СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОДУКТА Российский патент 1996 года по МПК A61K31/70 A61K31/79 

Изобретение относится к химии биологически активных высокомолекулярных соединений, точнее к продукту, основной частью которого является комплекс D-сахаролактонов с водорастворимым полиэлектролитом.

Продукт, полученный заявленным способом, обладает ингибирующей активностью по отношению к β-глюкуронидазе, способствующей образованию и развитию злокачественных опухолей мочевого пузыря и прямой кишки.

Продукт может представлять основу для создания эффективного лекарственного средства, используемого для профилактики опухолей мочевого пузыря (первичной) в группах повышенного онкологического риска у работников анилино-красочного, резинового и ряда других производств химической промышленности. Продукт может быть также использован для предупреждения рецидивов опухолей мочевого пузыря у больных после хирургического удаления основного узла опухоли (вторичная профилактика).

Используемые в настоящем описании термины и их разъяснения:
1,4-лактон-D-сахарной кислоты (1,4-лактон-D-глюкаровой кислоты) общей формулы
мтокгm
3,6-лактон-D-сахарной кислоты форму- лы

2,5-ди-О-ацетил-1,4: 3,6-β-D-глюкародил- актон (-1,4:3,6-дилактон-D-сахарной кислоты) формулы
дСША
Известен способ получения продукта, представляющего композицию, основной частью которой является комплекс D-сахаролактона с водорастворимым полиэлектролитом.

В соответствии с известным способом водный раствор с концентрацией 1,7.5 мас. на основе поли-N-винилпирролидона, поливинилового спирта, полиглюкина или метил-целлюлозы в 0,1 М фосфатном буфере с ионной силой 0,3 и рН 4,53. 6,81 смешивали с 10%-ным водным раствором кристаллического 1,4-лактона-D-сахарной кислоты при соотношении лактон: полимер1.2:1. Реакционную смесь перемешивали в течение 24 ч при 20^оС, продукт реакции выделяли лиофильной сушкой. Степень связывания 1,4-лактона полимером определяли методом равновесного диализа и хроматографией. Для различных полимеров с ММ 10·10³.50·10³ степень связывания равна 70.98%
Известен также способ получения продукта, представляющего композицию, основной частью которой является комплекс D-сахаролактона с водорастворимым полимером-полиэлектролитом. В соответствии с известным способом 16%-ный раствор сополимера N-винилпирролидона (ВП) с виниламином (ВА), содержащий 10.20 мол. NH₂-групп с ММ 30·10³.65·10³ в 0,1М фосфатном буфере с рН 6,8.7,0 и ионной силой 0,3.1,0 смешивали с 30%-ным раствором 1,4-лактона-D-сахарной кислоты. При этом массовое соотношение 1,4-лактон:сополимер 2:1. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре 24 ч, продукт выделяли лиофильной сушкой. Количество связанного лактона 60.94% В описании указано, что продукт, полученный этим способом, сохраняет способность ингибировать β-глюкуронидазу in vitro.

Известный способ не содержит каких-либо данных, позволяющих с очевидностью утверждать о возможности использования полученного продукта в качестве лекарственного средства. Кроме того, известный способ основан на использовании только индивидуального 1,4-лактона-D-сахарной кислоты, поскольку ранее была опубликована информация об очень малой способности 3,6-лактона-D-сахарной кислоты ингибировать β-глюкуронидазу.

Задачей изобретения является создание продукта, эффективного в качестве средства профилактики опухолей мочевого пузыря.

Задача решалась способом получения продукта, представляющего собой композицию, основной частью которой является комплекс D-сахаролактона с водорастворимым полиэлектролитом, обладающую ингибирующей способностью по отношению к β-глюкуронидазе.

Заявляемый способ реализуется совокупностью следующих существенных признаков: 12.16%-ный раствор полиэлектролита сополимера ВП с мономером из ряда, содержащего ВА и аллиламин (АА) и имеющего 80.90 мол. звеньев ВП и 10.20 мол. звеньев ВА и АА со среднечисленной ММ 30·10³.100·10³ в 0,1.0,3 М фосфатном буфере с рН 4-7 при ионной силе 0,3.1,0, смешивают с 25.35%-ным водным раствором смеси 1,4- и 3,6-лактона-D-сахарной кислоты при их соотношении в смеси в мас. 30.80:20.70; соотношение в мас.ч. лактоны:полимер 3.6:1; реакционную смесь выдерживают при перемешивании в течение 24 ч при комнатной температуре; целевой продукт выделяют лиофильной сушкой или распылительной сушкой.

Отличительными от прототипа признаками являются 1 и 2 из перечисленных признаков способа. Это отличие основано на качественных характеристиках используемых лактонов D-сахарной кислоты, поскольку для получения комплекса берут не кристаллический, не индивидуальный кристаллический 1,4-лактон, а смесь 1,4- и 3,6-лактонов.

Отличие также основано на количественных характеристиках, поскольку в смеси 1,4- и 3,6-лактонов их соотношение в мас. изменяется в пределах 30.80: 20.70.

Кроме того, в заявленном способе отношение в мас.ч. лактон:сополимер 3. 6:1, в способе-прототипе то же соотношение равно 2:1.

Таким образом, анализ известного уровня подтверждает соответствие заявленного способа требованиям "новизны" и "изобретательский уровень", поскольку решение основано на противоречии между хорошо известным низким уровнем биологической активности 3,6-лактона D-сахарной кислоты и впервые продемонстрированным авторами изобретения факте отсутствия статистически достоверной зависимости между количественным содержанием в смеси 1,4- и 3,6-лактонов D-сахарной кислоты и биологической активностью целевого продукта in vivo в широком интервале состава смеси лактонов.

Информация о практическом отсутствии ингибирующей β-глюкуронидазу активности заставляла существенно усложнять технологию разделения из смеси D-сахаролактонов отдельные изомеры с целью получения индивидуальных продуктов.

Анализ известного уровня техники и науки позволили обнаружить 1,4-лактон-D-сахарной кислоты в качестве перорального препарата для первичной профилактики опухолей мочевого пузыря.

Однако известное средство не позволило создать лекарственный препарат на основе 1,4-лактона, поскольку лактон выводится из организма в течение 4-5 ч. Для профилактики опухолей мочевого пузыря требовались значительные количества 1,4-лактона-D-сахарной кислоты до 10 г/сут. на 1 животное массой 5-8 кг.

Известна попытка использования 2,5-ди-0-ацетил-1,4:3,6-β-D-глюкародилактона в качестве перорального средства для профилактики опухолей мочевого пузыря, т.н.препарат SLA.

Однако все недостатки 1,4-лактона-D-сахарной кислоты оказались присущими диацетату дилактона:продолжительность действия не превышала 4-5 ч, при этом более, чем в 10 раз возросла стоимость препарата. Таким образом, анализ показывает, что заявленный способ является, во-первых, новым. Во-вторых, способ соответствует требованию "изобретательский уровень" (неочевидности). Количественное содержание 1,4- и 3,6-лактонов D-сахарной кислоты в их смеси определяли путем избирательной экстракции и методом тонкослойной хроматографии и гельпроникающей хроматографии.

Для лучшего понимания сущности изобретения, а также для подтверждения соответствия его требованию "промышленная применимость" приводим примеры конкретной реализации.

П р и м е р 3. 1 г сополимера ВП с виниламином ВА, содержащего 80 мол. звеньев ВП и 20 мол. звеньев ВА, со среднечисленной ММ 100·10³ растворяют в 5 мл 0,1 М фосфатного буфера с рН 6,80 при ионной силе 0,3. К раствору добавляют 4 г смеси 1,4- (30 мас.) и 3,6- (70 мас.) лактонов-D- сахарной кислоты, растворенной в 10 мл того же буфера. Смесь выдерживают при комнатной температуре при перемешивании 24 ч. Продукт выделяют лиофильной сушкой. Выход 4,80 г (96%). Количества связанных и свободных лактонов определяют методами гельфильтрации и равновесного диализа.

П р и м е р 7. 1 г сополимера, содержащего 85 мол. ВП и 15 мол. АА, со среднечисленной ММ 80·10³ растворяют в 18,18 мл 0,1М фосфатного буфера с рН 6,80 при ионной силе 0,3. К раствору добавляют 4 г смеси 1,4- (80 мас.) и 3,6- (20 мас.) лактонов D-сахарной кислоты, растворенной в 23,56 мл того же буфера. Смеси выдерживают и выделяют в условиях примера 3. Выход 5,94 г (98% ).

П р и м е р ы 1-17 выполнены в условиях примера 3. Все данные представлены в таблицах 1.8.

Биологическая активность продукта характеризовалась способностью ингибировать фермент мочевую β-глюкуронидазу. Метод Фишмана (6) основан на выделении фенолфталеина из субстрата, включающего комплекс фенолфталеина с β-D-глюкуронидом, под действием фермента β-глюкуронидазы из мочи крыс. Количество оставшегося неингибированного фермента определяют в условных единицах Фишмана по градуировочной кривой. Определение эффективности проводили, определяя количество выделившегося фенолфталеина по его оптической плотности при длине волны 540 нм (рН 10,2.10,4).

Выбор состава полиэлектролита обосновывается определением величины максимально переносимой концентрации (МПК) в зависимости от содержания звеньев ВП и ВА (АА). Раствор полиэлектролита вводят животным внутрибpюшинно. Все данные сведены в табл. 2.

Полученные характеристики позволили выбрать заявленный интервал содержания звеньев ВП и ВА (АА) в полиэлектролите с достаточно высоким значением МПК, что обеспечивает нетоксичность полиэлектролита при его пероральном введении.

В заявленном интервале содержания звеньев ВП и ВА (АА) константа связывания D-сахаролактонов полиэлектролитом (К_св) оптимальна с максимумом при 20% (мол.) содержании ВА (АА). Все данные о К_св представлены в табл.3.

Зависимость состава смеси 1,4- и 3,6-лактонов D-сахарной кислоты, вводимой в реакцию взаимодействия с полиэлектролитом и биологической активностью получаемого продукта in vivo отражены в табл. 4.

Изучена зависимость биологической активности и времени пролонгированного действия целевого продукта от соотношения в нем лактонов: полиэлектролита (мас.ч.); (получение продукта ведут в условиях примера 3) (см.табл.5).

Продукт при хранении в холодильнике (0-4^оС) практически сохранял эффективность и продолжительность ингибирования β-глюкуронидазы (in vivo, 6 крыс) в течение 5,5-24 месяцев.

Было также показано, что увеличение времени взаимодействия смеси лактонов с полиэлектролитом увеличивает количество связанных комплексом лактонов. Данные представлены в табл.6 (эксперимент вели в условиях примера 3).

Было подтверждено, что in vitro эффективность ингибирования β-глюкуронидазы 1,4-лактона существенно выше, чем 3,6-лактона.

Изучение зависимости состава смеси лактонов D-сахарной кислоты, из которой получен продукт, и времени пролонгированного действия отражены в табл. 8 (исследование проводят на группах крыс, включающих 6 животных. Доза в расчете на 40 мг лактонов. Продукт получают в условиях примера 3).

Материалы заявки подтверждают, что заявленный способ позволяет получить продукт, характеризуемый пролонгированным действием и эффективным при существенно более низких дозах активного начала. Эксперименты на животных показали, что продукт, получаемый по заявленному способу эффективен в дозе 1,2-2,5 г активного начала на 1 кг живой массы в неделю, в то же время известный препарат SLA эффективен в дозах, достигающих 14 г активного начала на 1 кг живой массы в неделю при стоимости, большей на порядок.

Изобретение относится к химии биологически активных высокомолекулярных соединений и может найти применение в фармацевтике и медицине. Изобретением решается задача получения лекарственного средства для профилактики опухолей мочевого пузыря. Целевой продукт получают путем взаимодействия в водном фосфатном буферном растворе Д-сахаролактона с полиэлектролитом при последующем выдерживании реакционной смеси и выделении продукта. Способ отличается тем, что взаимодействие полиэлектролита ведут со смесью 1,4- и 3,6-лактонов Д-сахарной кислоты при их соотношении в смеси в мас.% 30 ^oC 80; 20 ^oC 70 соответственно, при этом соотношение (в мас. ч.)лактоны: полиэлектролит = 3...6 : 1. 3 з. п. ф-лы, 8 табл.

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОДУКТА на основе лактона D-сахарной кислоты, отличающийся тем, что проводят взаимодействие 12 16%-ного водного раствора полиэлектролита сополимера N-винилпирролидона с непредельным мономером, содержащим аминогруппу, с 25 35%-ным водным раствором смеси 1,4- и 3,6-лактона-D-сахарной кислоты при их соотношении в смеси 30 80 и 20 70 мас. соответственно, при этом соотношение лактоны полиэлектролит составляет 3 6 1 мас.ч. взаимодействие ведут в водном фосфатном буферном растворе с pH 4,0 7,0 путем смешения компонентов, выдерживания конечного раствора и выделения целевого продукта. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве полиэлектролита используют сополимер N-винилпирролидона с мономером из ряда, содержащего виниламин и аллиламин, имеющего 80 90 мол. звеньев винилпирролидона и 10 - 20 мол. второго мономера, среднечисленная молекулярная масса полиэлектролита (30 100) • 10³. 3. Способ по пп.1 и 2, отличающийся тем, что выдерживание конечного раствора проводят в течение 8 36 ч. 4. Способ по пп. 1 3, отличающийся тем, что целевой продукт выделяют лиофильной или распылительной сушкой.