новую среду. Процесс повторяют еще 2 раза, до получения на чашках чистых, одинаковых по морфологии колоний, определяют принадлежность колонии к роду. Чистоту колоний определяют, используя окрашивание по Граму, тесты на подвижность, цитохромоксидазу, утилизацию источников углерода, образование кислых продуктов из углеводов, устойчивость к антибиотикам, потребность в ионах Na⁺, рост при различных температурах, значениях pH и солености среды (Beleneva I.A., Kukhlevsky A.D., Kharchenko U.V. Antimicrobial activity of heterotrophic bacterial strains of marine origin // Jundishapur Journal of Microbiology. 2013. V. 6, no. 2. P. 166-175). Проведенные цитологические и биохимические анализы каждого изолята позволяют идентифицировать бактерии до рода. Для дальнейшей работы берут только грамположительные изоляты из рода Bacillus.

Каждый исследуемый штамм бацилл сеют на твердую среду Йошимицу-Кимура. Иммунофлуорисцентными методами выявляли те штаммы бацилл, споры которых способны накапливать ТТХ. Определение спор бацилл на содержание ТТХ производили аналогично примеру 1.

Исследуемые штаммы бацилл, продуцирующие тетродотоксин, сеют на жидкую среду Йошимицу-Кимура и культивируют до наращивания биомассы. Для ускорения наступления сроков спорообразования культуру бактерий дополнительно подвергают кратковременному термальному шоку. Термальный шок вызывают помещением бактериальных штаммов в термостат +95°C и выдерживают в течение 15 минут. Получение гомогената из спор производили аналогично примеру 1.

Подсчет концентрации ТТХ в гомогенате производили согласно методике, описанной в примере 1. Выход ТТХ составляет 0,65 мг/л.

Приведенные примеры подтверждают, что заявленный способ позволяет получить ТТХ в количестве, превышающем выход по прототипу: от 0,5 мг/л (см. пример 7) до 0,79 мг/л (см. пример 3, 1). При этом заявленный способ достаточно прост, поскольку концентрирование ТТХ идет в спорах (см. фиг. 2А) и в эндоспорах (см. фиг. 2В); выход токсина в окружающую среду не происходит, а значит, дополнительной очистки токсина от питательной среды не требуется. Значительное увеличение ТТХ обеспечивается в условиях, способствующих образованию спор (см. Фиг. 3С и фиг. 3D). В качестве условий, стимулирующих спорообразование могут использоваться среды-стимуляторы спорообразования (см. пример 3), термический шок (см. пример 1, 4, 8), длительное культивирование (см. пример 2, см. Фиг. 3), «спорулирующие» соли (см. пример 4, 5), или нуклеозиды (см. пример 2а), или бактериальные лизаты (см. пример 3а), или перенос бактерий в дистиллированную воду (см. пример 3б). Таким образом, условия, способствующие спорообразованию, достаточно широки.

Следует отметить, что в заявленном способе впервые предложено использовать споры бактерий из рода Bacillus, благодаря чему удалось повысить степень накопления ТТХ на единицу субстрата, и значительно упростить и удешевить способ получения ТТХ.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам получения тетродотоксина(ТТХ). Способ получения тетродотоксина предусматривает выделение тетродоксинсодержащих бактерий из ТТХ-содержащих носителей и помещение их на питательную среду для культивирования и выделения тетродотоксина из субстрата. В качестве тетродоксинсодержащих бактерий используют бактерии рода Bacillus, культивирование которых ведут до стадии спороношения в условиях, индуцирующих спорообразование. Индуцировать спорообразование для повышения выхода ТТХ можно, в частности, использованием среды стимулятора спорообразования, термическим шоком, длительным культивированием, внесением спорулирующей соли, нуклеозидов, бактериальных лизатов, переносом бактерий в дистиллированную воду. При этом перед выделением ТТХ из субстрата следует выделять спороносящие чистые штаммы бактерий из рода Bacillus, каждый из которых для культивирования тетродотоксина помещают на отдельную питательную среду. Изобретение позволяет повысить выход тетродотоксина и упростить способ его получения. 5 з.п. ф-лы, 3 ил., 8 пр.

1. Способ получения тетродотоксина (ТТХ), включающий подготовку образцов тетродотоксин-несущих животных, гомогенизацию тканей образцов тетродотоксин-несущих животных, тщательное перемешивание с растворителем, помещение на твердую питательную среду и выращивание до получения одинаковых по морфологии колоний бактерий, перенос каждой отдельной колонии рода Bacillus на питательную среду с последующим их культивированием, экстрагирование тетродотоксина, отличающийся тем, что после получения одинаковых по морфологии колоний бактерий проводят отбор грамположительных штаммов рода Bacillus, способных накапливать ТТХ, переносят их на твердую или жидкую питательную среду, а последующее культивирование отобранных штаммов рода Bacillus ведут до стадии спороношения в условиях, индуцирующих спорообразование, затем из полученных эндоспор и/или свободных спор экстрагируют тетродотоксин.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для создания условий, индуцирующих спорообразование на жидкой питательной среде, используют среду-стимулятор спорообразования, содержащую минимальное количество моно- и дисахаридов.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для создания условий, индуцирующих спорообразование на твердой или жидкой питательной среде, используют термический шок путем выдерживания бактерий в течение 15-120 мин при температуре 50-95°C.

4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что термический шок проводят путем выдерживания бактерий в течение 30 мин при температуре 80°C.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для создания условий, индуцирующих спорообразование на твердой питательной среде, используют длительное культивирование, не менее 2 суток.

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для создания условий, индуцирующих спорообразование на жидкой питательной среде, в нее дополнительно вносят спорулирующую соль, или нуклеозиды, или бактериальные лизаты, или осуществляют перенос бактерий в дистиллированную воду.